Cytologie a morfologie bakterií Sylabus přednášek • Struktury buňky – esenciální a obvyklé • Proměnlivost struktur buňky – patogeni; adherující buňky; buněčný stres • Vybrané struktury b. (exo a endotoxiny, inkluze...) •Mikroskopické techniky • Životní cykly bakterií – binární dělení; střídání stádií; komplexní buněčné cykly... 26.9.2014 1 Struktury prokaryotické buňky •Základní - esenciální •Obvyklé •– nejsou nutné •k přežití buňky, •poskytují výhodu 26.9.2014 2 http://textbookofbacteriology.net/Vaikebact.jpeg Základní struktury •Cytoplazmatická membrána •Nukleoid •Ribozómy • Rozvinutý nukleoid E.coli 26.9.2014 3 Obvyklé struktury •Buněčná stěna •Organely pohybu •Fimbrie •Plazmidy •Kapsuly, slizy •Inkluze PHB Síra Beggiatoa. Parasporální inlkuze B. thuringiensis karboxyzómy E.coli - fimbrie Streptococcus pneumoniae replikony E.coli - bičíky 26.9.2014 4 Cytoplazmatická membrána •Fluidní vrstva fosfolipidů • (jednoduchý řetězec, esterová vazba) • Archea – etherová v. !! •Vnořené bílkoviny – mnoho proti Eucarya •Semipermeabilní – transport • G- buňky cytoplazmatická membrána + vnější membrána!! http://chemtips.files.wordpress.com/2012/10/bacterial-membranes.jpg G+ G- G- buňky Lipid A (toxin) 26.9.2014 5 Fosfolipid •1) Fosfátová skupina vázaná na glycerol •2) 2 mastné kys.vázané na glycerol – 16-18C • - nevětvené, nasycené – snižují fluiditu • nenasycené – zvyšují •Hydrofobní složka - nepolární •Negativní náboj • Závislost fluidity na teplotě 26.9.2014 6 •Lipidy – složení do urč.míry podle výživy a typu prostředí • •Proteiny • – integrální - hydrofobní vazby, cca 70% • periferní – elstat.síly, H-můstky • •Lipoproteiny – lipid do periplazmy • •Glykoproteiny a glykolipidy – orientovány cukernou složkou vně membrány • •Lipopolysacharidy G- - Ag • •Hopanoidy – lipidy u 50% bakt. • - obdoba euk. sterolů Syntéza CM - inzercí 26.9.2014 7 •Bílkoviny pevně vázané – enzymy • (ATPáza, nukleáza, fosfatázy), transportéry, strukturální. •Volné bílkoviny – fosfatázy • •Inducibilní složky membrány existují, dokud existuje spouštěcí faktor syntézy • = bílkovinné spektrum proměnlivé • •Pozn: Membránou obdány i některé typy inkluzí (glykogen, PHB, S, plyn. vakuoly, karboxyzomy) – 1 vrstevná, nebiologická!! 26.9.2014 8 • G+ vs. G- !! 26.9.2014 9 Funkce cytoplazmatické membrány •Bariéra; receptory; antigeny • •Transport – schopnost akumulace • •Tvorba a transformace energie •– elektrontransportní systém • • Enzymy: vektorový metabolismus • je místem syntéz •Sídlo replikátoru 26.9.2014 10 •Permeabilita membrány • •poměrně volně prostupují malé, nenabité nebo hydrofobní molekuly (O2, CO2, NH3 – ne NH4) a voda • •ostatní – specifické mechanismy •Př: •Msc channels – mechanosensitivní – reagují na zvýšení turgoru buňky zvětšením velikosti póru – adaptace na osmotický stres - MscL – E. coli •MIP channel (major intrinsic protein) • Aqp – aquaporiny – voda a nenabité látky, 1 protein, u někt. bakterií, E. coli - AqpZ • Glp – transport glycerolu • Náboj CM a b.s. je odlišný ale proměnlivý v čase 26.9.2014 11 Prostá difúze Malé nenabité ionty se pohybují po spádu koncentračního gradientu usnadněnou difúzí Většina roztoků může procházet membránou pouze membránovým transportem zprostředkovaným proteiny. Pasivní transport po směru koncentračního gradientu. Aktivní transport je umožněn přenašeči a to proti koncentračnímu gradientu, je vyžadována energie Dění na membránách 26.9.2014 12 1) Nespecifická permeace - není potřeba proteinových nosičů - závisí přímoúměrně na koncentračním spádu •průnik lipidickou částí •prochází tak LIPOFILNÍ látky, které se v membráně rozpustí •malinko a s malou rychlostí propustná i pro nabité látky (nepravidelnosti ve struktuře otevírají kanálky) • 26.9.2014 13 2) Průchod IONOFORY • nezávisí nebo závisí na koncentraci • I. Kanály • II. Proteinové nosiče 26.9.2014 14 Kanály •váží na sebe iont a transportují jej přes membránu •nezávisí na koncentraci •společnou vlastností je • rozpustnost iontových • komplexů v nepolárních • rozpouštědlech • •A) prosté •B) hradlové • figure 10-01 26.9.2014 15 A) KANÁLY prosté •stále otevřené válcové struktury s centrálním vodním kanálem •neregulovány, selektivita až na CM •př: poriny β vnější membrány • - maltoporin umožňující difúzi maltodextrinů • figure 10-06 Maltoporin v komplexu s maltodextrinem (6 Glu jednotek). figure 10-05a Dimer Gramicidinu A tvoří kanálek pro transport Iontu K+ 26.9.2014 16 • B) KANÁLY hradlové mají specifitu!! 26.9.2014 17 B) KANÁLY hradlové •otevřenost je regulována •mají specifitu – pomocí vazebných míst rozpoznávají ionty •část polypeptidického řetězce = uzavíratelé hradlo •hradlo regulováno: • - napětím • - chemicky • - mechanicky •specifické iontové kanály slouží pro rychlý průchod iontů jako Na+, K+ a Cl- •Př: K+ pasivně difundují z cytoplasmy do extracelulárního prostoru přes transmembránové proteiny • - tetramery řízené el. polem • 26.9.2014 18 Proteinové nosiče, přenašeče •průchod závisí na koncentraci •konformační změna přenašeče malá • • - následuje návrat do původní konformace figure 10-17 Model transportu glukosy 26.9.2014 19 •a) pasivní = zprostředkovaná difúze – netřeba energie, nevede k zakoncentrování přenášené látky • •b) aktivní – vede ke kumulaci látky, transport proti koncentračnímu spádu za spotřeby ATP • I) primární – zdroj energie nesouvisí s dalším průběhem přenosu • •ATPázy – přenáší ionty; fosforylovaný enzym = meziprodukt při hydrolýze • Proteinové nosiče, přenašeče unnumbered figure pg 304 ☺ Fosforylace probíhá na zbytku kys. asparagové L Inhibováno vanadičitanem – zapojuje se namísto P 26.9.2014 20 Příklady primárních aktivních nosičů •ABC transportéry – motivy vážící ATP a štěpící jej při příjmu látky; u bakterií stovky typů pro transport živin, vitamínů • Př: (E. coli tak přijímá vit. B12 z prostředí), export toxinů • •F0 F1 ATPáza – • F0 dává enzymu citlivost, kruh z 12ti C kanálem pro H+ • F1 katalytická fce střídajících se podjednotek α a β • - syntéza nebo hydrolýza ATP • - hydrolyzuje ATP i po izolaci z membrány – - u E. coli je z osmi podjednotek – (3x α, 3x β, γ, δ) – kódováno operonem unc – - Mitchellova chemiosmotická – teorie • 26.9.2014 21 •II) sekundární • – proces spojen se změnou koncentrace na membráně • - volná E využita pro transport neutrálních molekul proti • koncentračnímu spádu • uniport – jednosměrný pohyb poháněný elektrickou složkou gradientu • symport – energii dodá současně přenášená látka • antiport • •Na+K ATPáza – symport Na+ a Glu, zároveň antiport Na+ a K+ •3 Na+ (in) + 2 K+ (out) + ATP + H2O « 3 Na+ (out) + 2 K+ (in ) + ADP + Pi • 26.9.2014 22 3) skupinová translokace •méně častá •při transportu substrát chemicky modifikován •př: fosfotransferázový systém • – fosforylace substrátu; akumulace PEP • (přináší do buňky cukry proti koncentračnímu spádu) • transport purinových bází • - enzymy + substrát (jedna strana membrány) • enzym + produkt (druhá strana membrány) • = vektorový charakter - energie nutná pro reakci = energie vznikající reakcí • 26.9.2014 23 4) transport s lokální přestavbou membrány •přes membránu transportovány i velké molekuly •přestavbou membrány vzniká váček •málo časté, neprostudované •př: transport NK • 26.9.2014 24 Deriváty membrány Chromatofory fototrofů •Chromatofory purpurových sirných bakterií •Cylindrické vezikuly zelených bakterií a vícevrstevné tylakoidy Cyanobacteria (sinic) – místo fotosyntézy Mezozomy •Vážou chromozomy, duplikují se dělením •Deriváty CM, viditelné po lehkém obarvení CM •Počet závisí na metabolické aktivitě •Sídla enzymů membrány – DNA polymeráza na 1-4 místech VM http://classes.midlandstech.edu/carterp/Courses/bio225/chap04/04-15_Chromatophores_1.jpg http://home.earthlink.net/~dayvdanls/Bfission1.GIF http://periogen.com/images/bacterium.gif 26.9.2014 25 Buněčná stěna •Peptidoglykan •Glykan – cukerná složka, NAG, NAM • N-acetylglukózamin+N-acetylmuramová k., • ß-1,4-glykosidická vazba – kostra = opakování aminocukrů •Peptid – tetrapeptid – L-ala – D-glu – R – D-ala • •R = DAP – pouze v b.s., taxonomický znak u aktinobakterií, LL DAP, meso DAP •G+ :R = lysin větš., tetrapeptidy spojeny pentapeptidem •G- :vždy DAP a meso-DAP, tetrapeptidy spojeny přímo D-ala na DAP 26.9.2014 26 Peptidoglykan = uniformní disacharid N-acetylglukózamin + N-acetylmuramová Stěna spory: jiné a unikátní složení peptidoglykanu! Acidorezistentní mykobakteria, nokardie.. nebarvitelné Gramem: N-glykolylmuramová Vztah mezi tvarem buňky a počtem disacharidových jednotek v peptidoglykanu (10 - 65) Tetrapeptid L- a D-AMK Spojení: rozdíl v pozici 3 Inter- pepti- dový můstek u G+ Micrococcaceae – až druhově charakteristická struktura můstku Streptomycety: 3 pozice unikátní L-amino DAP kyselina CHEMOTAXONOMIE: Aminkokyselinové složení tetrapeptidu a můstku!! 26.9.2014 27 Peptidoglykan G- •G+ G+ : tetrapeptidy spojeny pentapeptidem G- :tetrapeptidy spojeny přímo D-ala na DAP 26.9.2014 28 •Lysozym – štěpí vazbu mezi aminocukry; • = působí na hotovou stěnu •Penicilin – brání spojení tetrapeptidů • = působí při syntéze stěny •Bacitracin - cyklický polypeptid blokující defosforylaci fosfolipidu, potřebného pro transportní funkci během výstavby buněčné stěny. Polymer Spojení tetrapeptidů různé u G+ a G- 26.9.2014 29 Taxonomický význam •Barvení buněčné stěny •Chemotaxonomie složek stěny a membrány •FAME profil mastných kyselin – char.pro jednotlivé rody, druhy až kmeny, závislý na kultivaci • - celobuněčný, ale hlavně z CM 26.9.2014 30 Archea – extrémní podmínky: •CM •PEPTIDOGLYKAN • 5 typů buněčné stěny Bacteria vs. Archaea !! strukturní shody ale rozdílné chemické složení •---- rozdílná citlivost na ATB • tRNA archeí podobná eukaryotické 26.9.2014 31 Archaean diagram ANd9GcRuprOJEiygmfTZyFqKC6hn9hOwnM0HzxztRoALuk6LqeBBpKIZSw phospholipid diagram Cytoplazmatická membrána archeí Sulfolipidy, glykolipidy, nepolární isoprenoidní lipidy, fosfolipidy, větvené lipidy, mnoho proteinů v membráně FOSFOLIPID: (1) chiralita glycerolu (L-glycerol; dáno enzymy) (2) etherové vazby - glyceroldiether, tetraether = jiné chem.vlastnosti fosfolipidů (3) řetízky větvených isoprenoidů namísto MK Nepřítomnost sterolů • • jednovrstevná – diglycerol tetraether monolayer rezistentnější k narušení teplem 26.9.2014 32 •Mykoplazmata • - bez b.s. • •Protoplasty •Sféroplasty 26.9.2014 33 •netvoří peptidoglykan •V.S., D. S. •M. hominis vyvolává lidskou primární atypickou pneumonii (PAP) a je označované jako PPLO (pleuropneumonia-like organism) •Studium genomu http://www.zdravotnickenoviny.cz/scripts/detail.php?id=304611 nejmenší známý mikroorganismus schopný samostatného života pg Během evoluce se objevily mnohonásobné redukce velikosti genomu a byl pozměněn i genetický kód. Celkové tempo evoluce je necharakteristicky vysoké. Jediným předpokládaným významem redukce velikosti genomu je evoluce Mollicutes na striktní parazity, jejichž velká část metabolické mašinérie zakrněla. 26.9.2014 34 Acidoresistentní bakterie nebarvitelné Gramem •Buněčná stěna: •Obsah lipidických látek • – hl.mykolové kyseliny • (3-OH mastné kyseliny s dlouhým C řetězcem na pozici 2). • - Délka řetězce specifická. •Př: mykobakterie, nokardioformní aktinomycety, korynebakterie •Mykolyl-arabinogalaktan tvoří lipidickou bariéru – brání penetraci kyseliny •Odbarvování 1)kyselým alkoholem (striktní) • 2)slabou kyselinou (2.stupeň) 26.9.2014 35 Mycobacterium acidorezistence 1.stupně – po 1.obarvení bazickým barvivem (fuchsin) se již neodbarví kyselinou ani alkoholem •Mykolové kyseliny s 60-90C • - rezistence vůči pronikání barviv, ATB, vysychání, fagocytóze • •Barvení za horka – lipidy nepropouští barvivo, a nepravidelně (nerovnoměrně) • •Gramovo barvení – vůbec nebo špatně • •Peptidoglykan: • - amidické skupiny na glutamátu i na meso-DAP, opakování peptidických podjednotek • - přítomnost 2 typů mezopeptidového spojení • (D-ala + meso-DAP, meso-DAP + DAP – 70%, pouze zde) • - N-glykolylmuramová kyselina místo N-acetylmuramové • • 26.9.2014 36 Mycobacterium •Hydrofobní buněčná stěna • - problém s transportem Fe (siderofory – chelatizují Fe) • - exocheliny – extracelulární • - mykobaktiny – uvnitř buňky • •Pomalý růst – 3-9 týdnů • - zpomalení transportu přes hydrofobní povrch • - RNA-pol – nižší reakční rychlost,(pomalejší syntéza RNA) • - nízký poměr RNA/DNA – pomalejší syntéza proteinů • http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/0/0a/TB_Culture.jpg http://kodomo.cmm.msu.ru/~marina_g/M.bovis/Images/m_bovis_af.gif 26.9.2014 37 Buněčné povrchy Buněčný náboj Adheze buňky Souvislost mezi cytologickými znaky a proměnlivými formami existence buňky – v závislosti na kontaktu, receptorech, substrátu, prostředí... http://www.uclouvain.be/cps/ucl/doc/isv/images/News_Prachi_mars_385x228.jpg 26.9.2014 38 •Interakce s povrchy – biotickými i abiotickými • •Bakterie evolučně úspěšné – kolonizují všechny niky... • •Research topic (pubmed 120-200 publikací/rok) • •Jeden z faktorů virulence • • • Adheze bakterií http://www.nihon-u.ac.jp/arish/prof/figures/hamada.gif 26.9.2014 39 Vsuvka: Cytologie buňky a virulence •Patogenita – schopnost organizmu způsobovat onemocnění •Virulence – stupeň patogenity – míra schopnosti organizmu infikovat makroorganizmus a způsobovat onemocnění •Faktory virulence = struktury/složky buňky • - faktory adheze • - extracelulární enzymy – invazivní faktory (hyaluronidáza, kolagenáza, koaguláza, kinázy, keratináza, mucináza) • - faktory zabraňující fagocytóze (kapsuly, produkty metabolizmu) • - toxiny (exo- a endotoxiny) • • • • • http://www.toxipedia.org/download/attachments/13619/botox%20structure.png?version=1&modificationDat e=1209086039000&api=v2 Exotoxin - botulotoxin http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/8/8b/Gram_negative_cell_wall.svg/1024px-Gram_ne gative_cell_wall.svg.png http://microbeonline.com/wp-content/uploads/2013/04/lipopolysaccharides.jpg Endotoxiny ve VM Endotoxin = LPS A 26.9.2014 40 Adheze bakterií a indukce cytologických změn •„surface sensing“; • ne všechny buňky na všechny povrchy • • • •Roli hrají: • - vhodné receptory a kompatibilita s cílovou molekulou (C. diphtheriae • epitel hrdla; S. salivarius – zub, chlopně...) • - vznik ireverzibilní vazby s povrchem/mlk • - hydrofobicita buněčného povrchu (hydrofobní MO formují biofilmy) • •Interakce buňky s povrchem indukuje změnu exprese genů buněčné morfologie, motility a adheze 26.9.2014 41 Přilnutí k povrchu •Prostřednictvím: pilli, povrchových proteinů, kapsul a slizů •„surface sensing“ --- swarming --- reverzibilní vazby (hydrostatické, elektrostatické) --- irreverzibilní vazby; specializace •Inhibice adherence • - izolované adheziny nebo molekulry receptorů • - analogy receptorů nebo adhezinů • - enzymy nebo chem. l. specificky ničící adheziny/ receptory • - protilátky povrchově specifické •Výhody: • - substrát zdroj živin/iontů/... – přenos pilli/OMP • (Př. Shewanella – ionty kovů Fe, Mg – term.akcept. při respir) • - biofilm – laterál. výměna genů, lipidů • - vyšší rezistence (spuštění genů...) 26.9.2014 42 Adheze bakterií •Př. studie termodynamiky adheze kmenů Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli a Listeria monocytogenes • - povrchy – různé polymery (teflon, polyetylen, polystyren, acetal..) • - 10(8) CFU/ml; 30min; 20 °C • - závisí na povrchové tenzi adherujících částic, substrátu a tekutého prostředí • Počet adherujících bakterií koreluje s termodynamikou povrchových jevů/napětí. •Míra adheze roste s hydrofilitou povrchu (tzn. substráty s vysokou mírou povrchového napětí), pokud je povrchové napětí bakteriálních buněk vyšší než povrchové napětí tekutiny. • Pokud je povrchové napětí kapaliny vyšší než napětí povrchu bakt. buněk, pak míra adheze roste s hydrofibitou povrchu. 26.9.2014 43 •Bioenergetika, technologie (fermentory), znečištění, bioremediace, biofilm, infekce • •Budoucí výzkum: ovlivněním buněčné adheze modulací hydrofobicity buněk; vývoj nepřilnavých materiálů • Adheze bakterií - význam http://onlinelibrary.wiley.com/store/10.1002/smll.201202334/asset/image_m/mcontent.jpg?v=1&s=840d58 a0b15a4de1e8334d931ef17cd270dbf58f 26.9.2014 44 26.9.2014 45 • •Zubní povlak • – A. van Leewenhoek • - periodontitida •Střevní sliznice •Infekce • – sliznice nebo uvnitř tkáně; • - endokarditida • - trvalý biofilm na chlopních • (hl. strepto- a stafylokoky; • nebezpečí krvácivých dásní..) •- rány; bércové vředy; spáleniny • • Bakterie a hostitelský makroorganizmus adheze bakterií biofilm perzistence rezistence 26.9.2014 46 Biofilm skloviny 700 kmenů z 18ti rodů • Oral multispecies biofilm development and the key role of cell–cell distance Mezibuněčný kontakt – role adhezinů (lektiny) a receptorů (sacharidy) Kontak s povrchem zubu – pelikula proteinů, lektiny... (Rickert et al. 2003) 26.9.2014 47 •Cévky – arteriální, žilní •Močové katetry •Dýchací a dializační přístroje •Umělé chlopně •Kontaktní čočky •Děložní tělísko • • • • •Nemusí být kontakt s vnějškem! - kovové náhrady kloubů • • Biofilm a medicína Stafylokoky – fibronektin-binding protein.. pseudomonády, E. coli, streptokoky, aktinomycety… Bakterie jsou unášeny proudem krve a mohou začít infekční proces na odlehlém místě…. Vytrvalá syntéza a uvolňování toxinů… 26.9.2014 48 Adheze: Střevní mikroflora •Střevní mikroflora: 10 14 CFU/ml; 150 x větší genom • •Proměna s věkem, dietou (polysacharidy; prebiotika..), imunitou, hygienou a ATB léčbou • •Poměr populací – „přínosná mikroflora“ vs. anaerobní mikroflora jako clostridia... • •Alterovaná střevní mikroflora – obezita, cukrovka, záněty, metabolické poruchy • 26.9.2014 49 Střevní mikroflora a probiotika •Funkční potraviny: bakterie mléčného kvašení •Fce: metabolizmus, produkce vitamínů, zábrana adheze patogenů, modulace imunity – alergie, bakteriociny • •probiotický efekt – kmenově specifický • (genetické inženýrství – konstrukce vhodných kmenů...) •živé vektory a nosiče vakcín – protektivních antigenů: • (LABVAC – evrop. projekt – Lactococcus lactis, Streptococcus gordonii, Lactobacillus spp.) Anaerobní bakterie – rovnováha Dusičnany – redukce... 26.9.2014 50 Příjem probiotik •Ovoce a zelenina •Mléčné produkty •Fermentované cereálie, ovoce a zelenina (severské země; intolerance laktózy) Nejběžnější probiotické kultury v doplňcích a léčivech Nejběžnější Probiotické kultury v potravinách Forma: potraviny, doplňky, léčiva.... Spotřeba mléčných produktů 26.9.2014 51 Adheze bakterií na sliznici • http://www.nature.com/nchembio/journal/v8/n1/images_article/nchembio.741-F3.jpg 26.9.2014 52 • http://www.cell.com/cms/attachment/2007951308/2030487050/gr2.jpg Adheze bakterií na sliznici 26.9.2014 53 Adheze probiotik • http://www.nature.com/nrmicro/journal/v8/n3/images/nrmicro2297-f2.jpg 26.9.2014 54 Vsuvka: jiné funkce probiotik než je vysycení lektinů adhezí •Produkce bakteriocinů – x patogenům •Produkce EPS – biofilm – quorum sensing •Produkce biosurfaktantů – antimikrobní aktivita proti pg, snížení adheze pg •Produkce antioxidantů – vychytávají volné radikály (superoxidové anionty, hydroxylové radikály) • • 26.9.2014 55 Probiotika – otázky k zamyšlení: •Identita kmene (patentové kultury) •Testování čistoty kultury? •Bezpečnost kmene •enkapsulace; životaschopnost kmene (bakteriociny hostitele..) • „immobilized cell technology“ (ICT) •Intolerance laktózy; cholesterol 26.9.2014 56