•Taxe bakteriálních buněk •Vybrané principy bakteriálních signálních drah • Chemotaxe je jednou z nejprozkoumanějších signálních drah Bakterie vyhodnocují změnu gradientu koncentrace v prostoru i v čase Vláknité útvary na povrchu buňky http://www.imperial.ac.uk/pls/portallive/docs/1/51685697.PNG Bakterie detekují 2% změnu koncentrace 1 17.10.2014 • M. Kollmann, L. Lovdok, K. Bartholom´e, J. Timmer, V. Sourjik. Design principles of a bacterial signalling network, Nature 438:504, 2005 Zobrazování obrázku Signální dráhy bakterií 2 17.10.2014 Signalizace rozpoznání významných a nevýznamných signálů •= sítě pro regulaci přepisu genů nebo pro přenos signálů • •- monitoring environmentálních a vnitrobuněčných dějů a následná odpověď •- evoluce senzorů, receptorů a přenašečů signálu – pro maximální citlivost a zároveň inhibice neustálé stimulace •- adaptace: na atraktant/repelent kovalentními modifikacemi struktur receptorů •- design chemoreceptorů konzervovaný • • Nature. 2004 Apr 1;428(6982):574-8. From molecular noise to behavioural variability in a single bacterium. Korobkova E1, Emonet T, Vilar JM, Shimizu TS, Cluzel P. 3 senzory chemoreceptor přenašeče signálu 17.10.2014 • Zobrazování obrázku Zobrazování obrázku 4 http://biologos.org/uploads/static-content/flagellum_assembly.jpg http://biologos.org/blog/self-assembly-of-the-bacterial-flagellum-no-intelligence-required senzory chemoreceptor přenašeče signálu 17.10.2014 Organizace signálních drah •(i) Pestrá struktura signálních proteinů •(ii) Tok informace od N-konce senzoru k C-doméně přenašeče (N-to-C flow) •(iii) Různé receptory se shodují v senzorických sektorech •(iv) Jeden signál může spouštět více úrovní/drah odpovědi •(v) Posel signální dráhy cAMP (aktivátor proteinkináz) a cyklický diguanylát •(vi) Souhra signálních drah. • •Experimenty: 3D a 4D struktury domén, charakterizace domén receptorů • Zobrazování obrázku 5 17.10.2014 Signalizace a chemotaxe •Výzkum v oblasti chemotaxe od.r 1880 •Síť chemotaktických drah komplexní, adaptabilní, paměť... •Analýza rušivých elementů spolu s analýzou podstatných signálů •Přenos informace i v populaci buněk • • •Spočívá v samotné struktuře a interakcích proteinů sítě drah •Chemoreceptory s proměnlivými senzory Regulace chemotaxe Zobrazování obrázku 6 Senzory rozeznávají serin, aspartát, maltózu, ribózu, galaktózu a dipeptidy 17.10.2014 •Trg - ribóza a galaktóza •Tar - aspartát •Tsr – serin •Tap – peptidy •Aer - redox • detektor Senzory chemotaxe E. coli Systém chemotaxe E. coli Da89dd4dbc4b989f65e9d5e662a4fcbf http://www.flickr.com/photos/microbeworld/5786278737/ Escherichia coli http://www.asknature.org/strategy/9313eddf22c3f22ec5f41692b88b9b11#.VDb9bPmSzfw 7 17.10.2014 An external file that holds a picture, illustration, etc. Object name is nihms-340619-f0003.jpg Prostorová organizace senzorů Proteiny chemotaxe a pohybu rozmístěné do MML klastrů. Kryoelektronová mikroskopie Receptory fungují jako signalizující di- nebo trimery; amplifikují a integrují chemotaktické signály. Chudé medium – vysoká hladina exprese receptorů a jiných chemotaktických proteinů. Zvyšuje hustotu a kooperaci receptorů. Regulace preference ligandu. 8 17.10.2014 Chemotaxe – strukturně-funkční vztahy •Vysoce konzervované chemoreceptory – Eubacteria, Archaea •Studie: E. coli a salmonela • - multimer na jednom nebo obou pólech buňky • - histidin proteinkináza CheA • - SH3-like adaptor protein CheW • - fosfoprotein fosfatáza CheZ • •Tisíce regulačních proteinů a proteinů pro přenos signálu •Objevena diverzita od modelových MO • - velikost a topologie chemoreceptorů • - modus signálu • - přítomnost přídatných CPL proteinů přenášejících signál • 9 17.10.2014 Mechanismus chemotaxe Mechanismus chemotaxe E. coli Regulace pomocí MCP systému MCP = „methyl accepting chemotactic protein“ váží se na něj proteiny CheA a CheW – enzymy cytosolu (1) CheA = autofosforylující membránová kinasa ( CheA-P) CheA-P přenáší fosfát na CheY (2) CheY-P spouší motor bičíku a pohyb (3) CheZ – fosfatása, desfosforyluje CheY-P(4) 10 Bez atraktantu – rovnovážný stav mezi CheA a CheY 17.10.2014 • chemo 11 17.10.2014 • •Krátkodobá paměť receptorů!!! • •Pomocné látky pohybu – slizy, surfaktanty 12 17.10.2014 • 13 17.10.2014 Vláknité útvary na povrchu buňky •bičík •fimbrie, pili •curli 14 File:Flagellum-beating.svg http://www.rowland.harvard.edu/labs/bacteria/images/green.jpg 17.10.2014 Prokaryota vs eukaryota •rotace bičíku kolem vlastní osy • – pouze u prokaryot •motor – jeho rotační pohyb způsobuje pohyb celého bičíku •poháněn proton motive force (pmf) – pohyb protonů přes cytoplazmatickou membránu •výjimka – alkalifilní bacily – pohyb iontů Na = „Na motive force“ 15 17.10.2014 Pohyb bakteriální buňky spojeno s pohybem po tkáních/sliznicích •swimming motility – pohyb bičíky, plavání •swarming motility – plazivý pohyb kolonií, bičíky, Proteus •twitching motility – trhavý, skákavý pohyb – př. Neisseria gonnorheae, pili IV •gliding motility – klouzavý pohyb 16 http://textbookofbacteriology.net/Motility.jpg http://www.biomedcentral.com/content/figures/1471-2164-12-9-4.jpg Motility medium Swarming motility – kmeny E. coli https://encrypted-tbn2.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcTbs2Lu_YTiE6d-Fcnt9oMqNaJKRyiZwkfrsV0ke4qyidl UwIvU Terasovitý růst – střídání fází Proteus 17.10.2014 Důvody pohybu bakterií •nejčastější – pohyb ke zdroji živin (c gradient) • •reakce na repelent • •shlukování buněk za účelem vytvoření plodnice – Myxobacteria • •Intenzita odpovědi závisí na teplotě, počtu bičíků, viskozitě.. • http://cdn.physorg.com/newman/gfx/news/2005/ecoli_f.jpg http://machineslikeus.com/sites/default/files/styles/homepage_image/public/Myxoccus-bateria-c.jpg 17 17.10.2014 •Vnitřní faktory ovlivňující pohyb • •počet bičíků • •lokalizace bičíků • •dostatek redukčních ekvivalentů • 18 Self-Assembly of the Bacterial Flagellum: No Intelligence Required https://encrypted-tbn3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcR6QJWBl7dtKCwZYJUiH5SvuYaxY-6oW2L8woWCjHg2pjI 1iqUF 17.10.2014 Pohyb bez gradientu koncentrace atraktantu Pohyb v gradientu atraktantu 19 Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Feb 8;108(6):2246-51. 17.10.2014 • http://www.ccbi.cam.ac.uk/iGEM2005/images/f/f9/Chemotaxis.gif 20 17.10.2014 Bakteriální bičík •semirigidní vláknitá struktura • 1 – 4 proteiny – flagelin •podobná stavba u všech dosud • zkoumaných druhů bakterií •tloušťka 13 – 20 nm •1 – 100 mm/s •atraktant – faktor motility test medium (polotuhé medium) G- 21 17.10.2014 • •Komponenty bičíku: • • vždy bazální tělísko – • G- 4kruhy (CM, PG a VM) • G+ 2 kruhy • háček (hook) • vlastní vlákno (jen to antigenem) •Bazální tělísko zůstává po odstranění bičíkového vlákna, to je do 20 až 30 min dosyntetizováno ATP synthase motor 22 17.10.2014 • http://leisureguy.files.wordpress.com/2008/02/flagellum.jpg • • •B.S. ne tak pevná, navíc vnější membrána L pruh - vnější membrána P pruh – PG buněčné stěny 23 G- typ B.S. 17.10.2014 • • 24 17.10.2014 •G+ : •bazální tělísko - 2 disky • spodní disk - v CM • horní disk – v B.S. - kluzné ložisko - tam se otáčí osa, háček pro ohyb http://www.conceptdraw.com/samples/resource/images/solutions/finance-&-accounting-charts/Education- Biology-Gram-positive-bacterial-flagellum.png 25 17.10.2014 Tvorba: •Samouspořádávání – „self-assembly“ •molekuly flagelinu jsou středem vlákna transportovány na konec, vazba na konci bez enzymů, dosyntetizuje se vždy do stejné délky. • • • • • • • • •Geny pro výstavbu bičíku: HAP 1, 2, 3… • 26 Macnab, Robert M. “How Bacteria Assemble Flagella.” Annu. Rev. Microbiol. 57:77-100. 2003. 17.10.2014 • http://www.aip.org/png/images/flagellum.jpg Selfassembly.... 27 17.10.2014 •supramolekulární komplex • • molekul.hmotnost flagelinu větší než pilinu • •flagelární antigen • •začíná v CM (oproti fimbriím) • •délka bičíku několikanásobně větší než délka buňky • •bičíky lze snadno odstranit sklem • 28 http://www.nature.com/bdj/journal/v202/n12/covers/largecover.gif http://textbookofbacteriology.net/T.pallidumAgstain.jpeg 17.10.2014 Ultrastruktura bičíku 29 17.10.2014 uspořádání: taxonomický znak • 30 17.10.2014 Pseudomonas Spirillum Proteus vulgaris 31 17.10.2014 •Pozorování pohybu bičíku – visutá kapka •- důležitý dostatek kyslíku • v temném poli a intenzivním světle • •Pozorování bičíků samotných –světelný mikroskop po spec. barvení (obalení bičíku vrstvou mořidla, znásobení a zviditelnění jeho průměru) –elektronový mikroskop – negativní barvení • otiskové preparáty po rychlém zmražení na -150 C • 32 Agrobacterium Spirillum volutans 17.10.2014 33 1) polárně – 1 nebo oba póly - monotricha (Pseudomonas): pohyb dopředu: proti směru hodinových ručiček. Otáčení buňky: po směru hodinových ručiček. - amfitricha (Spirillum) - lofotricha (Spirillum) 2) po celém povrchu – peritricha (Proteus vulgaris, Agrobacterium). •Pohyb dopředu: - shloučení bičíků a pohyb proti směru hodinových ručiček. •náboj •Rozpletení = kroucení buňky na místě • •„Chce-li“ se buňka pohybovat jedním směrem, namotá bičíky, které jsou ve směru pohybu, na sebe a je tlačena bičíky druhé strany • 17.10.2014 34 17.10.2014 •vnější faktory ovlivňující pohyb: • •magnetické pole Země (zvl.struktury – magnetosomy (Aquaspirillum) od dvou do několika desítek, uvnitř či ve středu buňky, málo v blízkosti jádra) • •chemotaxe (odpověď na změny ve vnějším prostředí, funguje i při • ↑ c živin, negativní • chemotaxe od barviva, • rychlost pohybu úměrná • koncentraci barviva) • •fototaxe (odpovědí na světlo • je pohyb ↑ rychlosti než • při chemotaxi) • •aerotaxe • aerotaxe 35 17.10.2014 Plazivý pohyb kolonií (swarming) •Proteus, Vibrio •pohyb indukovaný kontaktem s tuhým médiem •delší buňky, více bičíků •oblak, roj buněk, který se pohybuje koordinovaným pohybem •má schopnost přerůstat i vyvýšené útvary na médiu https://encrypted-tbn1.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcSXeLlNvO_GHL5Fa1DYPUlItU6zrkgNjK4FT2CxeM3WDK0 f1uXJ http://origin-ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S1369848607000544-gr2.jpg 36 17.10.2014 • 37 http://www.hfsp.org/sites/www.hfsp.org/files/Koster2012a.jpg Surface Growth of a Motile Bacterial Population Resembles Growth in a Chemostat. Daniel A Koster, Avi Mayo, Anat Bren and Uri Alon. Journal of Molecular Biology, 2012 Dec 7;424(3-4):180-91. doi:10.1016/j.jmb.2012.09.005. Quantitative measurements of their growth show that a population of bacteria that migrates on a surface grows at constant density, similar to bacterial growth in a continuous culture such as a chemostat. 17.10.2014 Klouzavý pohyb (Gliding motility) •na pevných površích •mechanismus nejasný •pmf patrně zahrnuty •přizpůsobení – slizy, surfaktanty, struktury podobné motoru v BS, specif. membránové komponenty, které tvoří reverzibilní vazbu se substrátem, actine-like systém •Makoto Miyata, profesor Osaka City University zkoumal klouzavý pohyb Mycoplasma mobile •Za pomoci cytoskeletárních filament udržují nesférický tvar. („They look like schmoos that are pulled along by their heads. How they are able to glide is a mystery“.) • 38 Miyata, M., Ryu, W.S., and Berg, H.C. "Force and velocity of Mycoplasma mobile gliding." J. Bacteriol. 184, 1827-1831 (2002). https://www3.nd.edu/~tutorial/tutorial_files/myxo/howItworks_clip_image002_0001.jpg 17.10.2014 • 39 Klouzavý pohyb - tvorba plodnice myxobakterií http://www.mimg.ucla.edu/faculty/shi/MyxoSwarm.jpg http://mmbr.asm.org/content/74/2/229/F1.large.jpg 17.10.2014 • 40 http://www.mimg.ucla.edu/faculty/shi/Myxo%20life%20cycle.jpg 17.10.2014 • An external file that holds a picture, illustration, etc. Object name is nihms-384522-f0001.jpg Interakce proteinů zahrnutých do klouzavého pohybu. An external file that holds a picture, illustration, etc. Object name is nihms-384522-f0005.jpg Large focal adhesion complexes penetrate the cell envelope, stick to the substratum at one end, and connect to cytoskeletal filaments at the other end. Motor proteins push backward (marked by small arrows) against those focal adhesion complexes, pushing the cells forward. Annu Rev Genet. 2011; 45: 21–39. Gliding motility 41 17.10.2014 Bičíky archebaktérií - strukturní a funkční podobnost bakteriálním bičíkům - Rozdíly - pohon ATP (mechanismus neznámý) - bičík nemá centrální dutiny – nemožnost dorůstání od konce - koordinovaný pohyb více filament 42 17.10.2014 PILI - fimbrie •Různě velké, typicky u G- •struktura B.S, stovky • •duté, vždy nepohyblivá trubička - 3, 4 nebo 5 vláken stočených do spirály - pilin • •kratší než bičík • - Ø2-8 nm, délka 0,1 – několik nm, 3-5 molekul • •Fce: přenos DNA konjugací, přichycení fágů •Pohyb (twitching motility); adheze k nenabitým povrchům • • 43 17.10.2014 44 17.10.2014 • •I. •kódované chromozomálně •specifická kolonizace u symbiontů, parazitů a patogenů • Př: Vibrio cholerae O1, E.coli – uropatogenní P pilus, adherentnce fimbrie + enterotoxin E. coli) •II. •sex fimbrie - kódované konjugativním plazmidem u donora DNA, můstek pro plazmid (F pilus u E.coli, konjugativní plazmidy salmonel) • •barvení : • - kys.fosfowolframová • - kys. osmičelová •IV. •„odskočení“ buněk streptokoků způsobuje „vroubkování“ kolonií • • PILI – fimbrie - typy 45 17.10.2014 Přenos DNA – pilli?? Proteinové kanálky?? •Transformation and conjugation permit the passage of DNA through the bacterial membranes and represent dominant modes for the transfer of genetic information between bacterial cells or between bacterial and eukaryotic cells. As such, they are responsible for the spread of fitness-enhancing traits, including antibiotic resistance. Both processes usually involve the recognition of double-stranded DNA, followed by the transfer of single strands. Elaborate molecular machines are responsible for negotiating the passage of macromolecular DNA through the layers of the cell surface. All or nearly all the machine components involved in transformation and conjugation have been identified, and here we present models for their roles in DNA transport. 46 17.10.2014 Curli •Proteinové komponenty Enterobacteriaceae •forma amyloidních vláken (strukturou); •Proces jejich samouspořádávání proto model formování amyloidních vláken (např.při výzkumu Alzheimerovy, Huntingtonovy choroby a onemocnění způsobených priony) •Objeveny 1980 •Adheze na povrchy, agregace buněk, formování biofilmu, invaze do hostitele •Indukují zánět • 47 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16704339 http://www.annualreviews.org/na101/home/literatum/publisher/ar/journals/content/micro/2006/micro.20 06.60.issue-1/annurev.micro.60.080805.142106/production/images/medium/mi600131.f1.gif http://www.annualreviews.org/na101/home/literatum/publisher/ar/journals/content/micro/2006/micro.20 06.60.issue-1/annurev.micro.60.080805.142106/production/images/medium/mi600131.f5.gif 17.10.2014 Příklady variability struktur bakteriální buňky Příklady faktorů ovlivňujících morfologii a funkci struktur bakteriální buňky In vivo?? In vitro??? 48 17.10.2014 Cytoplazma •Prostorová organizace (vysoký stupeň) • - řízeno ATPázami, protonovým gradientem membrány, aktinovými vlákny – udělují polaritu • - maximální hustota a rychlost a specifita reakcí • •Mobilizace cytoplazmy (difúze? X) • – řízeno IR zářením a generováním vody exkluzní zóny • •Mikroskopická struktura - gel 49 17.10.2014 Nukleoid, plazmidy •ATPáza ParA • - aktivní rozdělování nízkokopiových plazmidů • - par-geny i na chromozomu! • - par-geny kódují – centromeru a trans-acting proteiny a,b •TEM •Nukleoid jako biosenzor – detekce Hg.... •HU proteiny – konzervované; nadšroubovice, 3D, + ncRNA – komplex – architektura chromozomu • 50 17.10.2014 Ribozom •Přítomnost antibiotik v prostředí? •Okamžik buněčného cyklu? •Hladovění buněk – degradace ribozomů... 51 17.10.2014 Biogeneze CM membrány •Při kolonizaci u parazitů •shift •Cílová léčba: ovlivnění mechanismů transportu beta-barelů 52 17.10.2014 Buněčná stěna •Tvar bňky – souvislost s cytoskeletem •Ovlivnění komplexů syntetizujících PG - ATB 53 17.10.2014 Polarita buňky •Zabezpečuje: • - pohyb za atraktantem • - pohyb buněk pro tvorbu kolonií • - vstup do hostitele u parazitů • - adheze (Bradyrhizobium – kořínky) •ATPázy – pohyb a tvar DNA a struktur • The phrase ‘diffusion-and-capture’ has been coined to identify the mechanism by which a protein moves to a specific location by signals encoded within its primary structure, and is then captured by a target protein (Rudner et al., 2002; Shapiro et al., 2009) 54 17.10.2014 Vnější struktury bakteriálních buněk vs. buňky hostitele – adheze, invaze a remodelace hostitelských buněk Invaziny (OMP) LPS – enterotoxin lipid A Jak jsou indukovány změny některých struktur bakteriální buňky, a jak tyto struktury působí na přestavbu buňky eukaryotické 55 17.10.2014 Eukaryotický cytoskelet a jeho modifikace vlivem patogenů •Tendence – vždy vhodná nika pro přežití • •Ovlivněn viry i bakteriálními patogeny • •Regulace cytoskeletu vazbou na receptory či vstupem do buňky, a to: •Bakteriální toxiny •Aktin-regulující GTP-vázající malé proteiny • •Cytoskelet hostitele slouží k: • - přilnutí, vstup do buněk, pohyb uvnitř a mezi buňkami, formování vakuol a remodelace, • zábrana fagocytózy... • 56 17.10.2014 Patogenita bakterií a eukaryotický aktinový cytoskelet •hraje roli při změnách (pohybu buňky a pohlcení bakterie) euk.CM při fagocytóze •a) interakcí bakteriálních produktů s receptory cytoplazmatické membrány za regulace cytoskeletu • b) přímým vstupem produktů do buňky •Intracelulární patogeni vlastní ligandy reagující s receptory a sekreční systém IV typu translokuje molekuly efektorů do cytoplasmy •Takto bakterie svými produkty manipulují aktinový cytoskelet pro promote jejich proliferaci •Stimulace polymerace aktinu a zvýšená fagocytóza bakterií!! •Rychlé násobení počtu bakteriálních buněk ve tkáních • • a) Intracelulární patogeni 57 17.10.2014 •Naopak - produkují substance vstupující do eukaryotické buňky a ničící síť aktinových vláken •Tím zabrání pohlcení a natrávení eukaryotickou buňkou b) extracelulární patogeni 58 17.10.2014 Faktory adheze Clostridium difficile při přilnutí na lidské enetrocyty ve střevě •Studium – monovrstva bněčných linií střevních buněk (střevní epiteliální Caco-2 a sliz produkující HT29-MTX), nikoli in vivo! •Růst za zahřívání a v přítomnosti krve •Mikroskopie: SEM •Interakce bakterií s microvilli epitelu, silná vazba na buňky mukózní vrstvy •Byly pozorovány hlavně dva povrchově-vazebné protejny 12 a 27kDa 59 17.10.2014 Průchod salmonel epiteliálními buňkami •Intracelulární parazity •Vstup do vakuol, replikace •V přítomnosti povrchů epiteliálních buněk se indukuje syntéza některých proteinů důležitých pro adherenci a invazi •Indukce proteinů stimulována trypsinsenzitivními a nueraminidázasenzitivními strukturami epitelu 60 17.10.2014 • Full-size image (59 K) 61 17.10.2014 Přestavba cytoskeletu provázející prostup salmonel epitelem •Metodika: konfokální mikroskop, imunofluorescenční a elektronový •Po vstupu do vakuol buňky salmonel obklopeny 5-10 um struktur cytoskeletu • - rozsáhlými agregáty polymerizovaného • aktinu, alfa-aktininu a tropomyosinu krátce po přichycení (20-60 min) a tato vlákna zmizela po internalizaci • - tubulin rovněž agreguje.. • - studie: aplikace inhibitoru mikrofilament – cytochalasin D, který blokoval bakteriální internalizaci, ale nebránil akumulaci polymerizovaného aktinu •Salmonela po vazbě na povrch spouští přestavbu cytoskeletu 62 17.10.2014 • Full-size image (57 K) 63 17.10.2014 • Full-size image (76 K) 64 17.10.2014 Přestavba cytoskeletu vlivem proteinu Neisseria gonorrhoeae •Vstup do buněk tkáňové kultury po vazbě Opa (opacity outer membrane proteins) na proteoglykanové receptory •Cytochalasin D – látka přerušující mikrofilamenta - opět blokoval vstup buněk •Opět akumulace aktinových filament kolem buněk při jejich vstupu do hostitele 65 17.10.2014 Možnosti studií funkce struktur OMP •Známé sekvence genů pro invaziny •Transformace modelových MO (př: E. coli) těmito geny •Plasmid s genem fúzovaným s genem pro beta-laktamásu ve vedoucí sekvenci = E. coli (opa) •Oproti netransformovaným E. coli adherovaly na buňky určitého epitelu •Kinetika a stupeň invaze byly porovnatelné s hodnotami pro Opa+ N. Gonorrhoeae •Metoda studiua invaze: TEM •Invaze inhibována: cytochalasin D •TEM prokázala: buňky infikovaného epitelu vykazovaly dramatické snížení filamentů 66 17.10.2014 •Děkuji za pozornost 67 17.10.2014