Struktury vybraných bakteriálních toxinů zodpovědné za toxicitu a invazivitu Picture Kódovány geny nukleoidu, plazmidů či fágů Lipopolysacharidy nebo proteiny 1 21.11.2014 Enzymy; peptidy způsobující póry v membráně; superantigeny http://www.ks.uiuc.edu/Research/anthrax/images/route-hi.jpg 21.11.2014 2 http://www.biken.osaka-u.ac.jp/COE/eng/project/images/fig_sugimoto.gif I)Enzymatická struktura i funkce II) •Substrát: komponenta tkáně, orgánu nebo tekutiny hostitele • •Uspořádání: podjednotka A a B • - toxiny působící uvnitř buněk hostitele • - A podjednotka – enzymatická aktivita • neaktivní, dokud ve spojení s B • - B jednotka – specifická vazba k receptoru • a přenos enzymu přes membránu, • netoxická Bakteriální toxiny 3 21.11.2014 Crystal Structure of PA-CMG2 Toxin antraxu Buněčný receptor •Dva mechanizmy vstupu přes membránu: • 1) přímý vstup po vazbě B jednotky na receptor a vytvoření póru v membráně pro transport A podjednotky do CPL • • 2) vazba A+B komplexu na receptor, ten zprostředkuje endocytózu. Uvnitř • endozomu přibývá H+ iontů a okyseluje se, to vede k oddělení jednotek. • B podjednotka následně napomáhá průniku A jednotky •Podjednotka B v obou případech schopnost inzerce do membrány. Obsahuje-li hydrofobní složku (AMK – jako difterotoxin) – je zodpovědná za translokaci. • •Některé toxiny vstupují oběma cestami. •Podobná enzymatická fce nemusí znamenat stejnou cestu vstupu (př. anthrax a adenylát cykláza Bordetella pertusis - obojí katalyzují produkci cAMP z rezerv ATP, ale anthrax vstupuje receptorem) • Vstup toxinů do cílové buňky 4 21.11.2014 21.11.2014 5 How anthrax toxins cause pathology. Fully virulent B. anthracis produce ... How anthrax toxins cause pathology. Fully virulent B. anthracis produce an antiphagocytic capsule as well as toxins. The protective antigen (PA) of the anthrax toxin binds to the ATR on the host cell surface. The 83-kDa form of PA is cleaved by the cell surface protease furin and produces a 63-kDa monomer. Heptamerization of PA induces clustering of the ATRs, association of the complex with lipid rafts, and exposure of binding domains to the edema factor (EF) or the lethal factor (LF). The heptamer, and bound EF or LF, are then endocytosed. EF, an adenylate cyclase, and LF, a Zn2+ metalloprotease, translocate to the cytosol through a pore created in the membrane and act on host cytosolic targets to induce edema, necrosis, and hypoxia. Modified with permission from Annual Reviews (4). CaM, calmodulin. http://www.jci.org/articles/view/19581/figure/1 •II) Způsobující vznik pórů v membráně I) • - blokuje selektivní influx a eflux iontů •Př: RTX toxiny G- bakterií, streptolysin S. pyogenes, alfa toxin S. aureus • • - vznikají samouspořádáváním oligomerů • •Alfa-toxin – syntetizován jako 319 AMK prekurzor obsahující N-terminální konec z 29 AMK. Secenerovaný toxin je hydrofilní mlk 33 kDa. 7 protomer se uspořádává do houbovitého heptameru ze 3 domén, jedna z nich je iontový kanál Bakteriální toxiny 6 21.11.2014 Toxin species prostup nemoc perfringiolysin O Clostridium perfringens cholesterol gas gangrene hemolysin Escherichia coli cell membrane UTI listeriolysin Listeria monocytogenes cholesterol systemic; meningitis anthrax EF Bacillus anthracis cell membrane anthrax (edema) alpha toxin Staphylococcus aureus cell membrane abcesses pneumolysin Streptococcus pneumoniae cholesterol pneumonia; otitis media streptolysin O Streptococcus pyogenes cholesterol strep throat leukocidin Staphylococcus aureus phagocyte membrane pyogenic infections Póry formující toxiny 7 21.11.2014 •III) Superantigeny I) • - toxiny stimulující IS (horečka, toxický šok) • - pyrogenní exotoxiny – stafylokoky enterotoxin serotyp A-E, G, H, exfoliatin, TSST-1), streptokoky (pyrogenní exotoxiny A-C) • - 22 kDa - 30 kDa • - vazba na MHC II spouští masivní proliferaci T buněk = uvolnění • cytokinů z lymfocytů (IL-2, gamma interferon) a monocytů (TNF, IL-1-..) • - tyto cytokiny jsou mediátory hypotenze horečky, šoku Bakteriální toxiny 8 21.11.2014 Bakteriální exotoxiny •Vylučovány živými buňkami v exp. fázi •Produkovány G+ i G- bakteriemi •Proteiny, málo polypeptidy (př: enzymy) •Vážou se obvykle na specifické receptory – GP, sialoglykosidy (G proteiny) •Kódovány geny plazmidů nebo fágů •Termolabilní; inaktivovány při 60 °C •Nestabilní – toxicitu ztrácí (antigenitu nikoli) • • •Produkovány: V. cholerae, enterotoxigenní E. coli (ETEC), některé kmeny S. aureus, V. parahaemolyticus, Y. enterocolitica, Aeromonas sp., Cl. perfringens • • • • 9 21.11.2014 Bakteriální exotoxiny a makroorganizmus •Vysoce toxické, pro zvířata letální i v malých dávkách •Vysoce antigenní, stimulují vznik antitoxinu •Spojené s průjmovými onemocněními a otravami z potravin •Většinou působí v místě vzdáleném bráně vstupu (invazivní) • - botulin, tetanospazmin •Druhově specifické; ale pouze u virulentních kmenů •Specificky toxické – botulin, tetanospazmin – neurony •Nespecificky toxické - pro celou řadu cílových buněk, nekróza • - kolagenáza, hyaluronidáza, streptokináza, fosfolipáza, lecitináza, hemolyziny, leukocidiny •Neindukují horečnaté stavy; zvyšují hladinu nitrobuněčného cAMP (choleratoxin stimulující kinázu A); inhibují syntézu proteinů (difterický toxin), mají afinitu k nervovým vláknům • • • • 10 21.11.2014 •Konvertovatelné na toxoidy – modifikované toxiny •Agens pro imunizaci • •– nejsou toxické, pouze antigenní, použití ve vakcínách (př: difterický toxoid, tetanový o.) • -konverze exotoxinů do toxoidů např. působením formalinu, iodinu, kys.askorbové, pepsinu, ketonů (směs: 37 °C, v rozmezí pH 6 – 9; několik dnů) • Bakteriální exotoxiny jako vakcíny 11 21.11.2014 Příklady působení bakteriálních exotoxinů • •Corynebacterium diphtheriae – toxigenní kmeny nesou temperovaného bakteriofága; difterotoxin inhibuje proteosyntézu – buněčná smrt • • • •Clostridium tetani – exotoxiny blokují relaxaci nervových buněk; tetanospazmin využívá receptor GT1 a/nebo GD1b • • • • • • •Clostridium perfringens – alfatoxin (lecitináza) – buněčná smrt, enterotoxin – hypersekrece vody a elektrolytů (průjem) • • • • • • •Clostridium botulinum – exotoxin paralyzuje svaly. Blokuje uvolnění acetylcholinu synapsí a nervosvalových spojů. 12 21.11.2014 •Difterický toxin: vstup do vnímavé buňky •Vazba B doménou na receptor •Receptor zprostředkuje endoytózu •Okyselení vnitřku vezikuly (pH 5) dovolí rozvinutí A a B řetězců •T doména (součástí B podjednotky) transklokuje přes membránu A doménu •A doména využívá NAD jako substrát, katalyzuje připojení ADP-ribózy z NAD na elongační faktor EF-2= inaktivace syntézy proteinů • http://textbookofbacteriology.net/dtox1.jpeg http://textbookofbacteriology.net/dtox2.gif Vazebná doména k receptoru hostitelské buňky Katalytická doména – inhibuje elognační faktor 2 – ADP ribosylací T hydrofobní doména zodpovědná za inzerci do endosomu membrány k uvolnění jednotky A. • 60 000 Da 13 21.11.2014 • •Vibrio cholerae 01 a 0139 – enterotoxin způsobuje hypersekreci vody a elektrolytů; choleratoxin využívá receptor gangliosid GM1 • • •E. coli – enterotoxin (LT – termolabilní) – hypersekrecievody a elektrolytů • • •Shigella dysenteriae type 1 – toxin akutního zánětu • • •Staphylococcus aureus – toxického šoku; toxiny otravy z potravin, stimulace mozkového centra zvracení • •Streptococcus pyogenes – pyrogenní exotoxin; scarlet-fever a syndrom tox. šoku Příklady působení bakteriálních exotoxinů 14 21.11.2014 Letalita bakteriálních exotoxinů Toxin Toxic Dose (mg) Host Lethal toxicity compared with: Strychnine Endotoxin (LPS) Snake Venom Botulinum toxin 0.8x10-8 Mouse 3x106 3x107 3x105 Tetanus toxin 4x10-8 Mouse 1x106 1x107 1x105 Shiga toxin 2.3x10-6 Rabbit 1x106 1x107 1x105 Diphtheria toxin 6x10-5 Guinea pig 2x103 2x104 2x102 15 21.11.2014 • Shiga-like toxiny SLTs • - SLT-I - identický shiga-toxinu • - ostatní - SLT-II – podjednotka A (N-glykosidázová aktivita – • inhibice syntézy proteinů) a B • - vstřebávány do krevního oběhu, ovlivňují endotel cév • v cílových orgánech • - mohou být toxické pro enterocyty •Průjem, hemolytická kolitida, hemolytickouremický syndrom Vero cell cytotoxiny produkované E. coli 16 21.11.2014 Bakteriální endotoxiny •Endotoxiny – součásti buněčné stěny G- bakterií •uvolnitelné lyzí buňky; př: LPS = lipid A+PS, peptidoblykan (méně účinný než LPS), lipooligosacharid •Nemají specifický receptor •Mírně toxické; ve větších dávkách letální pro zvířata •Termostabilní; toxicita zachována často i při vícehodinovém působení 60 °C •Slabě antigenní •Nekonvertovatelné na toxoid •Syntéza řízena geny nukleoidu Picture 17 21.11.2014 Bakteriální endotoxiny a makroorganismus •Účinky endotoxinů – shodují se u většiny G- bakterií –horečka – působí na makrofágy, uvolňuje se IL-1, působí na centrum termoregulace –leukopenie – může být následována leukocytózou –hypoglykémie – LPS způsobuje glykolýzu v buňkách různého typu a vede k hypoglykémii –septický šok – při bakteriémii –aktivace komplementu –disseminovaná intravaskulární koagulace DIC – iniciováno aktivací koagulační kaskády, která vede ke konverzi fibrinogenu na fibrin; endotoxin způsobí adhezi destiček na endotelium cév, aktivuje přeměnu plazminogenu na plazmin –smrt (septický šok; DIC) 18 21.11.2014 •Kontrolováno působením signálů z vnějšího prostředí –produkce difterotoxinu reprimována železem v mediu –exprese cholerového toxinu – kontrolována osmolaritou prostředí • •Signální sekvence: • - váže se do membrány při translaci, toxin uvolněn do periplazmy • - nebo syntéza v CPL, chaperony pomáhají prostupu • - vícesložkové – jako choleratoxin – podjednotky syntetizovány • v CPL, spojení až po vyloučení do periplazmy • - u G- únik přes vnější membránu pomocí vezikul Regulace a syntéza bakteriálních toxinů 19 21.11.2014