Iva Jaborníková 23.10.2012 žPoužité kultury, se kterými jsem pracovala: ž žBacillus mycoides CCM 145 žLactobacillus brevis CCM 3805T žMicrococcus luteus CCM 169 žMycobacterium phlei CCM 5639 žCorynebacterium glutamicum CCM 2428 ž ž Ve cvičení jsme pracovali se světelným mikroskopem, při světelné mikroskopii je možno dosáhnou maximální zvětšení 1500x a max. rozlišení 200 nm ž žumožňuje pozorování živých objektů v nativním stavu bez barvení žvzhledem k malému kontrastu nejsou rozeznány detaily objektů mezi strukturami s podobnou propustností světla žhustou absorbující část preparátu vidíme jako světlou žcílená změna fáze vlnového pole, neovlivněného vyšetřovaným předmětem, vzhledem k fázi pole ovlivněného tímto předmětem žpomocí této metody dosáhneme kontrastního obrazu fázového předmětu tj. předmětu, který prakticky neovlivňuje amplitudu vlnového pole, které jím prochází, ale ovlivňuje pouze jeho fázi (např. bakterie, buňky apod.) žvýhodou této metody je, že nepoškozuje živé biologické objekty a umožňuje jejich pozorování v čase. ž žPostup: žDo kapky vody naneseme na kličce buňky, překryjeme krycím sklíčkem žPozorujeme pod fázovým kontrastem objektivem 100x, pod imerzí ž ž žskládání 2 obrazů ze 2 paprsků ž a)procházejících objektem b)jdoucích mimo objekt ž-> 2 obrazy vzájemně kolmo polarizované ž žNormanského destička v kondenzoru rozděluje paprsek do dvou souběžných. žPlastický 3D obraz podle indexu lomu různých částí buňky. ž žje softwarový systém pro analýzu barevného obrazu. Systém umožňuje komunikaci mezi snímacím zařízením (kamerou), snímací (grabbovací) kartou a počítačem ž žBarvení bakterií jako identifikační metoda. žPostup: žsuspenzi z kultury mikrobů rozetřeme na čisté podložní sklíčko, necháme dobře zaschnout a fixujeme 3x projetím plamenem žponoříme do roztoku krystalové violeti a necháme působit 30 sekund žbarvivo opláchneme slabým proudem vody (2s) žpreparát ponoříme do Lugolova roztoku na 30 sekund. žopláchneme slabým proudem vody (2s) žpřekryjeme ethanolem (nebo acetonem), maximálně 15-20 sekund žopláchneme slabým proudem vody a gramnegativní b. dobarvíme safraninem 1 minutu žosušíme mezi dvěma filtračními papíry a mikroskopujeme pod imerzním objektivem (celkové zvětšení 1000x) ž žNegativním barvením obarvíme okolí buněk, nikoli buňky samotné. Využívá se pro měření přesné velikosti bakteriální buňky. Nabarví se totiž jen pozadí (sklíčko), nikoli buňka samotná. Tím není velikost buňky deformována fixací ani barvivem. ž žPostup: žasepticky přeneseme 1 kličku bakteriálních buněk do malé kapky destilované vody, vedle se přidá malá kapka nigrosinu žkapky se rozetřou jemným tahem druhého sklíčka (přiloženého pod úhlem 45˚ po celé ploče podložního skla), druhé sklíčko ožíhneme žbez oplachování se nechá zaschnout na vzduchu ždůležité: vytvořit jen tenký film barviva s dostatečně zředěnými buňkami žpozorujeme pod imerzí (Z 1000x) ž žPozorávání: neobarvené buňky na šedém pozadí ž žGramnegativní typ buněčné stěny: peptidoglykan 10%, 2nm, porózní výplň mezi cytoplazmatickou membránou a vnější membránou, 2 periplazmatické prostory. Modré barvivo se v porózní vrstvě nenaváže, vymývá se etanolem -> následně se buňky obarví safraninem ž žGrampozitivní typ buněčné stěny: peptidoglykan 40nm, 90%, hydrofobní struktura. Mezi polymerem je voda. Do hydratované vrstvy se dostává barvivo krystalové violeti, Lugolův roztok fixuje přímo na strukturách. Organické rozpouštědlo poté dehydratuje vrstvu. Barvivo zůstává pevně vázáno, nedobarví se dál safraninem. ž žBacillus mycoides CCM 145 (G+ tyčka) C:\Documents and Settings\UserXP\Dokumenty\škola\podzim 2012\cytologie a morfologie bakterií\cviko\cvičení1\1_cvic_fota\DSCN2744_B.mycoides.JPG C:\Documents and Settings\UserXP\Dokumenty\škola\podzim 2012\cytologie a morfologie bakterií\cviko\cvičení1\1_cvic_fota\DSCN2744.JPG Makroskopický vzhled: Tvar: vláknitý Barva: krémová Okraje: vláknité Profil: plochý Vláknitý růst kolonií Zvětšení: lupa 10x žLactobacillus brevis CCM 3805T Makroskopický vzhled: Tvar: kruhový Barva: bílá Okraje: hladké Profil: zvýšený C:\Documents and Settings\UserXP\Dokumenty\škola\podzim 2012\cytologie a morfologie bakterií\cviko\cvičení1\1_cvic_fota\DSCN2740.JPG C:\Documents and Settings\UserXP\Dokumenty\škola\podzim 2012\cytologie a morfologie bakterií\cviko\cvičení1\1_cvic_fota\DSCN2740_L.brevis.JPG C:\Documents and Settings\UserXP\Dokumenty\škola\podzim 2012\cytologie a morfologie bakterií\cviko\cvičení1\1_cvic_fota\DSCN2741.JPG Zvětšení: lupa 10x C:\Documents and Settings\UserXP\Dokumenty\škola\podzim 2012\cytologie a morfologie bakterií\cviko\cvičení1\1_cvic_fota\DSCN2765.JPG žMicrococcus luteus CCM 169 Makroskopický vzhled: Tvar: kruhový Barva: žlutá Okraje: hladké Profil: zvýšený C:\Documents and Settings\UserXP\Dokumenty\škola\podzim 2012\cytologie a morfologie bakterií\cviko\cvičení1\1_cvic_fota\M_luteus_DSCN2762.JPG C:\Documents and Settings\UserXP\Dokumenty\škola\podzim 2012\cytologie a morfologie bakterií\cviko\cvičení1\1_cvic_fota\DSCN2764.JPG C:\Documents and Settings\UserXP\Dokumenty\škola\podzim 2012\cytologie a morfologie bakterií\cviko\cvičení1\1_cvic_fota\M.luteus.JPG Zvětšení: lupa 10x žMycobacterium phlei CCM 5639 Makroskopický vzhled: Tvar: nepravidelný Barva: žlutá Okraje: vláknité Profil: knoflíkový C:\Documents and Settings\UserXP\Dokumenty\škola\podzim 2012\cytologie a morfologie bakterií\cviko\cvičení1\1_cvic_fota\DSCN2758.JPG C:\Documents and Settings\UserXP\Dokumenty\škola\podzim 2012\cytologie a morfologie bakterií\cviko\cvičení1\1_cvic_fota\DSCN2758_Mycobacterium phlei.JPG C:\Documents and Settings\UserXP\Dokumenty\škola\podzim 2012\cytologie a morfologie bakterií\cviko\cvičení1\1_cvic_fota\DSCN2759.JPG C:\Documents and Settings\UserXP\Dokumenty\škola\podzim 2012\cytologie a morfologie bakterií\cviko\cvičení1\1_cvic_fota\DSCN2760.JPG Zvětšení: lupa 10x žCorynebacterium glutamicum CCM 2428 Makroskopický vzhled: Tvar: kruhový Barva: krémová Okraje: hladké Profil: zvýšený C:\Documents and Settings\UserXP\Dokumenty\škola\podzim 2012\cytologie a morfologie bakterií\cviko\cvičení1\1_cvic_fota\DSCN2754_Corynebacterium gl..JPG C:\Documents and Settings\UserXP\Dokumenty\škola\podzim 2012\cytologie a morfologie bakterií\cviko\cvičení1\1_cvic_fota\DSCN2755.JPG C:\Documents and Settings\UserXP\Dokumenty\škola\podzim 2012\cytologie a morfologie bakterií\cviko\cvičení1\1_cvic_fota\DSCN2756.JPG C:\Documents and Settings\UserXP\Dokumenty\škola\podzim 2012\cytologie a morfologie bakterií\cviko\cvičení1\1_cvic_fota\DSCN2754.JPG Zvětšení: lupa 10x C:\Documents and Settings\UserXP\Dokumenty\škola\podzim 2012\cytologie a morfologie bakterií\cviko\cvičení1\1_cviceni_gram_negativni_fazovy\moje\mycobacterium_phlei_micrococcus_ii_ij. jpg C:\Documents and Settings\UserXP\Dokumenty\škola\podzim 2012\cytologie a morfologie bakterií\cviko\cvičení1\1_cviceni_gram_negativni_fazovy\moje\mycobacterium_phlei_micrococcus_ij.jpg Micrococcus luteus CCM 169 + Mycobacterium phlei CCM 5639 Celkové zvětšení 1000x Neobarvené Mycobacterium G+ Micrococcus C:\Documents and Settings\UserXP\Dokumenty\škola\podzim 2012\cytologie a morfologie bakterií\cviko\cvičení1\1_cviceni_gram_negativni_fazovy\moje\corynebactreium_glutamicum_ad.jpg žCorynebacterium glutamicum žCelkové zvětšení 1000x ž Tvorba palisád žtyčky různé délky, ve dvojicích, v řetízcích žgrampozitivní žendospory oválné, kulaté - uloženy centrálně, paracentrálně, subterminálně, terminálně, laterálně žperitrichální bičíky žoptimální růstová teplota 15 - 55 °C žfakultativně anaerobní žširoká diverzita fyziologických schopností (pH, teplota, salinita), chemoorganotrofní žpatogenní, potravinové otravy, entomopatogenní žtvar endospory i mateřské buňky - znaky využitelné v taxonomii (tři morfologické skupiny) C:\Documents and Settings\UserXP\Dokumenty\škola\podzim 2012\cytologie a morfologie bakterií\cviko\cvičení1\1_cviceni_gram_negativni_fazovy\bacili gramem\b_cereus_hp.jpg C:\Documents and Settings\UserXP\Dokumenty\škola\podzim 2012\cytologie a morfologie bakterií\cviko\cvičení1\1_cviceni_gram_negativni_fazovy\bacili gramem\b_mycoides2_lf.jpg Bacillus cereus CCM 2012 Bacillus mycoides CCM 145 C:\Documents and Settings\UserXP\Dokumenty\škola\podzim 2012\cytologie a morfologie bakterií\cviko\cvičení1\1_cviceni_gram_negativni_fazovy\bacili gramem\b_thuringiensis3_sv.jpg Bacillus thuringiensis CCM 19 Celkové zvětšení 1000x C:\Documents and Settings\UserXP\Dokumenty\škola\podzim 2012\cytologie a morfologie bakterií\cviko\cvičení1\1_cviceni_gram_negativni_fazovy\bacili gramem\b_sphaericus_lf.jpg C:\Documents and Settings\UserXP\Dokumenty\škola\podzim 2012\cytologie a morfologie bakterií\cviko\cvičení1\1_cviceni_gram_negativni_fazovy\bacili gramem\b_megaterium_ah.jpg Celkové zvětšení 1000x Bacillus sphaericus CCM 1615 Bacillus megaterium CCM 2007 žgrampozitivní, fakultativně anaerobní nebo mikroaerofilní tyčky nebo kokotyčky žuspořádání v palisádách nebo krátkých řetízcích žstriktně fermentativní typ metabolizmu žnetvoří spory žvětšinou jsou nepohyblivé a neprodukují pigmenty žkomplexní nutriční požadavky žoptimální teplota 30 – 40 °C žoptimální pH 5,5 – 6,2 žv potravinách živočišného i rostlinného původu, nápoje, znečištěná voda, kysané zelí, mikroflóra teplokrevných žkataláza negativní C:\Documents and Settings\UserXP\Dokumenty\škola\podzim 2012\cytologie a morfologie bakterií\cviko\cvičení1\1_cviceni_gram_negativni_fazovy\negativni\powerpoint\lactobacillus_brevis_i i_ij.jpg C:\Documents and Settings\UserXP\Dokumenty\škola\podzim 2012\cytologie a morfologie bakterií\cviko\cvičení1\1_cviceni_gram_negativni_fazovy\negativni\powerpoint\l_casei_pr.jpg C:\Documents and Settings\UserXP\Dokumenty\škola\podzim 2012\cytologie a morfologie bakterií\cviko\cvičení1\1_cviceni_gram_negativni_fazovy\negativni\powerpoint\l_curvatus2_lf.jpg Lactobacillus curvatus CCM 7558T Lactobacillus brevis CCM 3805T - Tvorba řetízků méně častá Lactobacillus casei subsp. casei CCM 7088T Celkové zvětšení 1000x tvorba krátkých řetízků C:\Documents and Settings\UserXP\Dokumenty\škola\podzim 2012\cytologie a morfologie bakterií\cviko\cvičení1\1_cviceni_gram_negativni_fazovy\negativni\powerpoint\lactob_delbrueckii_2_m z.jpg C:\Documents and Settings\UserXP\Dokumenty\škola\podzim 2012\cytologie a morfologie bakterií\cviko\cvičení1\1_cviceni_gram_negativni_fazovy\negativni\powerpoint\l_rhamnosus_ah_ii.jpg Lactobacillus rhamnosus CCM 1825T Celkové zvětšení 1000x delší tyčky dlouhý řetízek Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CCM 7190T C:\Documents and Settings\UserXP\Dokumenty\škola\podzim 2012\cytologie a morfologie bakterií\cviko\cvičení1\1_cviceni_gram_negativni_fazovy\gram\e_coli_ph.jpg Celkové zvětšení 1000x C:\Documents and Settings\UserXP\Dokumenty\škola\podzim 2012\cytologie a morfologie bakterií\cviko\cvičení1\1_cviceni_gram_negativni_fazovy\gram\lact_curvatus_lf.jpg Lactobacillus curvatus CCM 7558T G+ tyčinka Escherichia coli CCM 3954 G- tyčinka žJasné pole: C:\Documents and Settings\UserXP\Dokumenty\škola\podzim 2012\cytologie a morfologie bakterií\cviko\cvičení1\1_cviceni_gram_negativni_fazovy\demonstracni\mikroko_coli_havl.jpg Micrococcus luteus CCM 169 + Escherichia coli CCM 3954 C:\Documents and Settings\UserXP\Dokumenty\škola\podzim 2012\cytologie a morfologie bakterií\cviko\cvičení1\1_cviceni_gram_negativni_fazovy\negativni\b_sphaericus_lf.jpg Bacillus sphaericus CCM 1615 žFázový kontrast C:\Documents and Settings\UserXP\Dokumenty\škola\podzim 2012\cytologie a morfologie bakterií\cviko\cvičení1\1_cviceni_gram_negativni_fazovy\fazovy\b_sphaericus.jpg Bacillus sphaericus CCM 1615 C:\Documents and Settings\UserXP\Dokumenty\škola\podzim 2012\cytologie a morfologie bakterií\cviko\cvičení1\1_cviceni_gram_negativni_fazovy\fazovy\micrococus_luteus_a_mycobacterium_ph lei_ad1.jpg Micrococcus luteus CCM 169 + Mycobacterium phlei CCM 5639