Simona Valášiková, jeseň 2012 logo.jpg 1) MAKROFOTO —U izolovaných mikrobiálnych kolónií môžeme v rámci —makroskopickej morfológie hodnotiť ich: •tvar: okrúhly, nepravidelný (laločnatý, zvlnený,...) •farbu: bezfarebná, pigmentovaná •profil: plochý, zvýšený, vypuklý, pupkovitý, gombíkovitý •okraje: hladké, vrúbkované, zubaté, rhizoidné, vláknité •povrch: hladký, lesklý, matný, drsný •transparenciu: priehľadná, priesvitná, nepriehľadná — Makrofoto vybraných MO z úlohy IX. Azotobacter vinelandii CCM 289 veľkosť kolónií: stredne veľké povrch: lesklý okraje: pravidelné (hladké) profil: zvýšený farba: žltozelená Sporosarcina ureae CCM 860 veľkosť kolónií: drobné povrch: matný okraje: pravidelné (hladké) profil: plochý farba: béžová Leuconostoc mesenteroides CCM 1803 veľkosť kolónií: obrovské (nie izolované) povrch: lesklý okraje: pravidelné (hladké) profil: zvýšený farba: hnedá + výrazný zápach DSCN2796.JPG DSCN2801.JPG DSCN2802.JPG Makrofoto zástupcov rodu Bacillus DSCN2778.JPG DSCN2791.JPG DSCN2792.JPG DSCN2823.JPG DSCN2828.JPG DSCN2836.JPG B. megaterium CCM 2007 B. sphaericus CCM 1615 B. mycoides CCM 145 B. subtilis CCM 2216 B. thuringiensis CCM 19 B. cereus CCM 2010 Makrofoto zástupcov domény Bacteria, Archaea a kvasiniek (eukar.org.) DSCN2750.JPG DSCN2767.JPG DSCN2812.JPG kvasinka: Saccharomyces cerevisiae Archaea: Haloarcula hispanica CCM 3601T Bacteria: Serratia marcescens CCM 303 2) MIKROSKOPICKÉ PREPARÁTY —Niektoré morfologické znaky mikroorganizmov je potrebné posudzovať v mikroskopickom preparáte. —Pre posúdenie skutočného tvaru živej bunky a štruktúry buniek neporušených fixáciou a farbením, ďalej na pozorovanie rastu, množenia a pohybu baktérií apod. pripravujeme natívny preparát. —Farbené preparáty sa využívajú pri zisťovaní typu BS, tvaru buniek a usporiadania ich zhlukov, prítomnosti a uložení spor, púzdier a inklúzií a taktiež pri zisťovaní životaschopnosti buniek. —Medzistupeň medzi vitálními a fixovanými preparátmi tvorí pozorovanie nesfarbených buniek na kontrastnom pozadí, čo nám umožňujú negatívne farbené preparáty. Využívajú sa pre meranie presnej veľkosti buniek nedeformovaných fixáciou a farbením. Nefarbíme bunky, ale ich okolie (napr. nigrosinom). — — — Gramovo farbenie je jednou z najdôležitejších diagnostických metód pri identifikácii baktérií – rozlišuje baktérie — → grampozitívne, ktoré sa farbia modrofialovo — → gramnegatívne, ktoré sa farbia červenoružovo. —Podstata grampozitivity tkvie v odlišnom zložení bunkovej steny. —Jedná sa o farbenie fixovaného preparátu a následné morenie buniek roztokom jódu. Vzniká komplex farbivo-jód-BS, ktorý sa tvorí v G+ aj v G- baktériách. Rozdiel vzniká pri premývaní preparátu alkoholom, z G- sa komplex vymýva (odfarbujú sa) a G+ si sfarbenie ponechávajú (komplex zostáva zachytený v BS). Pre zvýraznenie rozdielu sa G- baktérie dofarbujú kontrastným farbivom. —U gramlabilných MO je Gramova reakcia závislá na fyziologickom stave bunky a na zložení kultivačného prostredia. Gramova reakcia je najspoľahlivejšia u mladej bakteriálnej kultúry (˂ 24h), staršie kultúry nemusia zadržovať primárne farbivo a výsledky nie sú presné. — Gramovo farbenie —Úloha č. 9: G+ koky alebo krátke tyčinky — — — — — — — — — — —Azotobacter vinelandii Leuconostoc mesenteroides Sporosarcina ureae —G- krátke tyčinky G+ koky (diplokok) G+ koky (tetrády, balíčky) —CCM 289, zv 1000x CCM 1803, zv 1000x CCM 860, zv 1000x — — azotobacter2_sv.jpg leuconostoc_sv.jpg sporosarcina_ureae2_sv.jpg Preparáty farbené podľa Grama —Úloha č. 1: Porovnanie rôznych tvarov bakteriálnych buniek v — rámci jedného rodu, Gramovo farbenie → Bacillus — — — — — — — Bacillus mycoides CCM 145 — Bacillus cereus CCM 2010 — — —Bacillus megaterium CCM 2007 — — — — — — — Bacillus thuringiensis CCM 19 Bacillus sphaericus CCM 1615 b_megaterium_ah.jpg b_mycoides2_lf.jpg b_sphaericus2_lf.jpg b_thuringiensis3_sv.jpg b_cereus_hp.jpg —Negatívne farbenie —→ Bacillus — — —Bacillus megaterium CCM 2007 Bacillus cereus CCM 2010 — — — — — — — — — — — Bacillus sphaericus CCM 1615 Bacillus mycoides CCM 145 b_cereus_kk_iii.jpg b_megaterium_ah_ii.jpg b_mycoides2_lf.jpg b_sphaericus_lf.jpg —Negatívne farbenie → G+ koky — — — — — — — — — — Leuconostoc mesenteroides CCM 1803 Sporosarcina ureae CCM 860 — dvojice, retiazky tetrády leuconostoc_mesenteroides_3_sv.jpg sporosarcina_ureae_sv .jpg 3) MIKROSKOPICKÉ TECHNIKY —Mikroskopické preparáty môžeme pozorovať: —v jasnom poli (farbené preparáty) —vo fázovom kontraste (natívne preparáty) —v Nomarského kontraste (natívne preparáty) — —Fázový kontrast •Obraz je vytvorený interferenciou lúčov fázovo posunutých aj neposunutých (závisí na indexe lomu prostredia) •Rozdiely vo fázi svetla sú prevedené na zmenu kontrastu •V hustej absorbujúcej časti preparátu dôjde k čiastočnej absorbcii vlnovej dĺžky a ku zmene amplitúdy, čo zachytíme jako zmenu intenzity svetla → vidíme ju jako svetlú •Umožňuje pozorovať živé objekty v natívnom stave bez farbenia, zviditeľňuje žiariace bakteriálne spóry • — b_thuringiensis_sp2.jpg b_thuringiensis2_sv.jpg corynebacterium_glutamicum1_ad.jpg corynebacterium_glutamicum_ad1.jpg mycobacterium_phlei_micrococcus_ii_ij.jpg micrococus_luteus_a_mycobacterium_phlei_ad.jpg Bacillus thuringiensis CCM 19 Corynebacterium Micrococcus luteus CCM 169 glutamicum CCM 2428 jasné pole (Gram.f.) jasné pole (Gram.f.) jasné pole (Gram.f.) fázový kontrast fázový kontrast fázový kontrast Bacillus thuringiensis CCM 19