Protokol č.1 Petra Řezáčová Mikroskopická a makroskopická morfologie Teorie Makrofota - sledování morfologie kolonií •Velikost (průměr; mm) •Tvar – okrouhlý, zvlněný, laločnatý, sektorovitý •Profil – plochý, zvýšený, vypouklý, pupkovitý, knoflíkovitý, bradavčitý •Okraje – vroubkované, zubaté, s koncentrickou stavbou, zvraštělé, myceliální, drsné (prstovité), vláknité, rizoidní, hladké •Povrch – lesklý x matný •Transparence •Barva Preparáty Fázový kontrast - možnost pozorování živých objektů – nativní preparát bez barvení - při průchodu světelné vlny objektem se vlna zpozdí, nemění však intenzitu ani amplitudu, ale posune se její fáze – o 90° - v objektivu se mění fázová korelace, kterou nejsme schopni vnímat okem, mění na korelaci amplitudovou - čtvrtfázová destička - struktury s vyšším n (hustší část buňky) se jeví světle (např. endospory září) Jasné pole: pozorujeme barvené preparáty Gramovo barvení Postup: Připravíme nátěr bakteriální kultury, vysušíme a fixujeme plamenem. Preparát ponoříme do krystalové violeti na 30 sec. Opláchnout vodou. Preparát ponoříme do Lugolova roztoku na 30 sec – mořidlo. Opláchnout vodou. Preparát odbarvujeme etanolem či acetonem 20-30 sec. Opláchnout vodou. Preparát ponoříme do safraninu na 30-60 sec. Opláchnout vodou, osušit, pozorovat Negativní barvení - barvení preparátu, který se nefixuje a nebarvíme na něm buňky, ale jejich okolí (tedy sklíčko samotné; např. nigrosinem) - využívá se pro měření přesné velikosti buněk nedeformovaných fixací a barvením corynebactreium_glutamicum_ad Corynebacterium glutamicum CCM 2428 G- mycobacterium_phlei_micrococcus_ij G+ Micrococcus luteus CCM 169 diplokok MAKROFOTA KOLONIÍ Micrococcus luteus CCM 169 Nocardia carnea CCM 2756 Serratia marcescens CCM 303 Escherichia coli CCM 3954 Leuconostoc mesenteroides CCM 1803 Sporosarcina ureae CCM 860 Streptomyces griseus ssp. griseus CCM 2386 Saccharomyces cerevisiae I) Srovnání v rámci jednoho rodu a) G+ tyčky různé tvary, bacily 48h kultivace se sporami: Bacillus thuringiensis CCM 19 Bacillus sphaericus CCM 1615 Bacillus mycoides CCM 145 Bacillus cereus CCM 2010 Bacillus megaterium CCM 2007 Bacillus subtilis CCM 2216 Lactobacillus curvatus CCM 7558T – zakřivené Lactobacillus rhamnosus CCM 1825T – typické tyčky Lactobacillus casei subsp. casei CCM 7088T - zakřivené Lactobacillus brevis CCM 3805T – krátké tyčky b) pokud bacilární – hledáme spory, fázový kontrast PREPARÁTY - pozorováno pod imerzí - zvětšení 1000x G+ tyčky Rod Bacillus MAKROFOTA - KOLONIE Bacillus sphaericus CCM 1615 Bacillus cereus CCM 2010 B Bacillus thuringiensis CCM 19 B Bacillus mycoides CCM 145 B B Bacillus megaterium CCM 2007 Bacillus subtilis CCM 2216v FÁZOVÝ KONTRAST b_megaterium_48h_spora_terminalni_kulata_ii b_cereus_spory_ii Bacillus cereus CCM 2010 Bacillus megaterium CCM 2007 b_mycoides_retizek Bacillus subtilis CCM 2216v b_subtilis_spora_oval_subterminal_ii Bacillus mycoides CCM 145 b_thuringiensis b_sphaericus_spory Bacillus sphaericus CCM 1615 Bacillus thuringiensis CCM 19 Spora kulatá terminální Spora kulatá terminální vyklenující Spora oválná centrálně Spora oválná subterminálně Spora oválná subterminálně b_thuringiensis3_sv b_mycoides2_lf b_sphaericus_lf GRAMOVO BARVENÍ b_cereus_hp b_megaterium_ah_ii Bacillus megaterium CCM 2007 Bacillus thuringiensis CCM 19 Bacillus mycoides CCM 145 Bacillus sphaericus CCM 1615 Bacillus cereus CCM 2010 b_sphaericus2_lf b_mycoides_lf b_megaterium_ah b_cereus_kk_iii Bacillus sphaericus CCM 1615 Bacillus mycoides CCM 145 NEGATIVNÍ BARVENÍ Bacillus cereus CCM 2010 Bacillus megaterium CCM 2007 MAKROFOTA - KOLONIE Lactobacillus brevis CCM 3805T Lactobacillus curvatus CCM 7558T G+ tyčky Rod Lactobacillus lactobacillus_brevis_iii_ij l_curvatus2_lf l_casei_ii_pr NEGATIVNÍ BARVENÍ Lactobacillus curvatus CCM 7558T Lactobacillus brevis CCM 3805T Lactobacillus casei subsp. casei CCM 7088T l_rhamnosus_ah Lactobacillus rhamnosus CCM 1825T V) Eukaryota Saccharomyces cerevisiae – kvasinka, eukaryotní buňka MAKROFOTO - KOLONIE GRAMOVO BARVENÍ s_cerevisiae_pr s_cerevisie_ii_pr NEGATIVNÍ BARVENÍ • Tvar: okrouhlý • Profil: knoflíkovitý • Okraje: hladké • Povrch: matný • Transparence: neprůsvitná • Barva: bílá až béžová pučení VI) Vliv media na morfologii buňky Streptococcus mutans CCM 7409T z krevního agaru a z tekutého media (jednou tyčky, jednou koky) GRAMOVO BARVENÍ steptococcus_mutans_kontaminace_pr streptococcus_mutans_krev_pr Krevní agar Tekuté médium NEGATIVNÍ BARVENÍ s_mutans_tekute_ii_pr s_mutans_krev_pr Tekuté médium Krevní agar kontaminace Srovnání eukaryot s prokaryoty s_cerevisiae_pr s_cerevisie_ii_pr Saccharomyces cerevisiae – kvasinka, eukaryotní buňka arthrobacter_kk_19h_i Arthrobacter crystallopoietes CCM 2386 arthrobacter_hp_19h_i GRAMOVO BARVENÍ NEGATIVNÍ BARVENÍ