Morfologické a cytologické znaky


  * pomáhají IDENTIFIKACI (rod i druh, př: plísně, mikrokoky - pigment)
  * pomocí nich se provádí kontrola kontaminace kultury (posuzujeme dva či více odlišných nárustů)
  * posouzení fyziologického stavu kultury


 - makroskopické morfologické znaky:  popis kolonií

 - mikroskopické cytologické znaky – jen mikroskopické (vnitřní struktury, i preparace: fixace,
barvení..); nativní preparát (pozorování fázovým kontrastem) barvené preparáty (zviditelní
morfologii buňky a jejích struktur: Gramovo, Ziehl Nielsenovo, strukturální barvení)


Makroskopické a mikroskopické znaky se hodnotí pospolu!


 I. Morfologie – makroskopické znaky

Bakteriální druh – vzhled kolonie ovlivněn - typem živné půdy!!

                                                                      - stářím kultury

Sledování znaků na mediích: MPB, MPA; kvasinky, plísně – sladina.

Sledování kolonií vždy výhodné doplnit mikroskopií.


a) charakter růstu v tekuté půdě – statická kultivace

V různých typech růstu mají buňky jinou morfologii, jiné složení buněčné stěny tedy jiné
imunologické vlastnosti


typy růstu v tekutých mediích:
  * difúzní zákal – po celém mediu, aerobní
  * hrubé vločky – aerobní; Staphylococcus, některé bacily (dáno stěnou b.)
  * sedliny – fakultativně anaerobní – Lactobacillus, kvasinky
  * blanka – znamená špatnou smáčivost buněk či mycelia a džení vrstvičky silou povrchového napětí
(předpřidané povrchově aktivní látky tenzidy - by tedy způsobily ponoření blanky; neionogenní
tenzidy – neinhibující množení – způsobí difúzní růst blankotvorných buněk); vyskytuje se u buněk
tvořících většinou drsné vrásčité kolonie, aerobních; vzhled kožovitý (plísně), suchý vrásčitý křís
(oxidativní kvasinky); u stárnoucí kultury blanka sedá.

Pozn.: „mázdra“ = povrchový útvar sedlinotvorných kvasinek, které kvašením vyčerpaly sacharidy a
počaly aerobně využívat vlastní vyprodukovaný ethanol.


          b) charakter růstu na šikmém agaru

Jak postupovat, abychom na šikmý agar naočkovali kulturu nejvhodněji pro pozorování: používáme
předsušený agar (odpadá problém s kondenzační vodou). Rozdíl oproti uchovávání buněk na  šikmém
agaru, kdy je naopak voda žádoucí – vlhkost).


            Očkovat nejlépe: jehlou (ne klička – příliš široká) rovná čára.

Kultivace: 24-48h (kvasinky 2-3 dny)


Takto můžeme posoudit rychlost růstu, tvar nátěru: rovný plný, bodový, ostnitý, rhizoidní; profil
nátěru – plochý, vypouklý); povrch nátěru – lesklý, drsný, suchý; konzistenci; pigmenty;
exopigmenty - porovnejte rozdíl


c) Popis kolonie bakteriálního druhu

Kolonie je klon buněk narostlý z jednotlivé buňky očkovaného kmene

Zjišťujeme: viz příloha „Morfologie kolonií“.

Nerovnosti růstu – stářím kolonie.

Mukoidní (M) charakter růstu – vlhké slizovité a velmi lesklé kolonie tvořené opouzdřenými buňkami
(Azotobacter, Leuconostoc).

Hladké (S) kolonie – rovný okraj s leskem nebo bez lesku u neopouzdřených buněk.

Drsné (R) kolonie – suché s nerovnými okraji, liší se výškou vrásnění, rostou tak buňky tvořící
řetízky, mycelia či pseudomycelia (Bacillus; kvasinky Pichia, Hansenula, Candida; Trichosporon).


Změny M – S – R jedny v druhé jsou důsledkem mutací.


Př: infekční materál – většinou M-kmeny; po několika přeočkováních změna v S-kmeny. Z nich M-forma
zpátky těžko získatelná!


Mohou mít R genotypy hladké kolonie??:

 - Fenotyp S, M a R je ovlivněn složením media. Př: přítomnost 1) 20% zkvasitelných sacharidů
podporuje S a M typy, R typy jsou na něm hladší. 2) Tenzidy způsobují hladké až lesklé fenotypy R
typů.


d) Obrovské kolonie kvasinek a plísní

Kvasinky se očkují na vyšší vrstvu sladiny kapkou suspenze mladších buněk ve fyziologickém roztoku
přeneseného očkovací kličkou.

Papily = vznik a pomnožení některých mutantů.

Sektory – genetická nejednotnost, sporulace.


e) Růst ve vpichu šikmého agaru MPA (u bakterií)

Určuje nároky MO na kyslík: aerobní MO rostou v horní části vpichu, anaerobní u dna a FANA po celé
délce vpichu.

Jaké je stáří očkované kultury? Inokulum je 24h bujonová kultura.


II. Morfologie a cytologie – mikroskopické znaky

  * hodnotí se TVAR, VELIKOST a USPOŘÁDÁNÍ buněk, přítomnost zvláštních „orgánů“ na buňce, způsob
rozmnožování viditelný v preparátu


Jakou podobu může mít mikroskopický preparát, který pod mikroskopem hodnotíme??

 - klasické podložní sklíčko, na kterém provádíme diferencovné barvení buněk samotných, či jejich
složek, či rozlišujeme živé a mrtvé buňky u vitálního testu (barvení netoxickými barvivy obarví
buňku mrtvou, která se již nebrání přijetí barviva); pro úplnost můžeme dodat, že preparát na
podložním sklíčku je při barvení buněk většinou fixován (v plameni)

 - u nativního preparátu (pozorování suspenze) na podložní sklíčko přikládáme krycí sklíčko

 - při pozorování plísní, kvasinek či aktinomycet pozorujeme sklíčkové kultury (krycí sklíčko je
vytaženo z agaru, ve kterém bylo během kultivace zapíchnuto pod úhlem 45˚a je tudíž kulturou
porostlé - hodnotí se pak na něm najednou substrátové i vzdušné mycelium) nebo kultury narostlé na
celofánu (některé kultury prorůstají medium, jsou těžko pro pozorování odejmutelné, na celofánu se
s nimi snadno manipuluje).




Zdroje:

Šilhánková, Demnerová (1993): Návody pro laboratoře z mikrobiologie, VŠCHT, Praha

http://vydavatelstvi.vscht.cz/knihy/uid_es-006/index.html

http://biomikro.vscht.cz/sylaby/biochmikrorg.htm

Zkratky:

b. - buňka, bakterie

MO – mikroorganismus

MPA – masopeptonový agar

MPB – masopeptonový bujon

FANA – fakultativně anaerobní