Cvičení 3


Téma: pohyb buněk



Salmonella typhimurium,

Chi Aizawa, Teikyo University

Náplň cvičení:


-         porovnat pohyb buněk Microccocus luteus - Brownův pohyb (nativní preparát; Nomarského
kontrast)

-         barvení bičíků – fázový kontrast

-         očkování do polotekutého media – na misky i do zkumavek (sterilní umělohmotnou kličkou)



Mikroorganismy – mladé kultury (4hodinové nebo 16ti hodinové)


Bacillus cereus CCM 2010 - 16ti hodinová kultura; peritrichum

P. fluorescens CCM 2115T - 16ti hodinová kultura, monotrichum

Proteus vulgaris CCM 1799 - 16ti hodinová kultura, peritrichum

E. coli CCM 3954 - 16ti hodinová kulturaů peritrichum

Micrococcus luteus CCM 169 – pro srovnání nativního preparátu



POZOROVÁNÍ BIČÍKŮ


Pozorování pohybu bičíku

- visutá kapka

        nativní preparát

- kapka suspenze buněk v mediu na podložní sklo, nepřekrývat krycí, pozorování objektivem 20,
nezanořovat!! Nomarského kontrast. Pro vitalitu buněk je důležitý dostatek kyslíku (citlivější
buňky se hýbou jen nahoře). Je nutno opatrně proostřovat na horní část kapky – dostatek O[2]

- nesmí se pracovat se skleněnými předměty (krom sklíček), př: skleněná tyčinka bičíky ulamuje (na
sklíčko opatrně nanášet umělohmotnou pasteurkou, opatrně překrývat krycím sklíčkem), práce
s mladými kulturami 4-16hodin!! pozorování vždy z tekutého media


Barvení bičíků:

Závisí na způsobu kultivace. Kultivace buněk vhodná v tekutém mediu.

Staré buňky odhazují bičíky.


         Fixace, speciální barvicí metody pro světelný mikroskop. Barvička obsahuje

         mořidlo tanin, které se obalí kolem bičíku, jeho průměr se znásobí a zviditelní.

         Postup:

a)      opatrně připravíme nativní preparát na odmaštěné podložní sklíčko

b)      opatrně překryjeme krycím sklem

c)      vedle krycího sklíčka kapka barvičky

d)      prosajeme filtračním papírem

e)      pozorování pod imerzí

Barvička na barvení bičíků: roztok I (10 dílů) a II (1díl), zamražený

Roztok I: 10ml 5% vod.roztoku fenolu, 2g taninu, 10ml Kal (SO[4])[2] . 12 H[2]O

Roztok II: nasycený roztok krystalové violeti (12g) v ethanolu (10ml, 96%)


(Pozn: Elektronová mikroskopie - negativní barvení, otiskové preparáty po rychlém zmražení na -150
°C)


Agar na testování pohybu:

            Obsahuje nízké množství agaru – je to polotekuté medium (nižší viskozita prostředí). Na
polotekutý agar se očkuje vždy jen do středu misky, aby se rozrůstala 1 kolonie. Nejlépe kličkou,
trošku zanořit do agaru. Pohyblivé kultury udělají rozrůstající se kruh, někdy vlnící se.
Nepohyblivé rostou jen v místě vpichu do určité velikosti. Výsledky za 3-5 dní.

Složení do 100ml deminerailzované vody: yeast extract (0,1g), K[2 ]HPO[ 3 ](0,01g), agar (0,2g). S
miskou se nesmí hýbat.


Textové pole: Proteus mirabilis •Solidní střed •Povlak •Konsolidovaná zóna •Terasy





motility test medium, polotekuté

Pohyblivý kmen roste i mimo inokulaci – v celém mediu


Dynamika růstu kolonie:

Periodicita migrace


•Diferenciace plazivých buněk

•Lag perioda předcházející migraci

•Migrace plazivých buněk

 Dediferenciace

•Konsolidace






Způsob šíření

1.Posuvem
z konsolidovaného okraje kolonie, kde jsou buňky již diferencovány a lem je organizován


2.Volným putováním
z populace vegetativních buněk, kde začíná diferenciace





Swarmers;
plazivé buňky

Swimmers;
plovoucí (vegetativní) buňky)