Sklíčkové kultury


Sterilní očkování ve FLOW-BOXU – pozor na kontaminaci

Práce s vyžíhanou kličkou, vyžíhanou pinzetou


Sledování morfologie vláknitých struktur, pozorování celé kolonie.

Pro pozorování hyf a rozpadajících se vláken u nokardioformních aktinomycet a streptomycet
zhotovujeme sklíčkové kultury. Přímým přenesením kousku mycelia by došlo k porušení struktur a
preparát by byl nepoužitelný.

Nokardioformní aktinomycety i streptomycety vytváří charakteristické kolonie: většinou drsný povrch
(pozn.: Rhodococcus někdy lesklý, zejm.klinické izoláty), vrásčitý, pigmentace. Při kultivaci
v tekutém mediu nutná aerace; kultury vytváří shluky (oproti ostatním druhům bakterií – které
vykazují rovnoměrný růst v tekutém mediu).


Mikroorganismy:


Rhodococcus  erythropolis  CCM 277

Nocardia carnea CCM 2756

Streptomyces griseus ssp. griseus CCM 3362



Postup:


v  Vlhké komůrky – kultivace na podložním sklíčku


1)      Pracujeme ve FLOW-BOXU.

Použijeme sterilních Petriho misek s kuličkami a podložním sklem. Na podložní sklíčko vyžíhaným
skalpelem umístíme tenký čtvereček agaru (agar dle kultivovaného mikroorganismu,  Nocardia: medium
M8, Rhodococcus: medium M12, Streptomyces: medium M15). Vyžíhanou kličkou zaočkujeme podél okrajů a
překryjeme sterilním krycím sklíčkem 18x18 až 22x22mm. Pod podložní sklíčko, na kuličky, sterilni
pasteurkou napipetujeme cca 5ml sterilní destilované vody. Misku popíšeme a kultivujeme při 30°C
3-5dní.

Agar je tenký – substrátové mycelium lze pozorovat pod imerzí – dostatečná průhlednost.


2)      Nebo: Horký agar kápnout přímo na podložní sklíčko, po zatuhnutí zaočkovat, Kultivace bez
krycího skla


      Kultivace 30°C, pozorování 3-5 dní, (někdy: dobře vyvinuté V.M. 7-14dní)

Pozorování: přímo nárust na sklíčku, zvětšení 200x  nebo 400x, Nomarského kontrast

Limitováno: zvětšením



v  Kultivace na krycím sklíčku


Pracujeme ve FLOW-BOXU.

Medium dle očkovaného kmene - silnější agar na Petriho misce. Do něj vyžíhanou pinzetou pod úhlem
45° zapíchneme sterilní krycí sklíčko. Kulturu naočkujeme z horní strany podél žlábku.

Substrátové mycelium prorůstá i agar.

Před pozorováním výsledků - po uplynutí 3-5ti dnů - vytáhneme sklíčko a označíme horní i dolní
stranu – rozpoznání vzdušného a substrátového mycelia.

Pozorování: sklíčko s narostlou kulturou položíme nárustem dolů na podložní sklíčko. Pozorujeme
1000x pod imerzí, Nomarského kontrast.



v  Makrofoto kultivovaných kmenů


Nokardioformní aktinomycety – skupina obsahující v PG kyselinu meso-DAP:


Nocardia, Rhodococcus, Gordonia, Tsukamurella...


Název odvozen od nestálého mycelia oddělujícího se do kokovitých částic

G+, aerobní. Acidorezistence 2.stupně (mykolové kyseliny; 1% HCl)

Starší kultury: rozpad mycelia. Někteří zástupci (Nocardia, některé druhy rhodokoků) tvoří vzdušné
mycelium. Někteří tvoří řetízky spor.


Nocardia:

-         mírně nebo silně větvená vlákna vegetativního substrátového mycelia

-         mycelium se může rozpadat do tyčkovitých až kokovitých částic

-         tvoří vzdušné mycelium


Rhodococcus:

-         tyčinky, někdy silně větvené substrátové mycelium

-         vlákna rozpadavá do krátkých tyček, koků

-         vyjímečně vzdušné hyfy

-         kolonie drsné, ale i hladké, mukózní

-         pigmentace: žlutohnědá, oranžová, smetanová



Streptomycety


Streptomyces:

-         v b.s. kyselina L-DAP a glycin

-         trvalá vlákna, vzácně rozpadavá

-         větvené mycelium

-         spory v řetízcích, nepohyblivé

-         neacidorezistentní