Čipy pro analýzu genomu Karla Plevová 17.10.2014 Interní hematologická a onkologická klinika LF MU a FN Brno Centrum molekulární biologie a genové terapie CEITEC MU Analýza genomových změn  Detekce nebalancovaných genomových změn  amplifikace, delece – CNV – copy number variations  CGH čipy  Detekce uniparentální dizomie, genotypizace  SNP čipy  Detekce mutací, polymorfismů  Resekvenační čipy  Analýza epigenetických změn  ChIP on chip, čipy pro stanovení metylace, DNAse-chip Výchozí materiál - DNA  Kvantifikace DNA  Měření absorbance nukleotidů A260  Stanovení čistoty A260/A280 – 1.8-2.0 (<1,8 kontaminace proteiny) A260/A230 >2.0 (<2 kontaminace organickými látkami – guanidinium isothiokyanát, alkohol, fenol nebo jinými buněčnými komponentami – karbohydráty. Nanodrop – Malá spotřeba materiálu (1ul) – Plný spektrální rozsah 190–840 nm Výchozí materiál - DNA  Kontrola kvality DNA  Elektroforéza Cytogenetika na čipu CGH - komparativní genomová hybridizace Kohybridizace značené DNA vzorku a kontrolní DNA www.advalytix.com (Beckman Coulter) na sondy navázané na sklíčku  array CGH na normální metafázní chromozomy  Klasická CGH, HR-CGH  Metoda molekulární cytogenetiky Typy CGH  Klasická CGH (Kallioniemi et al 1992)  Rozlišení 5 -10 MB  Citlivost – 50% aberantních buněk  HR-CGH – High resolution CGH (Kirchhoff et al. 1998)  Pokročilý algoritmus analýzy obrazu  Vyšší rozlišení (~3 MB), vyšší citlivost  ArrayCGH (aCGH, matrix CGH) (Solinas-Toldo et al. 1997)  Vysoké rozlišení – závisí na typu čipu (1kb – 1MB)  Citlivost – 30-40% aberantních buněk http://web.ncifcrf.gov (NCI-Frederick) Rozdělení aCGH podle typu sond  Úseky genomové DNA vložené do vektorů  YAC (Yeast Artificial chromosome) – 200-1000 kb  BAC (Bacterial Artificial chromosome) – 50-200 kb  PAC (Phage Artificial chromosome) – 75-200 kb  Kosmidy – 30-40 kb  cDNA - 1-2 kb  Pouze genové oblasti  Horší schopnost detekce jednokopiových změn  Oligonukleotidy - 25-85 bazí Rozlišení aCGH  Rozlišení čipu je dáno délkou a hustotou pokrytí DNA sond  BAC ~ 1Mb  cDNA – 1-2 kb  Oligonukleotidy – i pod 1 kb Platformy aCGH  Celogenomové  Sondy rozmístěné po celém genomu v určitých intervalech  tilling arrays – přesné mapování delecí, zlomů  Chromozómové  Cílené  Analýza vybraných „hot spot“ oblastí spojených s konkrétním onemocněním  Tiling = „obklad“  Přesné mapování s vysokým rozlišením  aCGH, resekvenační, ChIP on chip, MeDIP-chip, DNAse-chip Tiling arrays Oligonukleotidové aCGH Agilent  Sondy 60 bazí, SurePrint technology – in situ synthesis printing  Různé formáty – vzdálenost sond určuje rozlišení  Lidský genom – 1x1M – rozlišení 2,1 kb/1,8 kb v RefSeq genech – 2x400K – rozlišení 5,3 kb/4,6 kb v RefSeq genech – 4x180K – rozlišení 13 kb/11 kb v RefSeq genech – 8x60K – rozlišení 41 kb/33 kb v RefSeq genech  Další organismy: myš, krysa, kráva, pes, kuře, šimpanz, makak Rhesus, rýže  Custom arrays Postup - Agilent 200-500 ng gDNA 50 ng gDNA Oligonukleotidové aCGH Roche NimbleGen  Sondy 60 bazí  Specifické aplikace  Cytogenetic Arrays - CGx  CNV Arrays  Whole Genome Tilinig Arrays  CGH Whole-Genome Exon-Focused Arrays  Formáty  4.2M, 2.1M, 3x1.4M, 3x720K, 6x630K, 12x270K, 12x135K, 385K, 4x72K (Chromosome Tiling)  Další organismy: myš, krysa, kráva, pes, kuře, makak Rhesus, Caenorhabditis elegans, Drosophila, Zebrafish, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Plasmodium falciparum Výsledky aCGH delece 9p izochromozom 17 Monoalelická delece a krátká bialelická Delece + amplifikace SNP čipy  Čipy umožňující rozlišit nejen CNV, ale i SNP  SNP – jednonukleotidové polymorfismy  V lidském genomu asi 15 mil identifikovaných polymorfismů  Asociace s onemocněními (Polymorfismus vs mutace)  Určení stavu alel, haplotypu  Genotypizace, asociační studie  Detekce ztráty heterozygotnosti/uniparentální disomie www.marshall.edu Uniparentální disomie (UPD) / ztráta heterozytosity mutace monosomie trisomie UPD Normální karyotyp * CNN LOH – copy number neutral loss of heterozygozity  Vyskytuje se u řady onemocnění  Somatická vs germinální  Heterodisomie vs isodisomie Princip SNP čipů  Sondy pro detekci CNV jako u CGH čipů + sondy speciálně navržené pro detekci SNP  Pro analýzu SNP není testovaná DNA srovnávána s kontrolní DNA  Vyhodnocení CNV  srovnání s kontrolní DNA hybridizovanou na jiném/stejném čipu  porovnání s daty uloženými v softwaru - soubor kontrolní DNA Affymetrix  SNP6  Délka sond 25 bazí  946 000 CNV sond, 906 600 SNP sond  Nerovnoměrné rozložení sond – více v genech  Vyšší rozlišení pro UPD, vhodné pro genotypizaci  CytoScanHD  Délka sond 49 bazí  2.6 millionu CNV sond z toho 750,000 "genotype–able" SNPs  Vzdálenost sond v genových oblastech 0,4-0,8kb  Detekce oblastí identických původem  Stanovení mozaicismu  OncoScan FFPE  Pro degradovanou DNA z parafinových bločků (FFPE – formalin fixed parafin embedded)  ~900 nádorově asociovaných genů  Detekce LOH, CNN LOH + některé somatické mutace Princip SNP čipů - Affymetrix 25b sondy záměna 13. nukleotidu největší vliv na sílu vazby při neshodě Postup - SNP6 500 ng gDNA Illumina Bead array  BeadChip  Více formátů  4, 12, 24 vzorků na čip  300 tis - 2,45 mil markerů Princip SNP čipů - Illumina 2X 50b, allele specific extension 1x 50b, single base extension; pouze A/G, A/C, T/C, T/G (dvoubarevná metoda) T* A* C* G* Infinium HD Agilent  Human Genome CGH+SNP Microarrays  2x400K, 4x180K  60b, SNPs pouze v místech rozpoznávaných restrikčními endonukleázami Princip SNP čipů - Agilent Bluegnome  CytoSNP - 850K  24sure – PGS  Preimplantační screening – detekce aneuploidií všech 24 chromosomů  24sure+ - PGD  Preimplantační genetická diagnostika – screening emryí nositelů reciprokých translokací  Další specifické  Cytochip-focus – špatná kvalita DNA – amniocentéza, odběr choriových klků  CytoChip Cancer  CytoChip ISCA (The International Standards for Cytogenomic Arrays) Výsledky SNP arrays – analýza CNV SNP Array → amplifikace + delece Výsledky SNP arrays – analýza CNV monoalelická + bialelická delece Výsledky SNP arrays - CNN LOH Výsledky SNP arrays - chromothripse Výsledky SNP arrays – identifikace oblastí identických původem (stanovení konsanguinity) Glykogenóza, typ III autozomálně recesivně dědičné onemocnění, mutace v genu AGL (enzym účastnící se degradace glykogenu) Výsledky SNP arrays - genotypizace SNP Array → Využití CGH, SNP čipů  Nádorová genomika  V nádorových buňkách často změny genomu – primární i sekundární  Klinická genetika  Přesnější charakterizace mikrodelečních syndromů  Identifikace genomových změn u pacientů s mentální retardací i jinými vrozenými postiženími  Prenatální a preimplantační diagnostika  Asociační studie – asociace SNP i CNV s řadou onemocnění (revmatoidní artritida, diabetes, nádorová onemocnění)  Farmakogenomika  Evoluční studie Resekvenační čipy  Paralelní sekvenace více oblastí  Detekce mutací, na které je čip navržen  Screeningová metoda  Komerčně dostupné „diagnostické“ čipy  Roche – platforma Affymetrix  Cytochrom P450 – FDA approval, CE-IVD  Amplichip P53  Není nutné ověřovat výsledek  Jen 1 gen, ale velmi rychlé (protokol max 2 dny)  APEX  Dostupné čipy pro konkrétní geny + možný vlastní design  Nutné ověřit Sangerovým sekvenováním  Research use only Resekvenační čipy - Affymetrix  Stejný princip jako detekce SNP  Krátké oligonukleotidy – 25mery  Typizovaná báze na 13. pozici  SNP array – 4 sondy na jeden SNP X resekvenování – 8 sond na jednu pozici Resekvenační čipy Affymetrix - princip Resekvenační čipy Affymetrix - princip Resekvenační čipy Affymetrix - princip Resekvenační čipy Affymetrix - princip Resekvenační čipy Affymetrix  Sekvenace mnoha kb současně  Citlivost - 10-25% mutovaných alel ve vzorku  Problematické oblasti – GC bohaté, repetitivní Format 49 100 169 Sequence Capacity 300 kb 100 kb 50 kb Resekvenační čipy - postup 100 long range PCR ~ 5kb Protokol - 3 dny Resekvenační čipy - výstup Nutné ověřit sangerovým sekvenováním Resekvenační čipy APEX  Arrayed Primer EXtension  Prodloužení sondy o jeden nukleotid komplementární ke vzorku  4-barevná technologie – nutné speciální vybavení Epigenomika na čipu  ChIP on chip  MeDIP-chip  DNAse-chip  Studium regulačních oblastí genomu  Na čipu sondy pro sekvence promotorů, enhancerů, silencerů, responzivních elementů  Tilling arrays ChIP on chip  Chromatin immunoprecipitation on chip  Mapování vazby proteinů na DNA  Studium vazebných míst transkripčních faktorů,… ChIP-on-chip MeDIP-chip  Methyl-DNA immunoprecipitation  Detailní mapování metylace celého genomu  DNA metylována na cytosinu v CG dinukleotidech – regulace genové exprese  Imunoprecipitace s protilátkou proti 5-metyl-cytosinu MeDIP-chip DNAse-chip  Mapování míst bez nukleosomů – otevřený chromatin, transkripčně aktivní  Hypersensitivní ke štěpení DNasou I  Po štěpení fragmenty ~1,2kb  Predikce regulačních elementů DNAse-chip ... pokračování příště – 31.10.2014  mikroRNA čipy – Marek Mráz