Genetické metody v zoologii DNA Msat paternita - barvy Fig1 Josef Bryja (bryja@brno.cas.cz) Miloš Macholán (macholan@iach.cz) Doporučená literatura (česká) Genetické metody v zoologii Jan Zima, Miloš Macholán, Pavel Munclinger, Jaroslav Piálek Nakladatelství Karolinum 2004 SANY0231 •M. Macholán •Základy fylogenetické analýzy (2014) http://www.muni.cz/media/resize?type=1&height=100&id=1197037 Proč? Problém: zoologie, taxonomie ekologie, evoluční biologie klasické metody morfologická, ekologická, bionomická data Genetické metody: genetická data Další úroveň poznání Odpovědi na nové otázky Proč používat genetické metody v zoologii? • •Často nelze jinak či lépe: •rekonstrukce fylogenetických vztahů mezi populacemi , druhy či vyššími taxony (konvergence) • •paternita – páření často skryté a nemusí vést k oplození • •identifikace z trusu, chlupů - pohyb jedinců skrytě žijících druhů • •izolace populací – nemusí být zřejmá •počet migrantů – nelze sledovat naráz všechny jedince • • viz Molekulární ekologie – letní semestr Genome Transcriptome Proteome DNA mRNA Proteins Transcription Translation Genomics Transcriptomics Proteomics GP_FA7TYN03040706_inv 3 billion bases 20-30,000 genes ~100,000 proteins Functional Genomics Genetické metody = studium genetické variability Úrovně genetické variability •druhy a vyšší taxony – fylogenetické analýzy (fylogenetická systematika) http://files.cichlidy.webnode.cz/200000032-2ab122baab/cichlasomatini_2010.jpg http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/3/3a/Fylo-savci.jpg/400px-Fylo-savci.jpg •populace až druh – studium speciace, fylogeografie, hybridizace Úrovně genetické variability Úrovně genetické variability •populace – populační biologie, ochranářská genetika Pracovní_hýli ? Úrovně genetické variability •jedinec – analýzy příbuznosti (behaviorální ekologie, např. analýzy paternity) Genetické metody v zoologii •jak genetická data získat, tj. které techniky použít • •základní typy a zpracování (editace) genetických dat •Mechanismy mikroevoluce (podzim) • •Molekulární ekologie (jaro) Dnešní přednášky – M. Macholán •Elektroforéza proteinů (alozymy aj.) •Cytogenetika Různé úrovně genetické variability vs. Genetické DNA markery •kódující DNA (geny) •přepisované sekvence (cca 20-25 tisíc genů u obratlovců) •genetický kód •vytvářejí fenotyp •podléhají přírodnímu výběru •rostoucí význam v přírodních vědách •nekódující DNA •nefunkční (neznámá funkce) •neutrální k přírodnímu výběru •většina DNA u eukaryot (až 95% u obratlovců) •pseudogeny •repetitivní DNA Repetitivní DNA DNA Typical sequence length (bp) Location Satellites (>106 repeats/genome) 5-100 Tandem arrays, scattered throughout the genome Minisatellites (>103 loci/genome) 20-300 Tandem arrays up to 5 kb in length, scattered throughout the genome Microsatellites (>104 loci/genome) 1-6 Tandem arrays up to a few 100 bp in length, scattered throughout the genome Telomeres 4-8 Tandem arrays up to 1kb in legth, at the ends of each chromosome SINEs (>105/genome) 50-500 (100-300) Interspersed throughout the genome LINEs (>103/genome) 1-5 k Interspersed throughout the genome Kódující („funkční“) DNA 1)ribosomální DNA 2) 2)jaderné strukturální geny (protein-coding genes) 3) 3)mitochondriální DNA 1. Ribosomální DNA • geny pro ribozomální RNA – mnoho shluků u eukaryot • 16S, 23S, and 5S – single copy cluster u prokaryot • rDNAs – phylogeny, ITS – population structure, barcoding 2. Jaderné geny •nízká variabilita mezi jedinci – významná funkce, purifikující selekce (nejsou často používány jako genetické markery) •introny – více variabilní než exony, často ve fylogenetických analýzách •alozymy •MHC geny •SNPs – narůstající význam (jednoduché mutace způsobují významnou funkční změnu) •studium transkripce - transkriptomika 3. Mitochondriální DNA Saccone et al. 2001 • maternaly inherited (?) • no recombination (?) • no heterozygotes (?) • mnoho kopií v každé buňce • « numts » nuclear copies of mtDNA • vhodná pro fylogenetické a fylogeografické analýzy a DNA-barcoding 14 kbp (Caenorhabditis) 42 kbp (Placeopecten) „Molekulárně-genetické“ metody •analýza polymorfismu DNA •konzervativní vs. variabilní úseky (« loci ») •sekvenční polymorfismus: CGCATCTCTAGCTTCGATTCAGGAA CGCATCTCTAGCTTTGATTCAGGAA „Molekulárně-genetické“ metody •analýza polymorfismu DNA •konzervativní vs. variabilní úseky (« loci ») •sekvenční polymorfismus •délkový polymorfismus CGCACATCTCTAGCTTCGATTCAGGAA CGCATCTCTAGCTTTGATTCAGGAA Vznik DNA polymorfismu •mutace (transice, transverze, inzerce, delece) •rekombinace (kombinace změn vzniklých mutacemi, duplikace a delece při rekombinačních chybách) •transpozice •Þ obecná molekulární genetika Genotypizace – stanovení genotypu •stanovení formy určitého úseku DNA (alely, haplotypu) • 1)izolace celkové DNA z tkání 2)amplifikace požadovaného úseku DNA (PCR-based methods) 3)studium variability daného úseku (lokus) 4) Základní struktura molekuly DNA http://bootstrike.com/Genetics/DNA/images/structure.gif 3´- OH konec (nutný k navázání dalšího nukleotidu při syntéze DNA) 5´- fosfátový konec (ve vodném roztoku způsobuje záporný náboj) Enzymy používané při molekulárně-genetických manipulacích •DNA-polymeráza •DNA-exonukleáza, DNA-endonukleáza •DNA-ligáza •DNA-transkriptáza •RNA-reverzní transkriptáza Izolace DNA •rozmanitý biologický materiál – musí obsahovat buněčná jádra nebo mitochondrie s nedegradovanou DNA •dnes většinou komerční kity •velký vliv fixace vzorků • • •Izolace RNA (exprese specifických genů) – dříve problém, dnes RNAlater Způsoby získání DNA z volně žijících živočichů: 1.destrukční – živočich je usmrcen kvůli získání tkání potřebných na genetické analýzy 1. 2. nedestrukční (invazivní) – živočich je odchycen a je mu odebrán vzorek tkáně nebo krve n 3. neinvazivní – zdroj DNA je „zanechán za živočichem“ a je získán bez potřeby odchytu, manipulace či dokonce pozorování Fixace materiálu •čerstvá tkáň •čistý EtOH •rychlé vysušení •speciální extrakční pufry •zamražení •formaldehyd •opakované zamražování •rozvlhčování sušeného materiálu •další fixační média + - § speciální metody pro izolaci ze subrecentního materiálu (mamuti, hmyz v jantaru, neandrtálci apod.) PCR Polymerase chain reaction (jak z málo DNA udělat hodně) Kary Mullis (1983 – na dálnici ze San Francisca do Mendocina) - odměna 10 000 USD - patent pak prodán Roche za 300 000 000 USD) 1993 – Nobelova cena http://i.kinja-img.com/gawker-media/image/upload/s--8qoFUoQi--/18dyxuq3x41k7jpg.jpg Amplifikace DNA – PCR Druh Velikost genomu (bp) Počet chromozómů (1n) Caenorhabditis elegans 8,0 x 107 4 Drosophila melanogaster 1,65 x 108 4 Xenopus laevis 3,0 x 109 18 Mus musculus 3,0 x 109 20 Homo sapiens 3,0 x 109 23 PCR •Z celkové DNA si namnožíme jen úsek, který nás zajímá. • •Co se bude množit? To určí primery. • •Primery – krátké oligonukleotidy komplementární k úsekům ohraničujícím místo našeho zájmu. • primer AGGGGACGTACACTCAGCTTT templát TCCCCTGCATGTGAGTCGAAA primer primer DNA templátu tento úsek se bude množit Denaturace (obvykle 95°C) při zvýšení teploty se oddělí komplementární vlákna DNA Při ochlazení dojde k reasociaci Primery přidané v nadbytku kmitají díky Brownově pohybu Některé se dostanou do blízkosti komplementárních míst Při ochlazení primery přisednou rychleji než dojde k vzájemné reasociaci dlouhých vláken DNA (obvykle 50 - 65°C) – „annealing“ V úseku mezi primery zůstanou vlákna DNA oddělena Primery jsou prodlužovány přidáváním nukleotidů podle sekvence templátu (obvykle 72°C – optimum pro Taq polymerázu) > Při dalším zahřátí dojde k oddělení templátu a nově vzniklých vláken Po ochlazení primery přisednou na templát i nově vzniklé fragmenty („annealing“) > Při 72°C dojde opět k prodlužování primerů a vzniku nových kopií Při dalším zahřátí… > Ochlazení – nasednutí primerů 72°C vznik nových fragmentů 95°C denaturace [USEMAP] https://www.youtube.com/watch?v=2KoLnIwoZKU PCR - VIDEO Inhibice PCR vysokou koncentrací DNA PCR Příklad programu 95°C 3 min 95°C 30 s 60°C 30 s 72°C 1 min 35x zpět 72°C 10 min Cykly (obvykle 20-40): denaturace (95°C ) nasednutí primerů (50-65°C ) elongace=polymerizace (72°C ) Nejprve však často prodlužená denaturace celkové DNA Nakonec prodloužená elongace • pcr Cycler MJ Research Cycler Eppendorf RoboCycler Stratagene Co když PCR nefunguje? •Měníme teplotu „annealingu“ (nejlépe použijeme gradient teplot, pokud to náš cykler umí) Vyšší teplota=vyšší specificita •Měníme koncentraci Mg2+ iontů •Navrhneme nové primery Studium variability nasyntetizovaného úseku 1)délkový polymorfismus •elektroforéza DNA (DNA = záporný náboj) http://www.aldebaran.cz/bulletin/2009_38/DNA_part.gif Rozdělení fragmentů DNA podle velikosti •Agarosa - Hrubé rozdělení (do rozdílu 15 bp) • •Polyakrylamid – Přesnější rozdělení (4 bp) • •Sekvenátor, fragmentační analýza – nejpřesnější (fluorescenčně značené PCR fragmenty, např. značené primery) tools_1a 3LOKCELE detektor laserový paprsek - + Studium variability nasyntetizovaného úseku 2)sekvenční polymorfismus •sekvencování •SNP („single nucleotide polymorphism“) analýza – mnoho různých metod (viz další přednášky) REAL TIME PCR (= „kvantitativní PCR“) SANY0264zmenseny In this presentation, we will be using Sybr green to monitor DNA synthesis. Sybr green is a dye which binds to double stranded DNA but not to single-stranded DNA and is frequently used to monitor the synthesis of DNA during real-time PCR reactions. When it is bound to double stranded DNA it fluoresces very brightly (much more brightly than ethidium bromide does, which is why we use Sybr Green rather than ethidium bromide; we also use Sybr green because the ratio of fluorescence in the presence of double-stranded DNA to the fluorescence in the presence of single-stranded DNA is much higher that the ratio for ethidium bromide). Other methods can also be used to detect the product during real-time PCR, but will not be discussed here. However, many of the principles discussed below apply to any real-time PCR reaction. Problém •Kvantitativní rozdíly v expresi genů (tj. množství mRNA → reverzní transkripce → cDNA) • •Neinvazivní metody – nutnost stanovit, kdy je ještě ve vzorku dostatek specifické DNA pro smysluplnou analýzu • •Genotypizace SNPs atd. • • • Real time PCR was developed because of the need to quantitate differences in mRNA expression. PCR methods are particularly valuable when amounts of RNA are low since the fact that they involve an amplification step means they are more sensitive. [USEMAP] https://www.youtube.com/watch?v=FIgGKkcLLuo PCR a qPCR s hydrolyzační sondou - VIDEO Real-time PCR přístroje SANY0264zmenseny A gene which is to be used as a loading control (or internal standard) should have various features - see slide. Absolutní kvantifikace 1)Vytvoření kalibrační křivky 2) Real-time PCR se vzorkem s neznámým množstvím DNA, např. z trusu We can plot the Ct values for the dilutions against concentration - the result is a linear graph. It should have an excellent correlation coefficient (certainly more than 0.990). Stanovení koncentrace DNA při neinvazivních analýzách Log DNA concentration (pg) Positive PCR Allelic dropout Genotypizace jen „dobrých“ vzorků Morin et al. 2000 Relativní kvantifikace - standardy •Měření úrovně exprese (např. v různých typech tkání nebo treatement vs. non-treatement atd. •housekeeping geny – slouží jako standard pro měření •stejný počet kopií ve všech buňkách •exprimované ve všech buňkách, nezávislé na experimentu • A gene which is to be used as a loading control (or internal standard) should have various features - see slide. Sekvenování Sekvencování DNA •Maxam-Gilbertova (chemická) metoda: bázově-specifická chem. modifikace a štěpení fragmentů DNA •Sangerova (enzymatická) metoda: terminace replikace pomocí ddNTP Sekvencování DNA sekvenační reakce se značenými dideoxynukleotidy a jedním specifickým nebo universálním primerem – poskytují volný 3´-konec DNA PCR produkt naklonovaný fragment Sangerova dideoxy metoda Sekvenování PCR produktu: – jen jeden primer - vysoká koncentrace templátu (hodně kopií) AAGTCAGTCTAAATGCGATTGGGA Primer - F Rev. Primer - R TTCAGTCAGATTTACGCTAACCCT Rev. Primer - F Primer - R Primer - F -OH 1. Denaturace - 96°C 2. Nasednutí primeru - 50-60°C Sekvenační „PCR“ – jen jeden primer AAGTCAGTCTAAATGCGATTGGGA Primer - F Rev. Primer - R TTCAGTCAGATTTACGCTAACCCT Rev. Primer - F Primer - R Primer - F - AAG-OH 1. Denaturace - 96°C 2. Nasednutí primeru - 50-60°C 3. Polymerizace - 72°C Přisedání deoxynukleotidů ... AAGTCAGTCTAAATGCGATTGGGA Primer - F Rev. Primer - R TTCAGTCAGATTTACGCTAACCCT Rev. Primer - F Primer - R Primer - F - AAGTCAGTC=O 1. Denaturace - 96°C 2. Nasednutí primeru - 50-60°C 3. Polymerizace - 72°C Přisedání deoxynukleotidů ... ... až narazí na dideoxynukleotid Sekvenační „PCR“ – jen jeden primer TTCAGTCAGATTTACGCTAACCCT Rev. Primer - F Primer - R Primer - F - AAGTCAGTCTAA=O 1. Denaturace - 96°C 2. Nasednutí primeru - 50-60°C 3. Polymerizace - 72°C 35 x Primer - F - AAGTCAGTC=O Sekvenační „PCR“ – jen jeden primer TTCAGTCAGATTTACGCTAACCCT Rev. Primer - F Primer - R Primer - F - AAGT=O 1. Denaturace - 96°C 2. Nasednutí primeru - 50-60°C 3. Polymerizace - 72°C 35 x Primer - F - AAGTCAGTC=O Primer - F - AAGTCAGTCTAA=O Sekvenační „PCR“ – jen jeden primer Primer - F - AAGTCAGTC=O Primer - F - AAGTCAGTCTAA=O Primer - F - AAGT=O ... a řada dalších fragmentů, každý z nich označený fluorescenčním dideoxynukleotidem Kapilární elektroforéza - seřazení fragmentů podle délky - detekce barvy dideoxynukleotidů Výsledek sekvenační „PCR“ Detekce fragmentů – kapilární elektroforéza TTCAGTCAGATTTACGCTAACCCT Rev. Primer - F Primer - R Primer - F - AAGTC=O Primer - F - AAGTCAGTCTA=O Primer - F - AAGTCAGTCTAA=O Primer - F - AAGTCA=O Primer - F - AAGTCAGTCT=O Primer - F - AAGTCAGTC=O Primer - F - AAGTCAGT=O Primer - F - AAGTCAG=O - + Fig1 AAGTCAGTCTAAATGCGATTGGGA Primer - F Rev. Primer - R krátké -------------- dlouhé (rychlé) ------------ (pomalé) Sekvencování DNA Fig1 DNA PCR product cloned fragment - + laser beam detector capillary electrophoresis G C G A G C T Sanger tools_1a •Sekvence délky 500 – 1000 bp • •4 kapiláry - destička s 96 vzorky za noc • •Jsou i sekvenátory s 96 kapilárami Příště … •Single locus DNA markery – mikrosatelity, SINE, LINE atd….