Sorex_G2






MODULARIZACE VÝUKY EVOLUČNÍ A EKOLOGICKÉ BIOLOGIE
CZ.1.07/2.2.00/15.0204
PF_72_100_grey_tr ubz_cz_black_transparent
http://image.tutorvista.com/content/heredity-and-evolution/chromosome-types.jpeg
http://www.intl-pag.org/icons/telomere.gif http://www.vet.cam.ac.uk/cytogenetics/harlequin.jpg
FISHchip http://media.wiley.com/mrw_images/els/articles/a0005002/image_n/nfgz003.gif

•analýza mikroskopické struktury chromozomů
•pojem „chromozom“ - 1888 Wilhelm Waldeyer
•chromozomální teorie dědičnosti: 1. pol. 20. stol. - Theodore Boveri, Walter S. Sutton, Thomas H.
Morgan
•studium chromozomů: karyologie, cytogenetika
•karyotyp = uspořádaný obraz sady chromozomů v buňce






MODULARIZACE VÝUKY EVOLUČNÍ A EKOLOGICKÉ BIOLOGIE
CZ.1.07/2.2.00/15.0204
PF_72_100_grey_tr ubz_cz_black_transparent

chromosom
Struktura metafázního chromozomu


Klasifikace typu chromozomů podle polohy centromery:
metacentrický
submetacentrický
(subtelocentrický)
akrocentrický
telocentrický
http://image.tutorvista.com/content/heredity-and-evolution/chromosome-types.jpeg Mus1

•role významných technologických inovací - v moderní éře 4-5 takových průlomových momentů:
1objev hypotonického působení ® rozprostření
metafázních chromozomů
2kultivace leukocytů periferní krve a fibroblastů
3metody proužkování chromozomů
4metody hybridizace in situ (ISH)
5využití imunochemických metod spolu s ISH ® možnost neradioizotopové detekce hybridizovaných sond
(NISH) pomocí různých fluorochromů („chromosome painting“)
Historie cytogenetiky

•1. Výběr tkáně s vysokou mitotickou aktivitou
•kořenová čepička, embrya, larvy, regenerující tkáně
•dospělí obratlovci: kostní dřeň, ledviny, slezina, gonády, intersticiální epitelium, epitelium
rohovky
•někdy stimulace subkutánní, nebo intraperitoneální injekcí fytohemaglutininu, výtažku z líčidla
amerického (pokeweed, Phytolacca americana) nebo aktivované suspenze kvasinek
Příprava mitotických preparátů

•2. Zastavení mitotického dělení in vivo nebo in vitro
•cytostatikum: kolchicin, kolcemid, vinblastin
•in vivo: výhoda: levnější, jednodušší
• nevýhoda: nutnost usmrcení organismu
•in vitro: kultivace periferní krve (krátkodobá) a fibroblastů (dlouhodobá) • výhoda: možnost
synchronizace dělení ®  snížení variability v kondenzaci chromozomů, zvýšení kvality preparátu,
snížení spotřeby cytostatika • nevýhoda: větší pracnost, finanční a časová náročnost, méně
chromozomů
•
Příprava mitotických preparátů

•3. Hypotonizace buněk
•0,075 M roztok KCl, může i destilovaná voda
•
•4. Fixace
•
•„Carnoyova směs“ = metanol : kyselina octová (ledová) 3:1
•několkrát vyměnit
•pro skvašové preparáty místo metanolu etanol
Příprava mitotických preparátů

•5. Zhotovení preparátu
•v zásadě 2 základní techniky:
•skvaš („squash“ = rozmačkání): macerace nebo jemné rozemletí kousků tkáně na podložním skle a
rozmáčknutí silikonovým krycím sklem
•nakapání („splash“): buněčná suspenze nakapána Pasteurovou pipetou z výšky na podložní sklo ®
roztáhnutí chromozomů povrchovým napětím;
po nakapání buď vyschnutí na vzduchu („air-dried“), nebo zapálení suspenze („flame-dried“)
Příprava mitotických preparátů

kultivace
Kultivace krve


•testes, pylové matečné buňky
•hypotonizace citronanem sodným, postup obdobný jako u mitotických preparátů •průběh meiózy a
význam jednotlivých stadií; synaptonemální komplexy (SC), štětkovité (lampbrush) chromozomy
Příprava meiotických preparátů

•Q-proužkování (quinacrine):
•
•diferenciální excitace a extinkce fluorochromu v závislosti na zastoupení AT bází
•barvení chinakrinem, UV světlo Þ krátká doba viditelnosti
Proužkování chromozomů („banding“)
mechowi_Q http://media.wiley.com/mrw_images/els/articles/a0005777/image_n/nfgz001.gif

mechowi_G
•G-proužkování (Giemsa, GTG-banding):
•
•účinek denaturačních činidel na stabilitu proteinových a nukleových složek chromatinu
•pozitivní (tmavé) proužky » oblasti bohaté
na AT báze (izochory)
•působení trypsinu (chymotrypsin, NaOH)
•barvení Giemsou
Proužkování chromozomů („banding“)
rypoš obří
(Fukomys mechowi)

Sorex_G2
rejsek obecný
(Sorex araneus)

Anicka_G
Homo sapiens


Lemur catta_R
•R-proužkování (reverse banding):
•
•denaturace při alkalickém působení za vysoké teploty
(80-90°C) a následná renaturace DNA
•tmavé proužky » izochory bohaté
na GC báze
•barvení Giemsou nebo
akridinovou oranží
Proužkování chromozomů („banding“)
Lemur catta

•C-proužkování (constitutive heterochromatin):
•
•postupné působení silné kyseliny (1M HCl) a zásady (Ba(OH)2) a renaturaci heterochromatinu v
solném pufru (2´SSC) za vysoké teploty (60°C)
•rozpuštění euchromatinu
•barvení Giemsou (vizualizace satelitní DNA)
Proužkování chromozomů („banding“)
myvalovec_C
psík mývalovitý
(Nyctereutes procyonides)

kolčava a hranostaj
mechowi_C mechowi_G
rypoš obří
(Fukomys mechowi)
lasice_C

•Ag-NOR:
•
•želatina + kyselina mravenčí, barvení AgNO3
•barvení organizátorů jadérek (pouze aktivní)
Proužkování chromozomů („banding“)
kolčava
rypoš obří
(Fukomys mechowi)
kolcava_NOR mechowi_NOR

•BrdU:
•
•replikace za přítomnosti umělého prekurzoru (5-bromo-2´-deoxyuridin) ® sledování výměn sesterských
chromatid
•
Proužkování chromozomů („banding“)
2_11

hybridizace chromozomů in situ se značenou sondou
možnost použití i několika sond současně
vizualizace: protilátky specifické pro biotin (avidin, streptavidin), které jsou konjugovány buď s
fluorochromem (např. fluorescein izothiokyanát, FITC), nebo s enzymatickými činidly (např.
alkalinfosfatáza, peroxidáza), reakce se specifickým substrátem
CISS, chromosome in situ supression hybridization
PRINS, primed in situ labelling
GISH, whole genome in situ hybridization
FACS, fluorescence activated cell sorting
vybarvování chromozomů = „chromosome painting“
Fluorescenční hybridizace in situ (FISH)

799px-FISH_(Fluorescent_In_Situ_Hybridization) FISH_(technique)



Urovysion_on_Duet Bcrablmet FISHchip



Mikrodisekce