MODULARIZACE VÝUKY EVOLUČNÍ A EKOLOGICKÉ BIOLOGIE
CZ.1.07/2.2.00/15.0204
PF_72_100_grey_tr ubz_cz_black_transparent
http://web.siumed.edu/~bbartholomew/images/chapter6/F06-21.jpg
http://www.science-house.com/images/Tarsons/ElectrophoresisSubMidi.jpg
http://bio1151.nicerweb.com/Locked/media/ch20/20_09bGelElectrophoresis-L.jpg

•elektroforéza: z řečtiny = transport pomocí elektřiny
obecně = pohyb nabitých částic v médiu vlivem el. pole
•
•do konce 50. let genetická proměnlivost v populacích studována pouze na základě mendelovských
morfologických znaků nebo polytenních chromozomů ®  otázka, do jaké míry tyto jevy reprezentují
skutečnou míru genetické proměnlivosti v přírodě
•
•substituce aminokyselin můžeme zjistit sekvenováním – pokud to není možné, lze nahradit
elektroforézou proteinů

•z 20 AA 3 nesou kladný náboj (Arg, Lys, His), 2 záporný náboj (Asp, Glu)
•
•kromě náboje i velikost a konformace makromolekuly (-S-S- můstky, van der Waalsovy síly, vodíkové
vazby, elektrostatické síly); pH pufru
•
•stabilizace el. náboje → specifický pufr s vysokou iontovou silou a pH co nerozdílnější od pI
daného proteinu: pH 3-10, nejčastěji 6,5-9,5
•
•náboj většiny proteinů při pH 8-9 záporný ® migrace k anodě

•Princip ELFO znám již od konce 19. stol.
•
•1937 - Thisselius: metoda „pohyblivého rozhraní“
•
•1949 - Linus Pauling: papírový nosič - abnormální Hb srpkovité anémie
•
•1955 - O. Smithies: škrob
•
•1957 - Hunter a Moeller: užití katalytických shopností enzymů (histochemické barvení)
•
•1966 - aplikace ELFO na přírodní populace: Harry Harris (člověk), Richard Lewontin a John Hubby
(octomilka)
•
•

•Úroveň genetické proměnlivosti v přírodních populacích:
–20-50% lokusů polymorfních
–průměrná heterozygotnost: savci - ca. 5%, bezobratlí a rostliny - 15-20%
•
•Nosiče (média):
•škrob (starch gel el., SGE): velikost molekuly + velikost náboje
•celulózoacetát (CAGE): náboj
•agar, agaróza (AGE): náboj
•polyakrylamid (PAGE): velikost molekuly + náboj

Metody elektroforézy
•horizontální
•vertikální
•kapilárová
•
•
3_1 3_2

•1. ELFO v kontinuálním pufru
•
•2. ELFO v diskontinuálním pufru (multifázická ELFO):
•2 gely o různých koncentracích - koncentrující a separující
•na rozhraní „sendvičování“ proteinů mezi „vedoucím“ a „taženým“ iontem; pokud jen tento krok =
izotachoforéza
Metody elektroforézy
http://web.siumed.edu/~bbartholomew/images/chapter6/F06-21.jpg

•3. Izoelektrická fokusace (isoelectric focusing, IEF):
•v gelu syntetické polyamino polykarbonátové skupiny = nosné amfolyty s rozsahem pI
•připojením el. pole ® stabilní gradient pH; amfolyty drženy v gelu silnou kyselinou při anodě a
silnou zásadou při katodě
•
Metody elektroforézy
http://www.fda.gov/ucm/groups/fdagov-public/documents/image/ucm059972.jpg
http://www.channelwolf.com/lvv/sem6/index_files/image1749.jpg

•4. ELFO v močovině a SDS:
•SDS = sodium dodecyl sulphate (= aniontový detergent):
schopnost rozpouštět některé proteiny a štěpit některé polymery
SDS způsobuje silný záporný náboj proteinů, migrace jen podle hmotnosti molekuly •močovina: podobně
jako SDS, ale náboj proteinů normální - migrace podle celkového náboje
•(podobně možnost tepelné denaturace proteinů a následná ELFO)
•
•5. Dvousměrná (2-D) ELFO:
•připojení el. pole postupně ve dvou na sebe kolmých směrech
např. 1. fáze = IEF, 2. fáze = SDS ELFO - kombinace pI a molekulové hmotnosti
Metody elektroforézy

•Schopnost separace proteinů krevní plazmy:
•
•CAGE: 5 pruhů
•SGE: 15
•PAGE: 19
•IEF > 30
•2-D ELFO ca. 300 skvrn
~ 75-100 polypeptidů
Metody elektroforézy
http://www.prlog.org/10827617-2d-gel-electrophoresis.jpg

3_6
•nespecifická: amidočerň, Coomassie Brilliant Blue R
•specifická: barviva pro glykoproteiny, lipoproteiny
histochemické barvení enzymů: spřažení katalýzy přeměny     specifického substrátu s barvicí reakcí
- nitrotetrazoliové     soli (MTT, NBT) + PMS (phenazin methosulfát); Fast Blue RR;
Fast Garnett GBC, Fast Black K
             - redukce NAD+, NADP+
             - někdy nutno dodat další enzymy
Detekce proteinů

obarvený gel = obecně elektroforetogram,
jestliže obarveny enzymy = zymogram (enzymogram)
proužky = „elektromorfy“, „alely“, „alelomorfy“
izozymy, alozymy
3_8 3_9