Biochemie •Česká studijní literatura §Zdeněk Vodrážka. Biochemie. – 3. opr. vyd. Praha : Academia, 2007. § §Šípal, Zdeněk. Biochemie. 1. vyd. Praha : Státní pedagogické nakladatelství, 1992. § §Voet, Donald - Voet, Judith G. Biochemie. Translated by Arnošt Kotyk. 1. vyd. Praha : Victoria Publishing, 1995. § Biochemie •Anglická studijní literatura §Voet, Donald - Voet, Judith G. – Biochemistry. 4th ed. Hoboken : – John Wiley & Sons, 2011 § §Voet, Donald - Voet, Judith G. - Pratt, Charlotte W. Fundamentals of biochemistry :life at the molecular level. 3rd ed. Hoboken, N.J. : John Wiley & Sons, 2008. § §Boyer, Rodney. Concepts in biochemistry. 2nd ed. New York : John Wiley & Sons, 2002. Biochemie –1. ÚVOD –2. BÍLKOVINY - Struktura, vlastnosti a funkce –3. NUKLEOVÉ KYSELINY - Struktura, vlastnosti a funkce –4. SACHARIDY - Struktura, vlastnosti a funkce –5. LIPIDY - Struktura, vlastnosti a funkce –6. ENZYMOLOGIE –7. METABOLISMUS A BIOENERGETIKA –8. METABOLISMUS SACHARIDŮ –9. FOTOSYNTÉZA –10.METABOLISMUS LIPIDŮ –11.METABOLISMUS BÍLKOVIN –12.REGULACE BIOCHEMICKÝCH PROCESŮ –13. MOLEKULÁRNÍ FYZIOLOGIE –14. XENOBIOCHEMIE – Zkouška z biochemie Biochemie §chemická disciplína, která studuje chemické složení živé hmoty a chemické procesy, které v ní probíhají § §je hraniční vědní disciplínou, na pomezí mezi chemií a biologií, zkoumá biologické objekty chemickými metodami Literatura http://media.wiley.com/product_data/coverImage300/72/04700290/0470029072.jpg Látkové složení • Prvkové složení vesmíru, zemské kůry a člověka Voda Voda table 2-03 Voda •Na vodu vázán vznik života • •Je rozpouštědlo • •Má transportní funkci • •Účastní se chemických reakcí • •Udržuje stálost vnitřního prostředí –I, pH, T 5 % 95 % • Fylogenetický strom • Fylogenetický strom Margulis – endosymbiotická teorie Hypothesized origin of mitochondria and chloroplasts Prokaryontní bakteriální buňka • Prokaryontní bakteriální buňka Eukaryontní živočišná buňka • Eukaryontní rostlinná buňka Eukaryontní buňka Organizace biologických struktur • figure 1-07c Viry figure 1-07a figure 1-07b figure 1-07d Viry Evoluce života na zemi Evoluce života na zemi 1.Chemická evoluce – jednoduché anorganické molekuly dávají vznik organickým polymerům 2. 2.Vznik uspořádaných struktur biopolymerů – ty jsou schopná autoreplikace- RNA 3. 3.Biologická evoluce – evoluce od jednobuněčných k mnohobuněčným živočichům Evoluce života na zemi • Evoluce života na zemi T01-04.jpg 0005BABDMacintosh HD B74677AA: F04-04a.jpg 0005D4EAMacintosh HD B74677AA: F04-04b.jpg 0005D4EAMacintosh HD B74677AA: T04-01a.jpg 0005D4EAMacintosh HD B74677AA: Cystin figure 3-06 Cystin F04-05.jpg 0005D4EAMacintosh HD B74677AA: Selenocystein unnumbered figure pg 73b Pyrrolysin http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/7/71/Pyrrolysine.svg/560px-Pyrrolysine.svg.png Esenciální AMK •Rostliny + mikroorganismy 0 •Člověk – biosyntéza -12 • esenciální - 8 Lys, Try, Phe, Met, • Thr, Ile, Leu, Val, Arg? Esenciální AMK •Rostliny + mikroorganismy 0 •Člověk – biosyntéza -12 • esenciální - 8 Lys, Try, Phe, Met, • Thr, Ile, Leu, Val, Arg? • 2 • figure 3-04b Henderson-Hasselbachova rovnice > figure 3-07 Titrační křivka glycinu F04-06.jpg 0005D4EAMacintosh HD B74677AA: Thalidomid Thalidomides Thalidomid thalidomide thalidomid2 Thalidomid L AMK - CO-R-N F04-14.jpg 0005D4EAMacintosh HD B74677AA: Diastomery threoninu F04-15.jpg 0005D4EAMacintosh HD B74677AA: Ninhydrinová reakce figure 3-09a Reakce AMK s dansylchloridem figure 3-09d Papírová chromatografie AMK Martin Synge Nobelova cena za chemii 1952 Papírová chromatografie AMK Martin Synge Nobelova cena za chemii 1952 Mikhail Semyonovich Tsvet Chromatographia 1906 Kolonová chromatografie RP HPLC AMK F07-06.jpg 0005D57BMacintosh HD B74677AA: http://static1.comsol.com/shared/images/stories/waters_corp_hplc_systems/html/figure2.jpg Figure 1 figure 3-11a figure 3-11c figure 3-11b Proinzulín 84 AMK Inzulín – 51 AMK 5 AMK 15-32 AMK figure 3-11e figure 3-11f Falotoxiny •Amanitin •Faloidin File:Phalloidin.png File:Alpha-amanitin structure.png Amanita phalloides Microcystiny microcy3 sin_rozklad Microcystiny Konformace F07-01.jpg 0005D57BMacintosh HD B74677AA: Konformace figure 3-15 AMK analyzátor AMK analyzátor Proč je nutné znát primární strukturu •Pro objasnění vyšších struktur • •Pro porozumění jejich funkce • •Taxonomické evoluční studie • •Klinický význam • Taxonomické evoluční studie F07-21.jpg 0005D57BMacintosh HD B74677AA: T07-04a.jpg 0005D57BMacintosh HD B74677AA: T07-04b.jpg 0005D57BMacintosh HD B74677AA: F07-24.jpg 0005D57BMacintosh HD B74677AA: F07-22.jpg 0005D57BMacintosh HD B74677AA: Srpkovitá anémie Srpkovitá anémie versus malárie F07-20.jpg 0005D57BMacintosh HD B74677AA: Určování primární struktury AMK sekvenátorem A.Purifikace bílkoviny – získání homogenní bílkoviny B. B.Aminokyselinové složení – určení počtu jednotlivých AMK zbytků (kyselá hydrolýza 6N HCl, 100 –110 ºC, 24 h) C. C.Pořadí aminokyselin: 1.Oddělit a isolovat jednotlivé řetězce(redukce nebo oxidace disulfidických můstků) 2.Určit N-konec a C-konec 3.Určit pořadí aminokyselin Edmanovým odbouráváním (kam až to jde) 4.2 nezávislá specifická štěpení → isolovat štěpy (peptidy) 5.Opakovat bod 3. 6.Sestavit primární strukturu řetězce 7.Určit způsob propojení původních řetězců Zjišťování N-koncových AMK • • •X + A-B-C = X-A + B + C Zjišťování N-koncových AMK http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/7/7e/Sanger_peptide_end-group_analysis.svg/360p x-Sanger_peptide_end-group_analysis.svg.png File:Frederick Sanger2.jpg Frederick Sanger Zjišťování N-koncových AMK F07-03.jpg 0005D57BMacintosh HD B74677AA: Edmanovo sekvenování • •X + A-B-C.. = X-A + B-C.. • •X + B-C.. = X-B + C.. • Pehr Victor Edman http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/7/74/Edman-1968.png Edmanovo sekvenování F07-04.jpg 0005D57BMacintosh HD B74677AA: Možnosti štěpení figure 3-17a figure 3-17b figure 3-17c Metoda překrývajících se štěpů Pomocí hmotnostní spektrometrie - MS •analytická metoda sloužící k převedení molekul na ionty (může dojít k jejich fragmentaci) • •rozlišení těchto iontů podle poměru hmotnosti a náboje (m/z) •záznam relativních intenzit jednotlivých iontů Hmotnostní spektrometr Hmotnostní spektrometr je iontově-optické zařízení, které separuje ionty podle poměru jejich m/z. > Blokové schéma MS MS – NC 2002 (Tanaka, Fen) F07-08a.jpg 0005D57BMacintosh HD B74677AA: F07-08b.jpg 0005D57BMacintosh HD B74677AA: Electrospray (ESI) Tanaka Ionizace Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation (MALDI) Fen Analyzátor doby letu (TOF) Analyzátor doby letu (TOF) MS F07-09.jpg 0005D57BMacintosh HD B74677AA: Tandemová MS-MS F07-10.jpg 0005D57BMacintosh HD B74677AA: Tandemová MS-MS • Tandemová MS-MS F07-11.jpg 0005D57BMacintosh HD B74677AA: Stanovení na základě sekvenace NK • •Není snadné identifikovat gen kódující daný protein • •Nelze takto zjistit posttranslační modifikace • •V genetické, kódu mohou být chyby • •Genetický kód není universální Proč syntéza peptidů •Proteinové inženýrství • •Příprava modifikovaných peptidů • •Příprava peptidových léčiv a vakcín • Pravidla syntézy •Pořadí AMK je dáno genetickým kódem • •COOH málo reaktivní, musí se aktivovat • •Je nutné blokovat další skupiny aby se zabránilo vedlejším reakcím, blokace musí být reverzibilní • •Nesmí být narušena L-konfigurace • •Co největší výtěžek (90 % u dekapeptidu = celkový 39%) • • •V ROZTOKU •X-A-Y + B-X = X-A-B-X + X-A-Y + B-X •X – chránící skupina •Y – aktivační skupina • • • •NA PEVNÉ FÁZI •A-O + Y-B-X = X-B-A-O + Y-B-X F07-35.jpg 0005D57BMacintosh HD B74677AA: Imobilizovaná AMK Volná aktivovaná AMK s blokovanou aminoskupinou Reakce - dipeptid Odstranění blokování Atd. Atd. Tripeptid Bruce Merrifield 1962 Syntetizátor peptidů 1971 Merrifield syntetizova RNAsu - 128 AMK z 80 % aktivní (výtěžek 3 % na původní množství valin) F07-01.jpg 0005D57BMacintosh HD B74677AA: Trans Cis F08-01.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: F08-02.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: F08-04.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: F08-06.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: F08-07.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: F08-08.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: α - helix F08-11.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: H můstek mezi C=O n-té peptidické vazby a N-H n+4 peptidické vazby Optimální vzdálenost 0,28 nm 3,6 AMK na závit α - helix F08-12.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: β - sheet F08-16a.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: F08-16b.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: β - sheet F08-18.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: β - turn F08-22.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: β - turn F08-23.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: figure 4-03 Strukturní motivy F08-46abc.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: F08-46d.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: Strukturní motivy F08-47a.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: F08-47b.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: F08-48.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: Strukturní domény Strukturní domény IgG Hemoglobin Hemoglobin Laktátdehydrogenáza http://www.wikiskripta.eu/images/thumb/b/b9/LDH_01.png/300px-LDH_01.png Pyruvátdehydrogenáza http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/d/d9/Pyruvate_dehydrogenase_E1_subunit_of_E._coli_(20 00_pixels).png Rtg difrakce figure 4-15 NMR podstata • E NMR Blokové schéma NMR spektrum NMR NMR spektrum F08-38a.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: NMR F08-38b.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: Denaturace - renaturace figure 4-14 Skládání – folding bílkovin •Neprobíhá náhodným způsobem • •Probíhá postupně: –a. malé dočasné periodické struktury –b. supersekundární struktury –c. strukturní domény a "roztavená" glubule –d. závěrečné úpravy za účasti enzymů – •Potřebují bílkoviny ke svinování pomocníky? Levinthal Paradox •We assume that there are three conformations for each amino acid(ex. α-helix, β-sheet and random coil). If a protein is made up of 100 amino acid residues, a total number of conformations is : • • 3100 = 515377520732011331036461129765621272702107522001 • ≒ 5 x1047. • •If 100 psec(10-10sec) were required to convert from a conformation to another one, a random search of all conformations would require • • 5 x 1047x 10-10 sec ≒1.6 x 1030 years. • •However, folding of proteins takes place in msec to sec order. Therefore, proteins fold not via a random search but a more sophisticated search process. • figure 4-13 Landscape theory F09-11a.jpg 0005D5ECMacintosh HD B74677AA: F09-11c.jpg 0005D5ECMacintosh HD B74677AA: F09-11d.jpg 0005D5ECMacintosh HD B74677AA: http://www.biology-online.org/user_files/Image/Biophysics/BP-statistical01.JPG Chaperony •Proteiny jsou skládány do aktivní formy molekulárními chaperony a chaperoniny •Chaperony E. coli Hsp70, rozpoznává nesložené hydrofobní části peptidového řetězce •Váže se na tyto části a ochraňuje je dokud nedojde ke správnému složení •GroES-GroEL komplex – hlavní chaperonin u E. coli - GroEL 2 kruhy, každý 7 x 60 kDa podjednotek (Hsp60) •Nesložený protein se váže dovnitř komplexu a jeho skládání je řízeno energií Chaperony Alzheimer File:COMPARISONSLICE HIGH.JPG Alzheimer File:Amyloid-plaque formation-big.jpg Alzheimer Scrapie - BSE – CJD – Kuru Priony http://scienceblogs.com/retrospectacle/upload/2007/02/prion.bmp http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/a/a2/Prusiner_1.JPG Stanley B. Prusiner PT 1982 NC 1997 CJD http://www.pawelmazur.org/blog/wp-content/uploads/2010/06/171461.jpg PrPC - PrPSc http://biomedme.com/wp-content/uploads/2010/02/I11-08-prion.jpg Izolace proteinů Literatura •Scopes : Protein Purification •Harris : Protein Purification Methods – Practical Approach •Deutcher : Guide to Protein Purification •Janson : Protein Purification •Kastner : Protein Liqiud Chromatography • • • Literatura Metody separace proteinů •Vychází z klasických metod chemické analýzy • •Uplatňují se zde i speciální metody Problémy se vzorkem •Komplexnost • •Malá množství • •Labilita • Plánování separace bílkovin Cíl izolace •Získání homogenní bílkoviny •Zachování biologické aktivity •Čistota • •Závěr : získat vzorek o patřičné • čistotě s vynaložením • patřičného úsilí Volba vstupního materiálu •Preparát z daného organismu • •Preparát s největším obsahem dané bílkoviny •Preparát s nejmenším obsahem nečistot Sledování průběhu separace Metoda Celková bílkovina Celková aktivita Specifická aktivita Přečištění Výtěžek extrakt 100 100 1 - 100 % HIC 50 99 1.99 1.99 99 % IEX 25 75 3 1.5 75 % Stanovení koncentrace bílkoviny Kjeldahlova metoda – stanovení N2 •Mineralizace vzorku – převedení organického N na NH4+ • •Stanovení NH4+ - titrace, fotometrie, ionotvě selektivní elektrody Kjeldahlova metoda – stanovení N2 UV spektrofotometrie •280 nm – aromatické AMK • interference nukleotidů • •180 - 230 nm – peptidická vazba • •Výhody - nedestruktivní metoda • - není třeba kalibrace UV spektrofotometrie UV spektrofotometrie Vzorce pro přímé UV stanovení: c (mg/mL) = 1.55 A280 - 0.76 A260 c (mg/mL) = (A235 - A280)/2.51 c (mg/mL) = (A224 - A233)/5.01 c (mg/mL) = A205 [27 + 120 (A280/A205)] UV spektrofotometrie Edelhochova metoda při znalosti aminokyselinového složení je možné spočíst extinkční koeficient proteinu e280. Podmínkou je přítomnost tryptofanu nebo tyrosinu v molekule. e280 = nTrp.5500 + nTyr.1490 + nCys.125 (M-1.cm-1) VIS spektrofotometrie •Přídavek činidla ® barevný derivát •Destruktivní metoda •Nutná kalibrační závislost Biuretová metoda •Princip : Cu2+ vytváří v alkalickém prostředí komplex se 4 N • peptidické vazby • • Cu2+ • •Měření : 540 – 560 nm • 310 nm Folinova metoda •Princip : hydroxyfenolová skupina tyrosinu redukuje fosfomolybdenany (Folin Ciocalteovo reagens) na molybdenovou modř • •Měření : 725 nm Lowryho metoda •Princip : kombinace Folinovy a Biuretové metody • •Měření : 600 nm Lowryho metoda biuret é Lowryê Metoda dle Bradfordové •Princip : při vazbě Coomassie Brilliant Blue G 250 na bílkovinu dochází k posunu absorpčního maxima z 465 na 595 nm. • •Meření : 595 nm Metoda dle Bradfordové BCA metoda •Princip : Na+ sůl k. bicinchoninové (BCA), komplexuje Cu+ tvořené reakcí peptidové vazby s Cu2+ • • • • • •Měření : 562 nm • BCA metoda Fluorescence •Princip : - vazba fluoroforu na • bílkovinu ® měření vzniklé • fluorescence (OPA) • • Měření : exc.340 nm • em.440 nm • • - zhášení fluorescence přídavkem • bílkoviny • Polarografie •Princip : Brdičkova reakce – SH skupiny bílkoviny vstupují v přítomnosti Co2+ katalytické reakce na Hg elektrodě ® proud Nejčastěji používané metody Metoda Rozsah (ng) Poznámka Biuretová 0.5 - 5 okamžitý vývoj Lowryho 0.05 - 0.5 pomalý vývoj UV - 280 nm 0.05 - 2 interference UV – 205 nm 0.01 - 0.05 interference Bradfordové 0.01 - 0.05 sorpce barviva Stanovení biologické aktivity Enzymatické,imunologické, toxické, hormonální receptorové atdf. Vlastní separace Obecné schéma Získání vstupního materiálu Rozrušení buněk Separace Vstupní materiál Mikroorganismy •Bakterie, kvasinky, plísně, řasy • •Výhody - lze jej snadno získat v dostatečné množství • - selekce mutantů o požadovaných vlastnostech • - genetické inženýrství • - termofilní organismy • Bezobratlí •Hmyz, plži, mlži • •Nevýhody - málo se používá, nesnadno se • získává Živočišné tkáně •Laboratorní zvířata – myši, krysy, králíci • •Jateční zvířata – orgány • •Člověk – tělní tekutiny Rostlinné tkáně •Špenát, řepa, hrách • •Nevýhoda – problematický růst za • definovaných podmínek Rozbití a extrakce Bakterie •Záleží na lokalizaci –Extracelulární –Intracelulární •Cytoplasma •Periplazma • • cytoplasma periplasma Balotina •Princip – jemné skleněné kuličky přidány do bakteriální suspenze a rychle třepány nebo míchámy – nutno chladit French (X) press •Princip – zmražená bakteriální suspenze protlačována malým otvorem, přičemž dochází k rekrystalizaci a rozrušení buněk French (X) press Ultrazvuk •Princip – ultrazvuk (> 20 kHz) v roztoku vyvolává střižní síly – nutno chladit Lysozym + osmotický šok (mírný osmotický šok) •Princip – lysozym rozruší buněčnou stěnu, následně je bakteriální suspenze zředěna destilovanou H2O – bakterie popraskají Další •Alumina Al2O3 – roztírání v třecí misce • •Opakované zmrazování a rozmrazování • • Kvasinky Kvasinky •Toluenová autolýza •Princip – toluen extrahuje při 35 –40 oC fosfolipidy buněčné stěny ® osmotický šok ® enzymová autolýza • •Balotina, French press, • Živočišné tkáně •Bez buněčné stěny •Velmi křehké •Tkáňové kultury Živočišné tkáně •Třecí miska s pískem • • • • •Ruční homogenizatory – Potter – • Elvehjemův Živočišné tkáně •Mixery • • •Osmotická lyse - erytrocyty Rostlinné tkáně •Silná buněčná stěna - celulosa •Tkáňové kultury křehké Rostlinné tkáně •Rozrušení buněčné stěny pomocí celulas, • •Obsahují hodně fenolických látek, které mohou být oxidovány na chinony – melaniny, které mohou modifikovat bílkoviny Optimalizace extrakce •Teplota – 4 - 6 oC chlazení •pH – optimální pro danou bílkovinu – práce v pufrech •I – v prostředí o definované iontové síle •Přídavky látek – EDTA, b-merkaptoethanol, kovové ionty, inhibitory proteas Srážecí metody Srážení •Nezaměňovat s denaturací – bílkoviny zůstávají v nativním stavu • •První metody používané pro separaci bílkovin – EtOH, (NH4)2SO4 • •Filtrace nahrazena centrifugací • Rozpustnost bílkoviny •Vlastnostmi bílkoviny – distribuce hydrofobních a hydrofilních skupin na povrchu bílkoviny + + + - - Rozpustnost bílkoviny •Vlastnostmi roztoku – pH, iontová síla, org. rozpouštědla, org. polymery, teplota • Titrační křivka F04-07.jpg 0005D4EAMacintosh HD B74677AA: Izoelektrická precipitace pI + - + - - - - - + + + + Srážení neutrálními solemi vsolování vysolování Vsolování - - - - - + + + + + H2O H2O H2O H2O H2O H2O H2O Vsolování Vysolování Vysolování (NH4)2SO4 •Rozpustnost se málo mění s teplotou •Saturovaný roztok 4 M - hustota 1,235g/cm3 umožňuje centrifugaci agregovaných bílkovin (hustota 1,29 g/cm3) •Levný •Stabilizuje bílkoviny •Relativně čistý Srážecí křivka (NH4)2SO4 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 % Srážecí křivka (NH4)2SO4 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 % Aktivita bílkoviny Koncentrace bílkoviny Srážení - dvojstupňově I.Stupeň II.Stupeň Srážení - dvojstupňově I.Stupeň II.Stupeň Přidané množství •Tabulky • •Vzorce Přidané množství •Tabulky • •Vzorce Provedení El. míchačka Chlazení Míchání 10-30’ Centrifugace pevný (NH4)2SO4 nebo saturovaný roztok (NH4)2SO4 úprava pH NH4OH Srážení org.rozpouštědly mísitelnými s vodou •Rozpouštědla ruší solvatační obal bílkoviny - - - - - + + + + + H2O H2O H2O H2O H2O H2O H2O Srážení org.rozpouštědly mísitelnými s vodou •COHN – separace plazmatických bílkovin EtOH •Nutno provádět při T < 0 oC, při větší teplotě dochází k denaturaci •Dvojstupňově •Přídavky z tabulky nebo podle vzorce • Srážení selektivní denaturací •Při této metodě denaturujeme balastní bílkoviny, cílová bílkovina musí zůstat z 85 - 90 % v nativním stavu. • •Denaturační vlivy – T, pH, org. rozpouštědla • •Bílkovina musí nejen denaturovat i precipitovat • Tepelná denaturace Chromatografické metody Mikhail Semyonovich Tsvet Chromatographia 1906 Chromatografie Stacionární fáze Mobilní fáze izokratická eluce gradientová eluce Zařízení pro LPC Zařízení pro LPC Ionexová chromatografie + elektrostatická interakce + + Vazba Eluce Ionexy •Katexy - - vazba kationtů •silné - sulfo(S), sulfopropyl(SP) OSO3- •slabé - karboxy(C), karboxymetyl(CM) COO- • •Anexy - + vazba aniontů •silné - dietylaminoetyl(DEAE) •slabé – trietylaminoetyl(TEAE) Volba podmínek – pH + typ ionexu pI Bílkovina - Katex Ionex Anex + - + OH- H3O+ 0 -1 +1 pI bílkoviny je znám Volba podmínek – pH + typ ionexu pI bílkoviny není znám •Metoda pokusů a omylů • • • • • • • •Metoda titračních křivek Ionexová chromatografie •Nanášení vzorku – nízká iontová síla • •Eluce – gradientová •Zvyšováním iontové síly •Změnou pH •Afinitní eluce •Použití – purifikace, zakoncentrování, výměna • pufru • Ionexová chromatografie Hydrofobní chromatografie •Stacionární fáze – - C8, -fenyl • •Mobilní fáze – vodné roztoky • 1.7 M (NH4)2SO4 • •Eluce – snižováním iontové síly • •Použití : purifikace bílkovin • Hydrofobní chromatografie Gelová permeační chromatografie Gelová permeační chromatografie Princip - stérická exkluse - omezená difuse Pořadí eluce : MrA>MrB>MrC Gelová permeační chromatografie Totální exkluse Totální permeace Selektivní permeace Gelová permeační chromatografie •Nanášení vzorku – objem vzorku < 2% • objemu kolony •Eluce – izokratická • •Použití : stanovení Mr, odsolování, purifikace Gelová permeační chromatografie Gelová permeační chromatografie Gelová permeační chromatografie Afinitní chromatografie Afinitní interakce Afinitní páry Afinitní chromatografie nanesení vzorku Afinitní chromatografie vznik interakce Afinitní chromatografie vymytí balastů Afinitní chromatografie eluce Ligandy • Monospecifické •váží pouze jedinou biomakromolekulu •nutné si připravovat individuálně Skupinově specifické •váží biomakromolekuly s podobnými vlastnostmi •komerčně dostupné Skupinově specifické ligandy Provedení •Nanesení vzorku – nízká iontová síla • •Eluce – selektivní - volným ligandem • – neselektivní - změna pH, iontové • síly, polarity • •Použítí : analytické (stanovení K), purifikace Eluce •Eluce – selektivní - volným ligandem • nebo kompetičním činidlem Eluce •Eluce – neselektivní - změna pH, • iontové síly, • polarity Skupinově specifické ligandy „dye ligand“ NAD+ NADP+ Dependentní dehydrogenasy Skupinově specifické ligandy Cibacron Blue F4G-A Elektromigrační metody Podstata • • •„Pohyb elektricky nabitých částic •v elektrickém poli“ Frederic Reuss (1807) Katoforéza Elektroforéza •Volná • •Zónová Volná elektroforéza + + - - A+B C B+C A+B+C A+B+C A mA > mB >mC Volná elektroforéza Arne Tiselius (1902 –1971) Volná elektroforéza Arne Tiselius Volná elektroforéza Arne Tiselius (1902 –1971) Nobelova cena1948 Zónová elektroforéza + + A+B+C A B C - - mA > mB >mC Upořádání Horizontální + - + - Upořádání Vertikální Skylab Skylab Stabilizace •Rotací • •Gradienty hustoty • •Porézními medii • •Kapilárou • Polyakrylamid •Složení – kopolymer akrylamidu a • N,N,- methylenbisakrylamidu • •+ plně splňuje požadavky -Monomery jsou neurotoxiny !!!!!! - •Použití : analýza bílkovin Polyakrylamid SDS PAGE + 1 g bílkoviny váže 1.4 g SDS Þ uniformní náboj na jednotku MW SDS PAGE Použití SDS PAGE •Stanovení Mr •Analýza komplexních směsí •Sledování purifikace bílkovin •Stanovení podjednotkového složení + - + - + - Stanovení Mr pomocí SDS PAGE Log Mr Rm Stanovení Mr pomocí SDS PAGE - standardy 1046053 67771 Izoelektrická fokusace • •„Elektroforéza v gradientu pH, částice jsou separováný podle svých pI“ Izoelektrická fokusace 1961 Svensson – Rilbe (1968) Izoelektrická fokusace pH + - H3O+ OH- A + - H3O+ OH- A pI t0 t1 Izoelektrická fokusace + - H3O+ OH- pH tx Izoelektrická fokusace analytická •Provedení - v gelech – PAGE, agarosa • •Použití - sledování komplexních směsí • - izoenzymové složení • - stanovení pI – rozřezání a eluce • – mpH elektrody • – pI standardy • Izoelektrická fokusace analytická 1046056 Dvojrozměrná elektroforéza 1975 O´Farrell 10% Dvojrozměrná elektroforéza 10% pI Mr I.rozměr IEF II.rozměr SDS-PAGE pH 3.0 10.0 Studium procesů probíhajících v živých organismech DNA mRNA PROTEIN METABOLIT Genom / Genomika Transkriptom / Transkriptomika Proteom / Proteomika Metabolom / Metabolomika „OMICKÉ“ POLE dna_rgb dna_versus_rna_reversed_large protein Atp kys_citronova pet Systémová biologie Systémová biologie Systémová biologie Literatura Introducing Proteomics: From concepts to sample separation, mass spectrometry and data analysis Cíl proteomiky • •Cílem je nejen identifikovat všechny bílkoviny, ale zároveň pochopit jejich funkci a strukturu a vytvořit 3D mapu buňky (určit lokalizaci jednotlivých bílkovin). Proč proteomika když máme genomiku ? •nelze určit funkci proteinu na základě sekvence DNA nebo mRNA •nelze popsat molekulární mechanismy pomocí studia genomu •200 typu posttranslacních modifikací •existuje alternativní translace •!!!! špatná korelace hladin mRNA a skutečných hladin bílkovin !!! PROTOŽE PROTEINY A NIKOLIV GENY VYTVÁREJÍ FENOTYP ! •Aplikace proteomiky v medicíně (proteomika nemocí) Vývoj nových léků Biomarkery nemocí Exprese proteinů u nemocí Úloha proteinů ve vzniku nemocí Detekce proteinů vznikajících během nemoci je využita k diagnóze Alzheimerova choroba (amyloid β) Srdeční onemocnění (interleukin-6 a 8, sérový amyloid A, fibrinogen, troponiny) Renální buněční karcinom (karbonanhydrasa IX) Informace o proteinech způsobující onemocnění je využita pro vývoj nových léků 1. Známá 3D struktura proteinu-počítačová simulace-hledání léku, který inhibuje patologický protein (HIV-1 proteasa) 2. Genetické odlišnosti mezi lidmi-odlišný proteom-vývoj individuálních léků Proteiny hrají centrální úlohu v životě organismu. Základní schéma analýzy užívané v proteomice Směs proteinů Jednotlivé proteiny Peptidy Hmotnostní spektra peptidů Identifikace proteinů 1. Separace 2D-PAGE 2. Izolace Štěpení trypsinem 3. Hmotnostní analýza Hmotnostní spekroskopie 5. Porovnání s databází 4. Sekvenční analýza Fragmentace peptidů Sekvence peptidů Dvojrozměrná elektroforéza pI Mr CelM Dvojrozměrná elektroforéza pI Mr CelM Databáze •http://www.expasy.org/ • Kvantitativní poměr mezi oběma složkami může být různý !! F32-072.jpg 001177E5Macintosh HD B74677AA: F08-29.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: F08-30a.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: F08-33.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: F08-32.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: Kolagen v kůži F08-31.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: α - keratin figure 4-25 F08-26.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: α – keratin - vlas β - keratin β - keratin Elastin