1
1
Metody chemického výzkumu
Fluorescenční spektroskopie
Fluorescence a další luminiscenční spektroskopie
Doba života, kvantový výtěžek
Intenzita fluorescence, zhášení a samozhášení
Spektra excitační a emisní
Spektrometr a postup měření
Aplikace
Spojení se separačními technikami
Jan Preisler
2
Luminiscence
Pro zájemce podrobněji:
Petr Táborský, Jan Preisler
Molekulová luminiscence
St v 17:00 v učebně AK1
3
Molekulová luminiscenční
spektroskopie
• Luminiscence je jev, při kterém molekula absorbuje energii
(např. ve formě fotonu) a následně ji vyzáří ve formě světla
• Molekulová luminiscenční spektroskopie je významná
analytická metoda (nízké detekční meze, selektivita)
• Fluorofor ... skupina v molekule zodpovědná za luminiscenci se
nazývá luminofor (fluorescence - fluorofor)
4
Klasifikace luminiscence
... podle zdroje excitační energie:
• fotoluminiscence
• chemiluminiscence
• bioluminiscence
• elektroluminiscence
5
Jablonského diagram
v=3
v=2
v=1
v=0
S0
S2
S1
T1
______ radiační přechody (s účastí fotonu)
............ neradiační přechody (bez účasti fotonu)
absorpce
absorpce
vibrační relaxace
vnější
konverze
fosforescence
přechod
mezi
systémyvnitřní
konverze
fluorescence
6
Franck-Condonův princip
• Zářivé přechody: přechod elektronu
je podstatně rychlejší než pohyb
jader
• V okamžiku vybuzení má molekula
v excitovaném stavu stejnou pozici
a moment atomových jader jako ve
stavu základním
• Excitovaná molekula má vyšší
energii, než základní uspořádání,
do kterého molekula přechází
dodatečně
• K luminiscenci dochází ze
základního uspořádání
2
7
Radiační (zářivá) deexcitace
Fluorescence
1. Po absorpci záření přechází elektron na jednu z vibračních hladin
stavu excitovaného stavu (S0Sn)
2. Vibrační relaxace a vnitřními konverze (přechody v rámci hladin S až
na S1)
3. Zářivý přechod na jednu z vibračních hladin základního stavu (S1 S0)
Fosforescence
1. Elektron přechází z nejnižší vibrační hladiny excitovaného stavu na
tripletovou hladinu (S1T1)
2. Vibračními relaxacemi přechází na nejnižší hladinu T1
3. Zářivý přechod na jednu z vibračních hladin základního stavu (S0).
Zakázaný přechod ... musí dojít ke změně spinu, aby byl dodržen
Pauliho princip  nízká pravděpodobnost přechodu a delší čas
vyhasínání.
8
Neradiační (nezářivá) deexcitace
Vibrační relaxace
Po excitaci na jednu z vibračních hladin (vn) excitovaného stavu (Sn)
dochází postupně k přechodu na nižší vibrační hladiny téhož
excitovaného stavu. Energie se rozptýlí v okolí (solvent).
Vnitřní konverze
Nezářivý přechod mezi stavy o stejné multiplicitě; typicky SnSn-1;
pravděpodobnostvzrůstá při překryvu daných vibračních hladin obou
stavů.
Mezisystémový přechod
Elektron může přejít do jedné z vibračních hladin tripletového stavu o
podobné energii (ST1). Přímý přechod (S0T1) absorpcí fotonu je
nepravděpodobný (nutná změna spinu).
9
Neradiační (nezářivá) deexcitace
Vnější konverze
Přenos energie do okolní – solvent, rozpuštěné látky, krystalová mřížka.
Souvisí se zhášením fluorescence.
10
Časové relace
Absorpce ~10-15 s (~perioda fotonu)
Vibrační relaxace 10-11 – 10-10 s
postupný přechod (Dv = 1), perioda vibračního pohybu ~10-13 s
Vnitřní konverze ~10-12 s
pravděpodobnost vzrůstá při překryvu vibračních hladin singletů
Fluorescence 10-10 – 10-6 s
obvykle z nulového vibračního pásu excitovaného singletu
Vnější konverze
energie předána okolí (solvent aj.)
Fosforescence 10-4 – 104 s
zakázaný přechod (změna stavu spinu)
11
0
2
4
6
450 500 550 600 650
Wavelength (nm)
IF(a.u.)
Emission
Excitation
Emisní a excitační spektra
• Emisní spektrum
závislost intenzity luminiscence na vlnové délce; lex=konst.
• Excitační spektrum (aktivační, absorpční)
závislost absorpce luminoforu (fluoroforu) na vlnové délce, lem=konst.
(rhodamin B)
12
Emisní a excitační spektra
Stokesův posun
Rozdíl mezi vlnovými délkami emisního a excitačního maxima (nm).
Antistokesův posun
Ve vzácných případech může být emisni maximum při kratší vlnové
délce než excitační maximum
Nejvyšší výtěžek fluorescence: excitace při lex max
Fluorescenční záření bývá posunuto k delším vlnovým délkám v
důsledku ztráty části energie konverzemi
U fosforescenčních spekter je posun k delším vlnovým délkám ještě
výraznější; přechod T1S0 je spojen s menším rozdílem energie
než přechod z S1S0
3
13
Emisní a excitační spektra
Zrcadlové pravidlo
emisní a excitační spektra organických látek mají podobný tvar, ale
jsou zpravidla zrcadlově obrácené
Vavilovův postulát
Tvar emisního spektra není ovlivněn vlnovou délkou excitace a lze
excitovat zářením s kteroukoli vlnovou délkou z excitačního
spektra.
Aditivita spekter
14
Zrcadlové pravidlo
15
Fluorescence a fosforescence
16
Aditivita spekter
17
Základní vztahy
A = c x ε = log (Io/I) (Lambert-Beerův zákon)
A – absorbance, c – koncentrace, ε – absorbční koeficient, x – tloušťka
kyvety, Io – světelný tok dopadající na vzorek, I - světelný tok prošlý
vzorkem
IF = k f Io (1-10-cxε)
IF – fluorescence (fotony/s), k – podíl emitovaných fotonů, které dorazí
na detektor, f – výtěžek fluorescence
IF ~ k f Io 2.3 c x ε
zjednodušený vztah pro nízké koncentrace
18
Výtěžek luminiscence
Kvantový výtěžek
fk = Nem/Nabs = Iem/Iabs = Iem/(I0-I) fk  1
Energetický výtěžek
fe = Eem/Eabs = hnem/hnex fe  fk (Stokesův posun)
N počet fotonů za sekundu
I světelný tok (emitovaný, absorbovaný)
E energie
n frekvence fotonu
k rychlostní konstanty
nradrad
rad
kk
k



4
19
Stanovení kvantového výtěžku
• fluorescenční standard musí mít absorpční a fluorescenční
maximum blízké látce, jejíž kvantový výtěžek stanovujeme
• fluorescenční standardy:
– roztoky
chinin bisulfát (250nm/450nm)
naftalén (290nm/330nm)
ovalén (342nm/482nm)
fluorescein (488nm/503nm)
rhodamin B (562nm/573nm)
– hranoly
x
st
st
x
stx
A
A
I
I

20
Vyhasínání luminiscence
Úbytek fluorescence: -dIF/dt = kF IF
Exponenciální průběh vyhasínání fluorescence: IF = IF0 e – t/ t
Doba života (luminescence lifetime): t = 1/ kF
... doba potřebná k poklesu fluorescence na hodnotu IF(t=0)/e
Časově rozlišená (time-resolved) luminiscence
t
IF
IF
e
t
21
Časově rozlišená luminiscence
Vyhodnocení
• poločas vyhasínání luminiscence (luminescence life-time), t1/2
nebo t - pokles na ½ nebo 1/e počáteční intenzity, nejlépe z log
závislosti
• time-gated fluorescence (integrace signálu v definovaném
iontervalu) – rozlišení mezi analyty s různou dobou vyhasínání
22
Struktura látek a luminiscence:
typy luminiscenčních přechodů
organické luminofory – typické luminiscenční přechody jsou hlavně:
p→ p*
p→ n*
anorganické luminofory
a) přechody mezi energetickými hladinami ligandu
b) přechody mezi energetickými hladinami kovu (d-d, f-f)
c) kov i ligand („charge transfer“ přechody)
23
Luminiscence organických
molekul – obecná pravidla
• podmínkou fotoluminiscence je absorbce
• intenzita luminiscence a posun emise k vyšším vlnovým délkám
roste s počtem konjugovaných aromatických kruhů (hyperchromní a
bathochromní posun)
• heteroatomy v aromatickém kruhu - vyšší intenzita luminiscence a
posun emise k vyšším vlnovým délkám
• heteroatomy mimo aromatický kruhu - vyšší intenzita luminiscence a
posun emise k vyšším vlnovým délkám (ale méně, než u
heteroatomů v arom. kruhu)
• stabilizace molekuly do planární konfigurace přispívá k zvýšení
intenzity luminiscence
24
Luminiscence organických molekul –
obecná pravidla
1. Nasycené uhlovodíky (bez p či n e-) obvykle nefluoreskují
2. Nearomatické uhlovodíky s několika dvojnými vazbami
fluoreskují zřídka. Sloučeniny s vysoce konjugovanými dvojnými
vazbami, např. karoteny, vykazují fluorescenci
3. Aromatické uhlovodíky fluoreskují (p-p*). Pravděpodobnost
fosforescence vzrůstá s výskytem n e- příp. substituentů.
4. Fosforescence podpořena v aromatických molekulách
přítomností karbonylové skupiny nebo heteroatomů (n-p*).
Výsledná zvýšená pravděpodobnost přechodu mezi systémy
obvykle snižuje intenzitu fluorescence.
5. Substituenty na aromatikém kruhu ovlivňují hladinu nejnižšího
excitovaného stavu a mohou dramaticky zvýšit kvantové
výtěžky a emisní vlnové délky (červený, bathochromní posun).
Donory e-, např –OH, zvyšují fluo. výtěžek, akceptory jej snižují.
5
25
Luminiscence organických molekul –
obecná pravidla
6. Vliv vnitřního těžkého atomu – vliv halidových substituentů:
podpora přechodů mezi systémy, ST.
7. S rostoucí velikostí a konjugovaností aromatického systému
roste kvantový výtěžek fluorescence, klesá výtěžek
fosforescence.
8. Luminiscence je typická pro molekuly s planární strukturou,
které jsou charakteristické vysokou konjugací e- a slabými
interakcemi s rozpouštědly.
9. Fluorescence z atomů kovů se obvykle vyskytuje v rigidních
organometalických komplexech, samotný ligand nemusí
fluoreskovat. Kromě přechodů v ligandech se na vzniku
fluorescence mohou podílet d e- a f e- (prvky vzácných zemin).
26
Struktura a luminiscence
27
Fotolumioniscence aromatických látek
28
Substituce aromátů skupinami
zvyšujícími konjugaci
O O
O OOH
kumarin
f= 0.0001
7-hydroxykumarin
f= 0.5
vliv substituentů: CR3  CH3  SR  SH  NH2  OR  OH
29
Vliv některých substituentů
30
Vliv vnitřního těžkého atomu
6
31
Luminiscence – vliv prostředí
Teplota
obvykle snižuje luminiscenci v důsledku vyššího dynamického zhášení
Solvent
viskozita – vyšší viskozita = méně kolizí, zvýšení fluorescence
polarita a schopnost tvorby H můstků ovlivňují povahu exc. stavu
např pro p-p* je excitovaný stav obvykle polárnější a zvýšení polarity
solventu snižuje energii exc. stavu více než energi stavu základního, což
vede k červenému posunu fluorescence. U přechodu n-p* je tomu
naopak.
pH
fluorescence protonované a neprotonované formy se mohou výrazně lišit
mezi pKa excitovaném a základním stavu může být řádový rozdíl
Vliv externího těžkého atomu
zvýšení fosforescence podpořením přechodů mezi systémy
32
Zhášení luminiscence
Jevy vedoucí k redukci intenzity luminiscence
1. statické zhášení - např. nefluorescenční komplex, energii
absorbuje jiná část molekuly atd.
2. dynamické (kolizní) zhášení – srážka s molekulou zhášedla
(např. solventu)
3. vnitřně-filtrační efekt (reabsorpce u molekul s malým
Stokesovým posunem)
4. fotovybělování – degradace luminoforu vlivem světla, kterým
excitujeme
5. koncentrační zhášení (nelinearita při vyšších koncentracích)
33
Instrumentace - fluorimetr
Fluorimetr
• měření celkové fluorescence
• kvantitativní analýza
• zdroj záření: lampa nebo laser (větší citlivost stanovení)
• místo monochromátoru(ů) může být filtr
Spektrofluorimetr
• měření fluorescenčních (emisních a excitačních) spekter
• zdroj záření: zpravidla lampa (možnost volby vlnové délky
exc. záření)
• možné další režimy (synchronní sken, časově závislá fluo aj.)
34
Měření fotoluminiscence
Zdroj
lampa (Xe, deuteriová, atd.), laser
(různé typy), LED
Excitační monochromátor (M1)
výběr excitační vlnové délky, není
nutný u laserového excitačního
zdroje
Emisní monochromátor (M2):
výběr emisní vlnové délky
Detektor:
úhel nastavení detektoru je
zpravidla 900.
M1
Zdroj
Vzorek
M2Detektor
35
Instrumentace
AMINCO- Bowman, Series 2 (AB-2)
36
Zdroje excitačního záření
• Lampa
• Laser
• LED
7
37
Lampa
Typ
xenonová (200-1500nm, UV-Vis)
deuteriová (185-370 nm, hlavně UV oblast)
rtuťová výbojka (253.4 nm a 302.6 nm)
Výhody
zpravidla možnost výběru z velkého rozmezí
vlnových délek a nízká cena
Nevýhody
slabý výkon (při vybrané vlnové délce)
38
Typické spektrum lampy
39
Laser
Jako zdroje excitačního záření lze použít pulsní i kontinuální lasery
Výhody
vysoký výkon při dané vlnové délce
koherence
prostorové vlastnosti paprsku (zaostření, kompatibilita s
mikrometodami)
pulsní lasery pro studium časově závislé fluorescence
Nevýhody
rel. vysoká cena
fixní excitační vlnová délka
Laditelné lasery
diskrétně a kontinuálně laditelné lasery
40
Běžné lasery
41
LED
• light-emitting diodes
• rozvoj CD, DVD, blue ray
• běžné v IR a Vis, nyní i v UV
• pro fluorimetrii vhodné UV a Vis LED
• Vis: 450 - 800
• UV: 285 – 400
42
Monochromátory
• Filtr
• Hranol
• Mřížka
8
43
Detektory
Požadavky
• vysoká citlivost
• široký dynamický rozsah
Fotonásobič (PMT)
Charge-Coupled Device (CCD)
Diode array (DA)
44
Instrumentace pro časově rozlišenou
luminiscenci
excitace zábleskovou lampou
obvykle pro časy delší než desítky mikrosekund (nejčastěji Xe lampa)
excitace pulsním laserem
velmi krátké trvání pulsu
femtosekundové lasery (Heisenbergův princip: Dt vs. Dn)
45
Srovnání absorpční a luminiscenční
spektroskopie v oblasti UV-Vis
Spektroskopie v oblasti UV-Vis A = c x ε = log(Io /I)
Absorpční spektroskopie: měření poměru dvou světelných toků
+ přesnost (odolnost vůči změnám abs. hodnoty světelného toku Φo)
- citlivost při (nepatrný rozdíl mezi Io/I při nízké koncentraci analytu)
Luminiscenční spektroskopie F ~ k φ Io 2.3 c x ε
Luminiscenční spektroskopie: měření vyzářené energie
+ vysoká citlivost při použití citlivého detektoru (i jednotlivé fotony)
- přesnost (fluorescence je přímo úměrná ecitačnímu světelnému toku (Io);
projevuje se u ní negativně kolísání excitačního zdroje
46
Další režimy spektrofluorimetru
3D spektra
• emisní spektrum vs. excitační
• emisní (resp. excitační spektrum) vs. čas
• vyhasínaní luminescence vs. emisní spektrum
Synchronní sken
• Současný sken obou monochromátorů
• Stokesův posun je konstantní
• Stokesův posun není konstantní (jen speciální případy)
47
Příklad: synchronní sken
Ref: E. Sikorska, T. Górecki, I. V. Khmelinskii, M. Sikorski and D. De Keukeleire, J. Inst. Brew. 110(4), 267–
275, 2004
48
Příklad 3D spektra:
Luminiscence lanthanoidů
Tb3+, Eu3+, Dy3+, Sm3+ a Gd3+
9
49
Využití luminiscence v chemickém výzkumu
• stanovení anorganických a organických sloučenin a biosloučenin
• stanovení sloučenin s vlastní fluorescencí
• stanovení anorganických iontů a prvků (tvorba chelátů s organickými
činidly)
• fluorimetrická indikace ekvivalenčního bodu (stanovení Ca2+, Ba2+,
Sr2+ chelatometricky za přítomnosti fluorexonu)
• fluorescenční acidobazické indikátory: naftylamin (pH 3.4 – 4.8),
chininbissulfát (pH 3.0 – 5.0), akridin (pH 4.8 – 6.6)
• oxidačně redukční fluorescence: Hg2+ oxiduje thiamin na thiochrom
(fluoreskuje)
• široká škála biologických aplikací: informace o kvantitě, struktuře,
vzájemných interakcích a lokalizaci
50
Luminiscence lanthanoidů
- příklad anorganické luminiscence
7F
5D1
0
Absorption
Ligandfluorescence
Phosphorescence
Internal crossing
Energy transferT1
1
S1
1
S0
„Anténový efekt“ – ligand
absorbuje energii, která je
převedena na centrální iont,
který vyzáří kvantum
energie
Charakteristické rysy luminiscence lanthanoidů:
• dlouhé časy vyhasínání
• dlouhý Stokesův posun
• ostré píky náležící energetickým přechodům mezi hladinami
51
Příklady stanovení anorganických iontů
Stanovení Al 3+ fluorimetricky s alizarinem
52
Příklady stanovení anorganických
iontů – fluorescence v pevné fázi
• fluorescence UO2
2+ v taveninách (NaF, KF, LiF aj.)
• luminiscence nosičů polovodičového typu v přítomnosti
aktivátorů
nosič: CaO, CaSO4, NaF, CaCO3
aktivátor: Sb, Bi, Tl, Sn, lanthanoidy
53
Příklady luminiscenčních stanovení – organické
látky a biomolekuly s vlastní fluorescencí
54
Derivatizace
Rhodamine B (c
=1x10-12 mol.l-1)
Rhodamin B (c =1x10-12 mol.l-1)
Vnitřní (nativní) x vnější luminiscence - značky a sondy
Molekuly bez vlastní (vnitřní, nativní, přirozené) luminiscence lze
derivatizovat luminiscenčními značkami/sondami
Detekce jednotlivých molekul a obsahu jednotlivých buněk
„single molecule/cell detection“)
10
55
Výběr fluorescenčních značek
Kritéria:
spektrální vlastnosti (excitace, emise, kvantový výtěžek atd.)
vazebné místo (-NH2, -SH skupina a další)
podmínky reakce (pH, koncentrace...)
další vlastnosti (acidobazicita, hydrofobicita ...)
56
Fluorescenční značky a sondy
fluorescenční značky (fluorescent labels)
nevlastní (extrinsic fluorescence) fluorofory, které se ke sledovaným
biomolekulám (proteinům, peptidům, ligandům, oligonukleotidům a
jiným) vážou kovalentní vazbou
fluorescenční sondy (fluorescent probes)
nevlastní fluorofory, které se ke sledované struktuře vážou
nekovalentně a často přitom mění své fluorescenční vlastnosti
Značky a sondy jsou velmi důležitými nástroji především v bioanalytice
57
Použití luminiscenčních značek
• analytické stanovení (příp. v kombinaci se sep. metodou)
• fluorescenční mikroskopie, značení buňek a tkání
• fluorescenční in situ hybridizace (FISH)
• měření vzdálenosti funkčních skupin (FRET)
• průtoková cytometrie
• fluorescenční „imunoassays“
58
Výběr fluorescenční značky –
spektrální vlastnosti
59
Výběr fluorescenční značky –
spektrální vlastnosti
RBITC
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
450 500 550 600 650
λ [nm]
IF[a.u.]
Emise
Excitace
O
OH
O
N
+
NCH3
CH3
CH3
CH3
N
S
N
S
Cl
Analyt:
peptidy, aminokyseliny, aminosloučeniny
Nd:YAG (x2): 532 nm rhodaminB isothiokyanát
Ar+: 488 nm fluorescein isothiokyanát
60
Fluorescenční značky
• Klasifikace fluorescenčních značek podle vazebného
místa biomolekuly:
aminová skupina
thiolová skupina
další
11
61
Výběr fluorescenční značky – vazebná
místa: amino-reaktivní značky
sukcinimidyl estery (Rh6GSE)
sulfonyl chloridy
isothiokyanáty (FITC, RBITC)
62
Výběr fluorescenční značky dle
vazebného místa: thiol-reaktivní značky
63
Fluorescenční imunoanalytické metody
• Fluorescence Immuno Assay (FIA)
• Fluorescence Polarization Immuno Assay (FPIA)
• Time Resolved Fluorescence Immuno Assay (TR-FIA)
• Elektroluminiscenční, chemiluminiscence a další
• Enzymatické metody s luminiscenční detekcí
• náhrada radioimuno technik s příchodem levných laserů a kvůli
vyšší bezpečnosti
• detekční limity obou metod jsou srovnatelné (až 10-12 g.l-1)
64
Fluorescenční sondy pro NK
• Vizualizace a identifikace RNA a DNA
• Různé principy interakce, např. „vmezeření“ barviva do šroubovice
DNA (ethidium bromid)
ethidium bromid akridinová oranž
65
Nativní fluorescence peptidů a proteinů
V peptidech a proteinech fluoreskují zejména: W, Y a F.
W fluoreskuje nejvíce, Y je nejpočetnější, W může zhášet Y.
Excitace v oblasti UV, emise od 280 nm po 400 nm.
Dále mohou fluoreskovat různé prostetické části proteinů (např.
kofaktory), ale mohou také zhášet...
tryptofan (W)
O
NH2
OH
fenylalanin (F)
O
NH2OH
OH
tyrosin (Y)
O
NH2NH
OH
66
Nativní fluorescence aminokyselin,
proteinů a peptidů
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
4,50
5,00
5,50
6,00
6,50
7,00
270 290 310 330 350 370 390 410 430 450 470
l [nm]
IF[a.u.]
Trp
Tyr
Phe
0
7.0
Trp Tyr Phe
lmax (nm) 348 303 282
ff 0.20 0.14 0.04
tf (ns) 2.6 3.6 6.4
Abs lmax (nm) 280 274 257
Abs emax 5600 1400 200
emax • ff 11 2 0.008
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
1,60
1,80
2,00
2,20
280 300 320 340 360 380 400 420 440 460
l [nm]
IF[a.u.]
Inhibitor trypsinu
Ribonukleáza A
Anhydráza uhličitá
Myoglobin
BSA
Inzulin
Cytochrom C
12
67
Nativní fluorescence peptidů a proteinů
Unfolded (nesbalený):
volná rotace, více kolizí,
větší vliv polárnějšího
solventu
Folded (fixní konformace):
méně kolizí, fluorescence je
ovlivněna nepolárním
jádrem proteinu
Se zvyšující se polaritou
prostředí (konformace, solvent)
roste emisní maximum
68
Green Fluorescent Protein (GFP)
Zeleně fluoreskující protein (GFP)- izolován z
medúzy.
Fluorescence pochází z konjugovaného systému
vzniklého cyklizací vedlejšího řetězce proteinu a
následnou oxidací sekvence Ser-Tyr-Gly.
GFP má dva výrazné excitační pásy (kolem 395 a
475 nm) a maximum emise je 508 nm. V živém
organismu je energie získána chemickou reakcí
(chemiluminiscence).
Po modifikaci DNA
mohou produkovat
GFP také jiné
organismy
(bakterie, mušky,
savčí buňky...)
69
GFP, YFP a další...
Proteiny s výraznou vlastní (vnitřní) fluorescencí jsou využívány:
• neinvazivní fluorescenční „marker“ přímo v živých buňkách
• sledování exprese genu
• interakce protein-protein
70
Spojení separačních technik
a fluorescence
Kolonové i planární separační techniky - HPLC, CE, ITP, 2D GE aj.
Laser výhodný jako zdroj excitačního záření zvláště pro on-column
detekci u mikrokolonových sep. technik
• LIF (laser induced fluorescence)
• kompatibilita laserového paprsku s mikrokolonovými technikami
- dostatečný světelný tok i při rel. malém výkonu laseru (~mW)
- vyšší toky způsobují bělení
• pro danou třídu analytů, resp. derivátů zvolen vhodný laser podle
vlnové délky
• jednoduchá sestava
71
Příklad: schema sestavy CE LIF
detektorová
vialka
laser
mikroskopový objektiv
na posuvném držáku
štěrbina
zdroj
vysokého
napětí
injekční vialka
v karuselu
skříň
kapilára
fotonásobiččočka
filtry
stínítko
72
Konstrukce CE LIF
13
73
Výběr luminiscenčního barviva –
spektrální vlastnosti
74
CE LIF: velmi nízké detekční limity
Analyt: Rhodamin B, c = 1x10-12 mol/l, excitace: 532 nm, 5 mW; emise: >
560 nm, kapilára: 50 mm i.d., 375 mm o.d., l = 30/37 cm, dávkování: U = 5
kV, ti = 10 s nebo Dh = 2cm, ti = 30s, separace: 0,02 mol/l fosfát v 10%
MeOH, pH 10; U = 10 kV
LOD ~ 2 x 10-13 mol/l ... ~102 molekul
40
60
80
100
120
140
160
180
200
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260
t[s]
I[a.u.]
7
75
-0.00005
-0.00003
-0.00001
0.00001
0.00003
0.00005
0.00007
0.00009
300 350 400 450 500 550
t (s)
Absorbance,540nm
LOD: srovnání s absorbanční detekcí
Analyt: Rhodamin B, c = 1x10-5 mol/l (při obdobném dávkování)
76
Rhodamin B Rhodamin 6G
Rhodamin 123
Separace rhodaminových barviv
77
-32600
-32400
-32200
-32000
-31800
-31600
-31400
-31200
0 100 200 300 400 500 600 700 800
t (s)
Fluorescence(lib.jedn.) 1
2
3
4
Separace rhodaminových barviv
Píky: 1, 2 - Rh 123, 3 - Rh 6G, 4 - Rh B
78
-32500
-32000
-31500
-31000
-30500
-30000
-29500
0 100 200 300 400 500 600 700 800
Fluorescence(lib.jedn.)
-33000
-32500
-32000
-31500
-31000
-30500
-30000
0 100 200 300 400 500 600 700 800
t (s)
Fluorescence(lib.jedn.)
blank
peptid
*
14
Rodina proteinů AHP – rozsah fosforylace?
To, J.P.,Kieber, J.J. Trends Plant Sci. 2008, 13, 85-92
Cytokininová signální
dráha rostlin
A. thaliana proteiny AHP
(Arabidopsis
Histidinephospho-transfer
Proteins)
AHP1-5 fungují jako
proteiny HPt
doména HPt s evolučně
konzervovaným
strukturním motivem
XHQXKGSSXS
Role fosforylace na His?
79
Fosfohistidin (pHis)
SICKMANN, A; MEYER, HE. Analyst. 2005, 130, 9, s. 1263-1270.
typ fosforylované prostředí
aminokyseliny kyselé zásadité
O-fosfáty
fosfoserin stabilní nestabilní
fosfothreonin stabilní nestabilní
fosfotyrosin stabilní stabilní
N-fosfáty
fosfohistidin nestabilní stabilní
fosfoaspartát nestabilní nestabilní
fosfoglutamát nestabilní nestabilní
acyl-fosfáty
fosfoarginin nestabilní stabilní
fosfolysin nestabilní stabilní
S-fosfáty fosfocystein stabilní stabilní
80
• 2 izomery pHis
• 6 % z celkového
počtu fosfoproteinů
...nelze separovat 2D PAGE  CE-LIF
• separace v nativním prostředí
• specificita
• fúzní proteiny AHP-GFP
CE-LIF standardu GFP
LOD [ng/ml] LOD [M] V [nl] Ref.
0,08 3,0.10-12 17 1
- 1,3.10-10 3 2
90 3.10-9 1,9 3
10 4.10-10 0,6 tato práce
Δh = 3 cm, tinj = 5 s, U = 8 kV, 50 mM Tris se
50 mM NaCl, pH = 9,0
1. Craig, D. B.; Wong, J.
C. Y.; Dovichi, N. J.,
Biomedical
Chromatography
1997, 11 (4), 205-206.
2. Zhang, H. F.; Ma, L.;
Liu, X.; Lu, Y. T.,
Journal of
Chromatography B-
Analytical
Technologies in the
Biomedical and Life
Sciences 2004, 804
(2), 413-420.
3. Korf, G. M.; Landers,
J. P.; Okane, D. J.,
Analytical
Biochemistry 1997,
251 (2), 210-218.
81
2,5
3
3,5
4
4,5
5
5,5
4 5 6 7 8
t [min]
fluorescence[a.u.]
10 µg.ml-1
1 µg.ml-1
0,1 µg.ml-1
Elektroforegram standardu GFP
CE-LIF 0,01 µg.ml-1
10 µg.ml-1
1 µg.ml-1
0,1 µg.ml-1
0,03 - 20 µg.ml-1 vždy v objemu 30 µl
Western blot ~1,0 µg.ml-1 CE-LIF ~0,01 µg.ml-1
WB standardu GFP
Western blot standardu GFP
82
LOD