09/12/2014
1
MALDI TOF MS
Základy MALDI, TOF a vybrané aplikace
Iva Tomalová Metody chemického výzkumu, 10.12.2014
Náplň přednášky
1. MALDI
- princip, role matrice
2. Průletové analyzátory
3. Vybrané aplikace MALDI MS
2
Hmotnostní spektrometrie
vstup Iontový
zdroj
Hmotnostní
analyzátor
Detektor
vakuum PC Hmotnostní spektrum
3
MALDI
• z anglického Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization
(=laserové desorpce a ionizace za účasti matrice)
• měkká ionizační technika pro analýzu biomolekul
• velmi nízký stupeň fragmentace
• jednoduchá spektra (typicky: z = 1)
• rychlá příprava a analýza
• nízké detekční limity (LOD pro peptidy: amol)
4
09/12/2014
2
Z historie
Franz Karas a Michael Hillenkamp:
• MALDI pro ionizaci analaninu (1985) i větších peptidů (1987) v přítomnosti
tryptofanu jako matrice s 266 nm laserem
Koichi Tanaka:
• „ultra fine metal plus liquid matrix method”
• nanočástice kobaltu + glycerol pro ionizaci karboxypeptidasy A
(35 kDa) s 337 nm laserem (1987)
Karas, M.; Bachmann, D.; Hillenkamp, F. (1985). "Influence of the Wavelength in High-Irradiance Ultraviolet Laser Desorption Mass Spectrometry of
Organic Molecules". Analytical Chemistry 57 (14): 2935–9.
Karas, M.; Bachmann, D.; Bahr, U.; Hillenkamp, F. (1987). "Matrix-Assisted Ultraviolet Laser Desorption of Non-Volatile Compounds". International Journal
of Mass Spectrometry and Ion Processes 78: 53–68.
Tanaka, K.; Waki, H.; Ido, Y.; Akita, S.; Yoshida, Y.; Yoshida, T.; Matsuo, T. (1988). "Protein and Polymer Analyses up to m/z 100 000 by Laser Ionization
Time-of flight Mass Spectrometry". Rapid Communications in Mass Spectrometry 2 (20): 151–3.
Nobelova cena
za chemii (2002)
5
MALDI
MALDI = Matrice + Analyt + Laser + Destička + Instrumentace
Široký pojem:
- různé analyty
- různé matrice
- odlišné způsoby přípravy vzorku
- různá instrumentace (AP-MALDI, vakuová MALDI)
- …
6
Matrice MALDI
Matrice MALDI by měla splňovat následující podmínky:
inkorporace analytu excitace matrice desorpce a ionizace analytu
V nadbytku nad analytem
• matrice: analyt (malé molekuly) 100 : 1
• matrice: analyt (proteiny) 10 000 : 1
• separovat (ředit) a inkorporovat jednotlivé molekuly analytu (např. skrze ko-krystalizaci)
• být rozpustná v solventech kompatibilních s analytem
• být stabilní ve vakuu
• absorbovat při vlnové délce použitého laseru
• mediovat ko-desorpci analytu při ozářením laserem
• ionizovat analyt 7
- deriváty kyseliny benzoové, nikotinové,
skořicové,… (aromatické kyseliny)
- nekyselé matrice
Matrice MALDI
8
09/12/2014
3
Matrice MALDI
Peptidy: 4-hydroxy-α-kyanoskořicová kyselina (HCCA)
4-chloro-α-kyanoskořicová kyselina (ClCCA)
Proteiny: sinapová kyselina (SA)
2,5-dihydroxybenzoová kyselina (DHB)
2,5-dihydroxyacetofenon (DHAP)
Glykany: DHB, sDHB
Nukl. kys.: 3-hydroxypicolinová kyselina (HPA)
2,4,6-trihydroxyacetofenon (THAP)
Malé mol.: 9-aminoakridin (9AA)
Univerzální MALDI matrice: HCCA/DHB, 1:1
Nekovalentní komplexy: 6-aza-2-thiothymin (ATT)
DHAP
DHB/NH3
9
4-chloro-α-kyanoskořicová kyselina
- 1. „racionálně“ navržená matrice
pro MALDI MS
- Substituce na poloze R1 (OH -> Cl):
nižší protonová afinita
(841 -> 832 kJ/mol)
- vyšší citlivost
- jednotnější odezva různých analytů
(nižší efekt suprese analytu analytem):
lepší pokrytí sekvence proteinu při
PMF
MALDI mass spectra of a tryptic in-solution digest of BSA using
Cl-CCA (A) or CHCA (B) as a matrix. Mass numbers of assigned
BSA peptides are given only for those signals occurring in three
independent mass spectra within ± 20 ppm; m/z section 1,100–
1,400 Da; total sample load, 1 fmol.
Jaskolla TW, Lehmann WD, and Karas M: 4-Chloro-α-cyanocinnamic acid is an advanced, rationally designed MALDI matrix (2008), PNAS 105, 34, 12200-12205
Cl
10
Alternativní “matrice” a aditiva
• Nanomateriály (SALDI)
• Absorbující, strukturované povrchy (SALDI, DIOS, ...)
• LDI (bez matrice)
• aditiva:
• sacharidy, kationizační činidla
11
Příprava vzorku pro MALDI MS
• vysušení kapky směsného roztoku (dry droplet)
• smíchání a vysušení na terčíku (quick & dirty)
• urychlení vysoušení ve vakuu (vacuum drying)
• nejprve vrstva matrice v těkavém solventu (fast evaporation)
• vrstva matrice, pak vrstva matrice s analytem (overlayer)
• vrstvy: matrice, analyt, matrice (sandwich)
• krystaly rozdrceny, převrstveny roztokem vzorku (crushed crystals)
• rozpuštění vzorku v kapce acetonu (acetone redeposition)
• nanášení na rotující terčík (spin coating)
• pomalý růst krystalů (slow crystallization)
• nanášení elektrosprejem (electrospray deposition)
VELIKOST,
MORFOLOGIE
KRYSTALŮ
INKORPORACE
ANALYTU
ELIMINACE
KONTAMINANTŮ
SELEKTIVNÍ
EXTRAKCE
12
09/12/2014
4
Příprava vzorku pro MALDI
• MALDI MS nespotřebuje velké množství vzorku
• empirický přístup
• tenké vrstvy, nižší koncentrace matrice mohou poskytnout lepší data:
vyšší rozlišení, nižší LOD
• Neexistuje univerzální protokol nebo matrice pro všechny analyty
• Dry-droplet (suchá kapka) je obvykle nejlepší startovní bod pro další optimalizace
13
Zásady přípravy vzorku
• Čistá matrice
• Čerstvý roztok matrice
• Vhodná volba solventu (ACN, EtOH, MetOH, aceton, voda)
• Analyt musí být rozpuštěný
• Matrice musí být rozpuštěná (nasycený roztok centrifugovat!)
• Čistý terčík
• Purifikace analytu před MALDI analýzou
• Neznámý analyt – příprava série roztoků o různých koncentracích
• Nanesené vzorky jsou obvykle stabilní (skladování terčíků se vzorky, ne ve vakuu!)
Převzato (a upraveno) z: www.bart.chemi.muni.cz
14
• pulsní lasery
• 1 puls = 1 spektrum
• typicky průměrování několika set až tisíc spekter
• Klíčový parameter pro MALDI MS měření: zářivá expozice (laser fluence)
!!! zářivá expozice (fluence; energie pulsu laseru vztažená na plochu; J/m2)
vs. hustota výkonu (výkon laseru vztažený na plochu, W/m2) !!!
• pro MALDI je určující zářivá expozice, ne hustota výkonu
(nicméně délka pulsu je podobná pro dusíková a Nd:YAG laser)
Lasery
15 16
Nejběžnější lasery:
Dusíkový laser (337 nm, 3 ns):
pro: dobře strukturovaný energetický profil
contra: pomalý (maximum 50Hz)
Nd:YAG laser (355 nm, 4-7 ns):
pro: rychlý (až 1000Hz)
contra: Gausovský energetický profil
Smartbeam/Smartbeam II (modifikovaný Nd:YAG laser):
pro: rychlý (až 2000Hz)
pro: dobře strukturovaný energetický profil
Zdroj: materiály firmy Bruker
09/12/2014
5
Další lasery
IR lasery
- Er:YAG laser: 2.94 µm; Er:YSGG: 2,79 µm (tpuls= 50 - 100 ns)
- absorbce: změny vibračních stavů molekul matrice (O-H, N-H
vibrace)
- CO2 laser: 10.6 µm
- „měkkčí“ než typické UV, méně aduktů
- jiné matrice MALDI: glycerol, sukcinová kyselina
Laditelné lasery
- UV i IR
- speciální aplikace
17
Prahová hodnota zářivé expozice laseru
• Hodnota, při které se začínají objevovat signály
• Různá pro různé matrice
• Různá pro různé analyty
• Různá pro různé analyzátory i detektory
• Pracovní oblast: 10 – 30% nad prahovou
hodnotou
K. Dreisewerd: The Desorption Process in MALDI,
Chem. Rev. 2003, 103, 395−425
www.bart.chemi.muni.cz
18
Některé parametry pro UV-MALDI
H=H0*e-αz
H zářivá expozice ve hloubce z vzorku (J/m2)
(energie 1 pulsu vztažená na plochu)
H0 zářivá expozice na povrchu vzorku (obvykle 20-200 J/m2)
α absorbční koeficient
(1/α – penetrační hloubka: hloubka, kde dojde k poklesu “fluence” na 30%; 20-200 nm)
množství absorbované energie vztažené na jednotku objemu… Ea/V
Ea/V=H*α JÁDRO PROCESU MALDI:
jde především
o množství energie
absorbované matricí !!!
19
Některé parametry pro UV-MALDI
zářivá expozice 100 J/m2
tok fotonů 1.7 x 1016 foton/cm2 (337 nm, 3.7 eV)
0.7 fotonů absorbovaných na 1 molekulu matrice
- velké množství energie odpovídající celkové energii všech
intermolekulárním interakcím v pevné fázi
-> ablace, exploze materiálu
- nedostatečné pro 2 fotonovou absorbci a ionizaci
(IP matric MALDI: 8 eV)
20
09/12/2014
6
Kvantifikace?
• obtížná
• homogení vzorky
• průměrování velkého množství spekter z mnoha pozic
• kapalné matrice MALDI
(netěkavé, glycerol jako solvent)
• vnitřní standard
• diskriminační efekty (kompetice o náboj)
zaostřený
laserový paprsek
21
Terčík MALDI
• klasický MALDI terčík
• modifikované terčíky
• AnchorChip
• “home-made”
• koncentrace analytu, lokalizace pro automatická měření
• ITO sklíčka (zobrazovací MS)
Bruker MU ETHZ
22
Terčík MALDI: nejen nosič vzorku
• Možnost re-analýzy a archivace
• pole na terčíku: “mikroreaktor”
• enzymatické i jiné reakce
• možnost aplikace více detekčních technik
23
Hmotnostní analyzátory pro MALDI
• MALDI bylo spojeno s prakticky všemi hmotnostními analyzátory
• pulsní generace iontů předurčuje MALDI pro spojení s průletovým
hmotnostním analyzátorem: MALDI TOF MS
• iontový zdroj ve vakuu = vakuová ionizace
• geometrie iontového zdroje (vložená napětí) ovlivní kvalitu spekter
• spojení s pasťovými analyzátory (FT-ICR MS, Orbitrap, ...)
• nutný transport iontů
• delší doba analýzy!
• často AP-MALDI (měkkčí ionizace?)
24
09/12/2014
7
• Lineární
• Reflektorové
• TOF/TOF
• lineární kolizní cela
• reflektor pro MS2
S
D
zdroj deflektor iontové zrcadlo
TOF1
S
D
selektor kol. cela
TOF2
S D
25
Průletový analyzátor
- axiální uspořádání
Průletový analyzátor: lineární uspořádání
doba letu (m/z)
intenzita
MALDI terčík
= odpuzovací
elektroda (19 kV)
iontový zdroj letová zóna (E = 0)
extrakční mřížky
(17 a 0 kV)
lineární
detektor
laser
optický filtr
zrcátko
čočka
urychlení iontů v = konst.
26
1. Pulsní ionizace (doba pulsu ~ ns): rychlé vytvoření obláčku iontů (LDI,
MALDI, PD, EI …)
2. Extrakce a urychlení iontů v elektrickém poli
3. Separace iontů v driftové zóně při E = 0 (field-free region, flight tube)
4. Detekce iontů, záznam signálu, transformace do m/z domény
urychlovací energie kinetická energie
délka driftové zóny
doba letu
2
mv
Uez
2

Princip průletového analyzátoru
t
L
v 
2
2
L
t
U
z
m
e2
TOF
S
(m/z)1<(m/z)2
27
Lineární uspořádání
• energie (rychlost) iontů s daným m/z se po laserové desorpci liší
velikostí i směrem
• důsledek vysoké počáteční disperze energií: ionty s daným m/z dopadají
na detektor v různých časech: rozšíření píků
• rozlišení: R =
m
Δm
detektor
laser
28
09/12/2014
8
Zvyšování rozlišení:
1. Příprava vzorku
2. Použití zpožděné extrakce
3. Použití reflektoru
29
1. Příprava vzorku
Rozptyl iontů
v prostoru
iontového
zdroje
Rozlišení
30
2. Zpožděná extrakce
31
Iontový zdroj
Detektor
U1 U2
U
t < tzpož.
t > tzpož.
3. Reflektor
doba letu (m/z)
intenzita
iontový zdroj
(19 kV)
letová zóna (E = 0) reflektor (>19 kV)
reflektorový
detektor
mřížky a elektrody reflektoru
laser
32
- na reflektor je vloženo vyšší napětí než je urychlovací napětí
- ionty s vyšší počáteční rychlostí/energií pronikají hlouběji do reflektoru, urazí v analyzátoru
delší dráhu a dopadají na detektor ve stejném čase jako ionty o stejné m/z s nižší počáteční
energií
09/12/2014
9
Zvyšování rozlišení
MALDI TOF MS
lineární uspořádání
MALDI TOF MS
lineární uspořádání
+ zpožděná extrakce
MALDI TOF MS
reflektorové uspořádání
+ zpožděná extrakce
peptidy, malé molekuly,
lipidy, ...
proteiny
33
MALDI TOF/TOF MS
doba letu (m/z)
intenzita
iontový
zdroj 1
letová zóna 1
reflektor (>19 kV)
reflektorový
detektor
Laser (↑energie)
vznik a
urychlení
iontů
separace mateřských
iontů/rozpad
metastabilních iontů
CID
selekce iontu
prekurzoru
iontový
zdroj 2
urychlení
fragmentů
letová zóna 2
separace
iontů
fragmentů
LIFT cela
34
MALDI TOF/TOF MS
• Tandemová hmotnostní spektrometrie:
fragmentace iontů - > strukturní analýza
1. Fragmentace:
• využívá vyšší energie laseru: vznik metastabilních iontů
(laserem indukovaná disociace, LID)
• fragmentace může být podpořena kolizním plynem
(kolizemi indukovaná disociace, CID)
! K fragmentaci dochází za zdrojem, fragmenty i prekurzory letí stejnou rychlostí!
2. Výběr mateřských iontů v 1. letové zóně
3. Re-akcelerace iontů fragmentů
4. MS analýza iontů fragmentů
35
MALDI TOF/TOF MS
36
09/12/2014
10
Vlastnosti TOFMS
• Teoreticky neomezený rozsah m/z (analýza celých buněk či nanočástic)
• Ideální pro pulsní ionizaci
• pro každý puls zaznamenáno celé spektrum, není třeba skenovat
• Velmi krátká doba záznamu spektra (~10-4 s)
• Vysoká propustnost iontů ... předpoklad vysoké citlivosti
• Jednoduchost
37
Typické analyty/aplikace MALDI:
MALDI MS
proteomikazobrazovací MS
identifikace mikroorganismů
charakterizace
polymerů
analýza PTM
aplikace s vyžadující rychlé analýzy (high throughput), zachování informace
o distribuci vzorku, malé množství vzorku, nepolární analyty, ...
lipidomika, glykomika
analýza malých molekul
analýza nukleových kyselin
38
Proteomické aplikace MALDI TOF MS:
peptidové mapování
• identifikace proteinů: obvykle na základě separace (GE, LC), tryptického
štěpení proteinů a MS
• peptidové mapování (PMF, peptide mass fingerprinting): identifikace na
základě specifického “fingerprintu” – produktů enzymatického štěpení
proteinu; srovnání fingerprintu s knihovnou známých proteinů
• vyžaduje izolaci jednotlivých protein (ne více než 2-3)
• typicky používaný enzym: trypsin
39
2D GE Databáze
štěpení in silico
štěpení
MS
848.1
1272.5
883.2
2978.9
812.6
1432.3
3127.1
996.8
702.1
2784.2
1765.6
848.1
1272.5
493.2
883.2
2978.9
364.1
3128.8
3614.2
2837.1
263.9
1429.7
640.8
876.9
1260.7
je identický s
Peptidové mapování
40
09/12/2014
11
Databázové hledání, analýza dat
41
- negativní výsledek: nový protein!
Známé údaje:
- Původ vzorku (organismus)
- MW, pI
42
Zobrazovací hmotnostní spektrometrie
• zobrazování prostorové distribuce analytů v biologických vzorcích
• přímá vizualizace bez derivatizace
• typické analyty: lipidy, metabolity, proteiny, peptidy
• vzorky: řezy orgány, celými organismy, rostlinný materiál, …
• rozlišení: hmotnostní, laterální a hloubkové
43
NatureReviewsCancer10,639-646(September2010)|doi:10.1038/nrc2917
44
09/12/2014
12
Zobrazovací hmotnostní spektrometrie
• Příprava vzorku:
• řezání na kryotomu (tloušťka: 5-20 µm)
• fixace na mikroskopová sklíčka (vodivá)
• Nanášení matrice:
• piezoelektrické dispensery, nebulizéry, elektrosprej, sublimace
• dramaticky může ovlivnit laterální rozlišení
• MALDI MS
• nastavení velikosti rastru, zaostření laserového paprsku
• kompromis mezi dobou akvizice a laterálním rozlišením
45
Identifikace mikroorganismů
• klinická aplikace; “MALDI biotyping”
• rychlá identifikace/klasifikace bakterií, mnohobuněčných hub i kvasinek
• identifikace na základě porovnání spektrálních profilů lyzátů celých
bakterií (ribosomální proteiny)
46
MALDI biotyping: schéma
47
„Fingerprinty“ ribosomálních proteinů
různých organismů
48
09/12/2014
13
Dále...
Navazující předměty:
• C7895 Hmotnostní spektrometrie biomolekul
• C8102 Speciální metody – praktikum
Pracoviště na MU:
• Oddělení analytické chemie, PřF MU
• CEITEC, výzkumná skupina Proteomika
49