Luminiscencia
Jozef Hritz
jozef.hritz@ceitec.muni.cz
Základné pojmy
Luminiscenciou nazývame emisiu svetla atómu, alebo molekuly,
ktorá sa odohráva z excitovaného stavu elektrónu
Luminiscencia sa formálne delí na fluorescenciu a fosforescenciu
v závislosti na charaktere elektronového excitovaného stavu.
Fluoroforom nazývame látku schopnú absorbovať a emitovať svetlo.
Objav Fluorescencie
Fluorescenciou nazývame jav pri ktorom je svetlo emitované atómom alebo molekulou po
ohraničenej dobe nasledujúcej po absorpcii elektromagnetického žiarenia
John Herschel
Stokesův posun
σ*-σ malokedy vedú ku luminiscencii. Veľmi vysoká energia (λ<250nm)
vedie zväčša ku disociácii molekúl
Emisie sú najčastejšie pre prechody π*-π, niekedy aj π*-n
Typické fluorofóry
• Molekuly obsahujúce konjugované π elektróny
Energetické hladiny v molekule
En,v,J=En+Ev+EJ
En-elektrónová energia
EV-vibračná energia
EJ-rotačná energia
Kvalitatívne porovnanie jednotlivých
energetických komponent:
En(UV-VIS) >> EV (IR) >> EJ(MW)
Čo určuje tvar absorbčného spektra?
Frank-Condonov princíp:
Vertikálne prechody elektrónu, ktoré
sa odohrávajú na omnoho rýchlejšej
časovej škále ako pohyb jadier atómov
Absorbcia 10-15s
Vibrácie atómov 10-12s-10-10s
Termálna relaxácia 10-15s-10-12s
Fluorescenčná emisia 10-9s
Typické charakteristiky
fluorescenčných spektier
• Stoksov posun
• Nezávislosť emisného spektra
na excitačnej vlnovej dĺžke
• Excitačné spektrum “rozumne sa
správajúcich molekúl” je prakticky
totožné s absorbčným spektrom
• Emisné spektrum je vo väčšine
prípadoch takmer zrkadlovým
obrazom absorbčného/excitačného
spektra
Kasha’s Rule
Jablonského diagram
(10-14-10-10s
(10-10-10-8s
(~10-15s)
(~10-9-10-6s)
Kvantový výťažok
f
f i ec ic pd d
k
k k k k k k
 
    
kf = fluorescent rate constant
ki = intersystem crossing rate constant
kec = external conversion rate constant
kic = internal conversion rate constant
kpd = predissociation rate constant
kd = dissocation rate constant
Fluorescenčný spektrofotometer
Fluorescenčný mikroskop
Fluorescence microscopy
• Subcellular fluorescence imaging
– Combined with recombinantly-expressed
fluorophores (GFP, etc.—Roger Tsien) has
revolutionized biology.
http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/fluorescence/anatomy/fluoromicroanatomy.html
http://www.rp-photonics.com/img/kahn_fl_image.jpg
Försterov Rezonančný Transfer Energie
(FRET)
R0-Försterov polomer/vzdialenosť
Efektívnosť FRET
r – vzdialenosť medzi akceptorom
a donorom
κ2 – popisuje vzájomnú relatívnu
orientáciu tranzitných dipólov
donoru a akceptora.
Pre flexibilný náhodný pohyb
akceptora a donora sa κ2=2/3
Monitorovanie skladania proteínov
in vivo
Fluorescenčná anizotropia
Anizotrópia Polarizácia:
Viazanie ligandu do receptoru
Ďalšie čítanie
• Lakowicz, J. R. (2006) Principles of
Fluorescence Spectroscopy
http://xibalba.lcg.unam.mx/~rgalindo/bioquimica/BQPosgrado2
011/V
PurificacionEspeectroscopia/PrinciplesofFluorescenceSpectrosco
py3rd.pdf)