Roman Hrstka Úvod do nádorové biologie Masarykův onkologický ústav, Brno hrstka@mou.cz Nádor, tumor, neoplazma, novotvar - je nová a abnormální tkáň v mnohobuněčném organismu, která v tomto organismu nemá fyziologickou funkci a roste neregulovaným způsobem. - je geneticky podmíněný abnormální přírůstek buněčné tkáňové hmoty klonálního charakteru. Jeho růst není v koordinaci s růstem okolních tkání a rovnovážným stavem organismu. Klasifikace nádorů: (A) podle schopnosti infiltrovat se do jiné tkáně • Pseudotumory: růstem napodobují tumory (cysty, hyperplasie, polypy) • Prekancerózy: morfologicky alterovaná tkáň s vyšším rizikem vzniku nádoru (CIN, Barretův epitel) • Benigní (nezhoubné): zůstávají v místě svého vzniku, nemigrují, neinvadují jiné tkáně. • Maligní (zhoubné): pronikají do okolních tkání a prostřednictvím krevního a lymfatického systému do celého těla, v nových tkáních vyvolávají tvorbu sekundárních nádorů (metastází) (B) podle původu • Karcinomy: z epiteliálních buněk (~ 90% nádorů) • Sarkomy: z pojivových tkání (< 1% onemocnění) • Leukemie: z hematopoetických buněk Kancerogeneze • je proces vzniku a vývoje nádoru • je vícestupňový proces • podstatou kancerogeneze je postupné hromadění genetických (a epigenetických) změn 1 1 11+2 1 1+2 1+2+3 1+2 1 Normální buňka mutace 1. 2. 3. 4. 1+2+3 1+2 1 Nádorový potenciál Maligní transformace Hromadění mutací Produktivní versus transformující infekce Produktivní versus transformující infekce Molekulární model iniciace nádoru (familiární adenomatózní polypóza) tlusté střevo hlava a krk čípek plíce kuřáka prs prostata POČÁTEČNÍ STŘEDNÍ POKROČILÝ CIS NORMÁLNÍ PREKANCERÓZNÍ KARCINOM 5-20 let adenom 5-15 let kouření 4-10 let dysplastická ústní leukoplakie 6-8 let CIN I 9-13 let CIN III / CIS 10-20 let 20-40 let atypická hyperplazie DCIS 6-10 let PIN 10 let latentní karcinom 3-15 let Neoplastická transformace Klonalita nádorů - CSC Onkogeny Protoonkogen je strukturní gen eukaryotické buňky, který se svým translačním produktem podílí do značné míry na regulaci dělení buněk a jejich diferenciace. Onkogen je protoonkogen pozměněný nebo aktivovaný tak, že vyvolává neoplastickou transformaci buňky. Mutace protoonkogenů jsou: - aktivující - dominantní - vyskytují se v somatických buňkách a jen výjimečně v zárodečných buňkách [Vrozená citlivost k medulárnímu thyroidnímu karcinomu (MTC) je typickým příkladem hereditárního karcinomu způsobeného mutací RET protoonkogenu.  prediktivní genetické vyšetření] I. Fúze buněk Nádorová buňka Normální buňka Hybrid Nádorové supresory Produkty genů pro nádorové supresory (antionkogeny) v normálních buňkách nevyvolávají proliferaci, ale naopak ji potlačují a udržují buňky ve stádiu klidu (G0). Jejich ztráta se projevuje neregulovanou proliferací. Mutace nádorových supresorů jsou: - inaktivující - recesivní (spojeno s LOH) („recesivní onkogeny“) - vyskytují se v somatických a také v zárodečných buňkách March 15th 1979 Virology. 1979 Oct 30; 98(2):308-18. The SV40 A gene product is required for the production of a 54,000 MW cellular tumor antigen. Linzer DI, Maltzman W, Levine AJ. Objevení proteinu p53 p53Rb velký T antigen N C 1988 1990 Proč nebyla od počátku objevení proteinu p53 jasná jeho funkce? http://www-p53.iarc.fr TP53 is a Tumor Suppressor Gene p53+/+ p53+/- p53-/- 1% at 18 months % mice with tumor 75% at 6 months 2% at 9 months Donehower LA, Harvey M, Slagle BL et al. Nature (1992) p53 +/+ mdm2 +/+ p53 +/+ mdm2 -/- p53-/Mdm2 +/+ p53-/Mdm2 -/TP53 a vývoj embrya Gen a protein p53 Gen leží na chromozomu 17 (17p13) a má 11 exonů (z nichž první se neexprimuje). Protein je jaderný fosfoprotein, 393 AA, 53 kDa. - poprvé popsán jako protein interagující s LT SV40 - jedná se o transkripční faktor - funguje jako tetramer - konsensus sekvence: 5´- Pu-C(A/T)(A/T)G-Py - 3´ - mutace u cca 40% všech lidských nádorů p53 p53MDM2 Fyziologické podmínky Degradace p53 v proteasomech Nuclear exclusion Nízká hladina p53 v jádře p53 p53 p53 p53 Stresové podmínky p53 MDM2 MDM2 se neváže Zvýšení hladiny p53 Exprese cílových genů UbiUbUbUb Posttranslační modifikace p53 Posttranslační modifikace souvisejí s regulací aktivity a také stability p53. Struktura proteinu p53 DNA binding domain N- terminal domain Transcription machinery MDM2 Expression of target genes DNA binding Ubiquitination and degradation 1 2 3 http://www-p53.iarc.fr Pathways of p53 Activation P ATM/ATR Chk2 CK2 p53 Genotoxic stress Non-genotoxic stress E2F ras catenin c-myc Oncogenic stress p14Arf Target gene JNK P38 MAPK Rac1 MDM 2 Inaktivace p53 v nádorech • Mutace • Jaderná exkluze (37% zánětlivých karcinomů prsu, více než 90% nediferencovaných neuroblastomů) • Interakce s virovými onkoproteiny (LT SV40, E1B, E6) • Amplifikace mdm2 (neuroblastomy), případně mdmX (gliomy) Frekvence mutací p53 v nádorech Typy mutací p53 • především bodové missense mutace • krátké delece a inzerce (více v okrajových částech genu) 175 248 273 245 282 Missense Mutations are Clustered in the DNA-binding Domain Transactivation (1-42; 43-62) Oligomerisation (323-356) Regulation (363-393) DNA binding (102-292) Proline-rich (65-97) N- -C 1 % 2.3 % 80 % 3.4 % 0. 3% 50.8 % 45.4 % 82.1 % 36.4 % 72.7 % Mut. frequency Missense mut. http://www-p53.iarc.fr Most Frequent Mutations Are In The Loops That Make Contact With DNA 0° 90° 180° Codon: 175 248 273 282 245249 176220> > > > >> > http://www-p53.iarc.fr Biologická aktivita TP53 Mutantů Mutant p53 Loss Of Function Retained Function Protein interactions Transactivation, Repression, …. Growth promotion Gain Of Function WT p53 DNA- Binding, Transactivation, Repression Growth suppression Dominant Negative Temperature Sensitivity p53 M p73 p53 M Neschopnost vazby na své „přirozené“ sekvence p53 M p53 M p53 M p63p53 M Gain of funcZtráta přirozené funkce NO MDM2 Kumulace defektního proteinu p53 M p53 M HSP90 Spouštění „cizích“ promotorů 1990 Nature Genetics 4, 42 - 46 (1993) Gain of function mutations in p53 Dirk Dittmer1, Sibani Pati1, Gerard Zambetti1, Shelley Chu1, Angelika K. Teresky1, Mary Moore1, Cathy Finlay1 & Arnold J. Levine1 1Department of Molecular Biology, Princeton University, Princeton, New Jersey 08544−1014, USA První zmínka o pojmu „Gain of Function“ proteinu p53 Definitivní ustálení pojmu „Gain of Function“ pro protein p53 Zástava dělení Reparace poškození Apoptóza Nekontrolovaná proliferace Insuficientní apoptóza Konformace Hladina p53 schopnost indukce Interakce s proteiny: transkripční aparát stresové proteiny inhibiční proteiny DNA vazebná kapacita Posttranslační modifikace fosforylace acetylace Stav genu mutace, delece, LOH izoformy Možnost predikce ? Terapie založená na stavu p53 ATM ATR Chk1Chk2ARF p53 mutovaný ? NE chemoterapie radioterapie... Terapie založená na aktivaci p53 p53 posttranslační modifikace TERAPIE ZALOŽENÁ NA STAVU p53 Stabilizace struktury proteinu Inhibice HSPs p53p53 p53 Hsp90 p53 Geldanamycin 17-alyl-aminogeld. PRIMA Amifostin + postttranslační modifikace ANO jaké jsou vlastnosti mutace ? Aktivovatelný Snížení Gain of function, Inhibice HSPs Genoterapie Adenovirus + upravený p53 Neaktivovatelný Screening malých molekul, které aktivují p53 p53 activity LacZp53 Over 130,000 compounds screened Lain S., Hollick JJ. et al. Cancer cell (2008) p63 & p73 isoformy alternativní sestřih a promotory Yang and McKeon, Nat Rev Mol Cell Biol. (2000) TP53 17p13 Zvýšená citlivost ke spontánní kancerogenezi TP73 1p36 vážné neurologické defekty (hypokampální malformace, hydrocefalus) chronické infekce a záněty, postižení feromonových senzorických drah Není zvýšená citlivost ke spontánní kancerogenezi TP63 3q27-28 zkrácené končetiny, nemají vlasové folikuly, zuby, prsní, slzné a slinné žlázy T T T T TP53 rodina: rozdílné funkce Nádor = defekt v regulaci b. proliferace a homeostázy 2000 I. Soběstačnost při tvorbě růstových signálů Normální buňka vyžaduje mitogenní růstové signály x Nádorová buňka vykazuje výrazně redukovanou závislost na exogenních růstových stimulech. Strategie: • Tvorba vlastních růstových faktorů Zesílená exprese Strukturní změny „Přepnutí“ integrinů • Receptory na buněčném povrchu • Alterace v „downstream“ signalizaci Receptory růstových faktorů Receptory po vazbě příslušného specifického faktoru přenášejí růstový signál jednou nebo více kaskádami signální transdukce. Některé povrchové buněčné receptory mají jako integrální součást tyrozinkinázu ve své cytoplasmatické doméně. Geny těchto receptorů se stávají onkogenními, když po mutaci zůstávají receptory aktivní i v nepřítomnosti navázaného ligandu. Hormonální receptory • Na povrchu buněk (transmembránové) i uvnitř peptidové (G-spřažené receptory) • Dělíme na steroidní (obv. solubilní proteiny) Estrogenní receptory: 2 varianty: - G-spřažený receptor (GPR30) – syntéza PIP3 - nukleární hormonální receptor Genomicky vazba na ERE, iniciace transkripce Negenomicky komplexy s G prot., TK  MAPK, PI3K/AKT Extracelulární matrix (ECM) • Pletivo makromolekul vně buněk (bílkoviny, glykoproteiny, proteoglykany a polysacharidy) • Poskytuje mechanickou podporu pro buňky • Ovlivňuje chování, proliferaci a diferenciaci buněk, které jsou s ní v kontaktu • Hlavními receptory buněk, které zprostředkovávají interakci buněk s ECM jsou integriny Integriny • Nepostradatelné komponenty všech Metazoí (od mořských hub po člověka) • Členy velké rodiny transmembránových proteinů, které jsou receptory pro adhesivní sekvence molekul extracelulární matrix • Zprostředkují přichycení buňky k ECM nebo k jiné buňce a umožňují přenos signálu (informace) mezi ECM a buňkou. Signalizace probíhá jak z ECM do buňky (outside-in signaling), tak z buňky do extracelulárního prostoru (inside-out signaling) • Heterodimerní molekula v které jsou a podjednotky spolu nekovalentně vázány II. Ztráta citlivosti k signálům zastavujícím buněčný růst a proliferaci • Buňka je „přepnuta“ antiproliferačními signály z proliferace do G0 fáze, ale je stále připravena působením dalších extracelulárních signálů opět proliferovat • V buňce dojde k permanentnímu zablokování schopnosti proliferovat vstupem do tzv. postmitotické fáze, respektive dojde k terminální diferenciaci Nádorová buňka musí obejít tento kontrolní mechanismus: vyřazením pRb dráhy  kóduje tzv. retinoblastoma 1 protein (RB1, pRb) – reguluje buněčný cyklus  v případě mutace --> retinoblastom (sporadický x dědičný, „two hits“ hypotéza)  brání buňkám v replikaci poškozené DNA – G1 blok Výjimky („two hits“)  Haploinsuficience – jedna funkční alela není dostatečná  Imprinting – 1-2% lidských genů, kdy jen 1 rodičovská alela aktivní. Např. IGF-2, obvykle exprese otcovské alely, při ztrátě imprintingu a overexpresi --> Wilmsův tumor, hepatoblastom, rhabdomyosarkom,... Přibližně 10% populace konstitutivní ztráta IGF-2 imprintingu (hypometylace) = zvýšené riziko ca kolorekta. http://www.geneimprint.com  Dominantně negativní mutace – vedou ke vzniku proteinu, který neplní správně svoji funkci a navíc interaguje s proteinem tvořeným funkční alelou a tím ho inaktivuje. Buněčný cyklus a nádory Deregulace b.cyklu u nádorů 1. aberantní exprese pozitivních regulátorů (cykliny) 2. ztráta funkce negat. regulátorů (CDKI) P P P P P vstup do S fáze E7 E2F pRb E7 pRb E2F p16 p16 D1-CDK4/6 nekontrolovaná transkripce genů aktivace p14 E6E6AP ubikvitin p53 p53 protea zom p21 E-CKDK2 G1 fáze Schéma funkce proteinů E6 a E7 při infekci proteiny E6 a E7 high risk HPV jsou schopné transformovat zdravou buňku pouze v kooperaci III. Neomezený replikační potenciál  Pokusy in vitro na normálních lidských diploidních fibroblastech ukázaly, že buněčná kultura má limitovanou životnost – asi po 50-70 děleních se růst zastavuje, avšak buňky mohou v G1 fázi vydržet až několik roků.  Pokud u dané populace dojde k danému počtu dělení, přestávají se množit = senescence  Např. inhibicí pRb nebo p53 může dojít k opětovnému dělení buněk  krize (masivní buněčná smrt) Nádorové buňky proliferují neomezeně – jsou „nesmrtelné“. Senescence se vyskytuje jako artefakt při pěstování buněčných kultur, který nereflektuje fenotyp buněk v živých tkáních a nepředstavuje překážku pro progresi nádoru in vivo ? Senescence protirakovinný mechanismus X zhoršování regenerace Charakteristika senescentních buněk: • nevratná zástava buněčného cyklu v G1 fázi • morfologické znaky, změny ve struktuře heterochromatinu • zvýšená exprese p53, p21Cip1, p16INK4A • vysoká aktivita lyzozomální β-galaktosidázy IV. Apoptóza Fyziologický proces udržující rovnováhu mezi buněčným růstem a smrtí buněk Kaskáda reakcí cysteinových proteáz (kaspázy), vazba na tzv. substráty smrti (proteiny cytoskeletu, proteiny řídící opravu DNA, proteiny zabraňující apoptóze apod., štěpení DNA cca 180bp). V konečném důsledku morfologické změny - svrašťování buněk, apoptotická tělíska →fagocytóza Postupující věk →pokles transkripční aktivity genů vyvolávajících apoptózu→např. Snížená schopnost likvidovat buňky imunitního systému reagující proti vlastním tkáním →autoimunitní onemocnění Autofágie cytoprotektivní mechanismus (rezistence k terapii) X odstranění poškozených organel, redukce chrom. nestability V. Angiogeneze (neokapilarizace, neovaskularizace) • Proces novotvorby krevních kapilár, díky této schopnosti může nádor stimulovat okolní tkáň k růstu cév, kterými mu je dopravována krev bohatá na živiny a kyslík • Rostoucí nádorové ložisko může bez cévního zásobení dosáhnout velikosti pouze 1 – 2 mm3, kdy přívod kyslíku a živin je možný ještě difuzí z okolní tkáně • Hypoxie, genetická nestabilita --> „angiogenní switch“ tj. nový fenotyp nádorových buněk, suprese antiangiogenních faktorů (thrombospondinu), zvýšená tvorba angiogenních faktorů. Buňky nádoru a sousední endotélie se v tomto směru vzájemně ovlivňují parakrinní, ale i autokrinní sekrecí angiogenních faktorů. Drozofila jako model angiogeneze Mutace různých drozofilích genů účastnících se vývoje trachejí a jejich savčí protějšky: · trachealess (homolog HIF), · branchless (FGF), · breathless (FGF receptor), · sprouty (ras interactor) Cévní system drozofily je málo vyvinut, ale dobrým modelem pro savčí angiogenezi je na molekulární úrovni překvapivě podobný hmyzí tracheální systém. Podobně jako u savčích cév - obecná organizace trachejí drozofily je určena geneticky, ale jejich větvení je určováno tlakem O2. • Nejčastější příčina úmrtí • Schopnost metastázovat je jedním ze základních znaků malignity nádorových onemocnění, řada faktorů (druh nádoru, velikost primárního nádoru, angiogenní procesy) • Při vzniku metastáz hrají důležitou úlohu chemokiny. Jde o superrodinu prozánětlivých cytokinů, které selektivně přitahují a aktivují různé typy buněk tím, že se váží na specifické povrchové receptory (G-protein) Šíření metastáz: • lymfogenní - národové buňky se šíří cestou lymfatických cév do lymfatických uzlin. Nejběžnější způsob šíření epiteliálních nádorů. • hematogenní - nádorové buňky se šíří krví a zachycují se v kapilárách. Nádory vycházející z pojivových tkání a pokročilé nádory epitelové. • porogenní (per continuitatem) - nádorové buňky se šíří mechanicky preformovanými dutinami. (nádory mozku nebo vaječníků) VI. Invazivita a schopnost metastázovat TF: Snail, Slug, Twist, Zeb1/2 VII. Protinádorová imunitní odpověď (APC) Onkoproteiny APC-aktivace zvýšení produkce kostimulačních molekul aktivace a proliferace tumor-reaktivních buněk CD4+ a CD8+ produkce IL-12 podpora odpovědi Th1-buněk produkce IL-2 IFN Protinádorová imunitní odpověď Teorie protinádorového imunologického dohledu („cancer immunoediting“) Důkaz: imunokompromitovaní pacienti - 200krát vyšší riziko vzniku nádorového onemocnění VIII. Zánět a nádorová onemocnění IX. Změny v metabolické aktivitě Nekontrolovaná buněčná proliferace je nejen spojená s deregulací kontroly buněčného cyklu, ale má též zvýšené nároky na metabolickou aktivitu ~ 18x vyšší účinnost Aerobní glykolýza (O. Warburg) • GLUT1 (PET-FDG) • Hypoxie • Glykolytické intermediáty ROS vs. antioxidanty X. Genomová nestabilita Funkčnost genetických repearčních mechanismů  výskyt spontánních mutací je poměrně nízký  při kancerogenezi musí dojít k vyřazení systému monitorujícího genomovou stabilitu = ‘‘caretakers’’ of the genome (Kinzler and Vogelstein, 1997) Nejčastěji s e jedná o faktory zodpovědné za: (1) detekci DNA poškození a aktivaci reparační mašinerie (2) přímo se podílející na opravě poškozené DNA (3) inaktivující mutagenní molekuly dříve než poškodí DNA Ztráta telomerické DNA u řady nádorů vede ke karyotypické nestabilitě a s tím spojeným amplifikacím a delecím na chromozomech