Základní metodické přístupy v experimentální onkologii & Modelové systémy Experimentální modely v onkologii Obecné zásady při výzkumu: • Snaha porozumět fundamentálním procesům funkce a vývoje živých organismů • Formulace přesně definovaných otázek ve vymezené oblasti výzkumu • Výběr vhodného modelového systému (Mendel) • Zjednodušený, ale impaktní systém umožňující testovat specifickou hypotézu a zda se dosáhne výsledného fenotypu (CCLE) • Buněčné linie • Caenorhabditis elegans • Drosophila melanogaster • Kvasinky • Danio rerio • Mus musculus Příprava buněčných linií Nebezpečí kontaminace jinou buněčnou kulturou [DSMZ, ATCC (mikrosatelitní DNA fingerprinty)] Buňky se dělí a rostou dokud neobsáhnou celý prostor, pak následuje: • Zástava b. dělení kontaktní inhibicí • Indukce buněčné diferenciace kontaktní inhibicí • Akumulace apoptotických a nekrotických buněk • Deplece nutričních faktorů Práce s eukaryotickými buněčnými liniemi Optimální podmínky kultivace (5-10% CO2, 37 C, pH, glukóza, růstové faktory, antibiotika) Výměna média (pH), pasážování buněk, kryoprezervace 2D vs. 3D kultivace Konfluence buněk, suspenzní vs. adherentní buňky Genové manipulace Výhody a nevýhody buněčných linií • Prakticky neomezená životnost • Kontinuální a rychlá proliferace • Snadná práce • Možnost připravit stabilní KO, transientní transfekce, a další genetické manipulace • Atypické okolí nádorových buněk • Nebezpečí kros-kontaminací • Kumulace dalších změn Stanovení počtu a viability buněk xCELLigence RTCA Bürkerova komůrka Schéma sorteru MTT test c e b Studium metastázování in vivo • Athymické Nu/Nu myši (chybí brzlík, neprodukují T-buňky) • SCID myši (autozomálně recesivní mutace SCID = těžká kombinovaná imunodeficience, chybí protilátková i T-buněčná imunitu) Nejčastěji myší model: - BALB/c (kmen inbredních laboratorních myší) - transgenní myši - imunodeficientní kmeny Typy myších modelů v onkologickém výzkumu Klonalita nádorů vs. Nádorové kmenové buňky Mus musculus Příprava inbredních kmenů – možnost pokusů na geneticky uniformních organismech (více jak 700 mutovaných kmenů). Obvykle se provádí tzv. „ gene knockkout“, tzn. funkční geny jsou nahrazeny nefunkčními nebo mírně pozměněnými variantami jež odpovídají genetickým změnám vzniklým v nádorové buňce. Nejvýznamnější příspěvek k pochopení mechanismů lidských nádorových onemocnění. Mus musculus Příprava inbredních kmenů – možnost pokusů na geneticky uniformních organismech (více jak 700 mutovaných kmenů). Obvykle se provádí tzv. „ gene knockkout“, tzn. funkční geny jsou nahrazeny nefunkčními nebo mírně pozměněnými variantami jež odpovídají genetickým změnám vzniklým v nádorové buňce. Nejvýznamnější příspěvek k pochopení mechanismů lidských nádorových onemocnění. 4 metody přenosu GI: • Infekce buněk kostní dřeně rekombinantním retrovirem umožní expresi přeneseného genu v infikovaném zvířeti • Infekce embrya pomocí rekombinantního retrovirového vektoru • Transformace embryonálních kmenových buněk • Klonovaná DNA může být mikroinjikována do fertilizovaných oocytů a přenesena do náhradní matky *Náhodný charakter integrace  poziční efekt !!! (YACs & BACs) *Poprvé gen pro elastázu, nezbytná 134 bp regulační oblast pro správnou funkci „Hybridní transgen“ Studium apoptózy Indukce hladiny biomarkerů x Funkční testy Průtoková cytometrie: Stanovení aktivity kaspázy 3 pomocí specifických protilátek FITC-anti-PARP Ab Staurosporin Kontrola Kvasinky (Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe) Snadno kultivovatelné, 1. eukaryotický organismus plně osekvenovaný, celá řada funkčních homologů se savčími buňkami Vhodný model pro screening protinádorových léčiv Pozitivní selekční screening Příklad využití kvasinek při screeningu b. signalních drah při testování nových látek Chemoterapie (jednoduchá aplikace, velké množství ryb, dlouhodobá léčba x nespecifická, predominance jaterních tumorů, potenciální riziko pro výzkumníka) Transplantace savčích buněk (rychlost, průhledná embrya, lidské nádory, fluorescence x, nízká penetrance tumorů) Genetické knockouty (Inaktivace jednoho specifického genu - N-ethyl-N-nitrosourea mutageneze, „Human-like cancer“ mutace x slabá penetrance, genové duplikace, rozdílné spektrum tumorů, „background“ mutace) Exprese transgenů (jednoduše generovatelné injikací, použití lidských genů, použití fluorescence, tkáňově specifická exprese x nedostatek specifických promotorů) Obecné zásady při odběru klinického materiálu: • „logistika“ zpracování • manipulace s odběrovými nástroji • načasování Krev (5-10 ml, chelatační činidla, vyšetření zánětlivých determinant, hladiny cukrů, hormonů, onkomarkerů, bílkovin krevního séra a dalších.) Separace krevních buněk • Centrifugace • Imunoafinitní separace • Imunomagnetická separace • Sortování buněk Odběr biologického materiálu Sérum (55% celkové krve) Leukocyty a trombocyty (<1% celkové krve) Erytrocyty (45% celkové krve) A B Vstupní vzorek Průběh centrifugace Výsledná separace Základní separační techniky Separační techniky využívající monoklonální protilátky A Buňka X Buňka X Buňka Y Protilátka Specifický antigen Nosič B Další biologický materiál - Kostní dřeň - Moč - Sliny - Bukální sliznice - Plodová voda (16-18 týden) - Choriové klky (12-14 týden) - Fibroblasty (kožní biopsie) - Tkáně – N2 – FFPE - Izolace NK Přehled způsobů odběru tkáně Kleště A B C D Léze Pouzdro jehly Jehla s prostorem pro vzorek Proniknutí jehly do tkáně Posunem pouzdra přes jehlu dochází k odběru vzorku Vyjmutí jehly včetně pouzdra a vzorku Dysplazie střevní sliznice vodná fáze (NK) proteiny fenol/chloroform (lipidy) • Umístění buněk/tkání do extrakčního pufru • Dlouhodobé uchovávání (RNA later, chelatační činidla) Fenol/chloroformová extrakce a následně etanolová nebo isopropanolová precipitace Metody adsorpční Adsorpce NK na silikagel v přítomnosti chaotropních solí (guanidin isothiokyanát, NaI), eluce přes kolonky Metody vysolovací obchází použití organických rozpouštedel, při izolaci z krve nejprve hemolýza, následuje izolace DNA z leukocytů Izolace nukleových kyselin Koncentrace, kontrola čistoty a kvality DNA / RNA A260 = 1, c(dsDNA) = 50 μg/ml A260 = 1, c(ssDNA) = 33 μg/ml A260 = 1, c(ssRNA) = 40 g/ml A260/A280 v rozmezí 1,7 - 1,8 čistá DNA A260/A280 < 1,7 DNA znečištěná proteiny nebo organickými látkami A260/A280 > 1,9 DNA znečištěná RNA nebo organickými látkami A260/A280 = 1,9 – 2,1 čistá RNA A260/A280 < 1,9 RNA znečištěná proteiny nebo organickými látkami 28S-rRNA 18S-rRNA Enzymy používané k úpravě nukleových kyselin Enzymy syntetizující: - Polymerázy (DNA, RNA) - Reverzní transkriptázy - Terminální transferáza Enzymy odbourávající: - Dnázy - Rnázy Enzymy modifikující: fosfatázy (alkalická fosfatáza E. coli), kinázy (T4polynukleotid kináza), metylázy Enzymy spojující: DNA-ligázy (katalyzují tvorbu fosfodiesterové vazby mezi 5’P a 3’OH konci dsDNA) Elektroforetické metody DGGE Další elektroforetické metody PFGE Kapilární elfo target DNA probe denaturation hybridization RNA/DNA Elektroforéza značený hmotnostní standard Elektroforéza roztok je kapilárními silami nasáván buničinou skrz gel a membránu Pufr membrána Buničina houba membrána DNA/RNA přenesená na membránu hybridizace se specifickou značenou sondou odmytí nenavázané sondy sonda hybridizovaná ke komplementárním sekvencím vizualizace Přenos NK a jejich detekce • Fluorescenční in situ hybridizace (FISH) – Lokalizace vybraných nukleotidových sekvencí přímo v buňkách – Schopnost jednořetězcové sondy vázat komplementární úsek cílové DNA fixované na mikroskopickém skle – TOP2A, EGFR, Her-2/neu TOP2A normál TOP2A rozsáhlá amplifikace Ca prsu • Fluorescenční in situ hybridizace (FISH) – Lokalizace vybraných nukleotidových sekvencí přímo v buňkách – Schopnost jednořetězcové sondy vázat komplementární úsek cílové DNA fixované na mikroskopickém skle – TOP2A, EGFR, Her-2/neu TOP2A norma TOP2A rozsáhlá amplifikace Ca prsu Průkaz onkologických markerů pomocí DNAmikroaray testů Tato technika spočívá v umístění tisíců imobilizovaných DNA sekvencí oligonukleotidových značek v miniaturizovaném čipu. Povrchy jako je sklo nebo plast umožnily využít fluorescenční signály, zvýšení reproducibility a rychlosti hybr. kinetiky. Velmi zjednodušeně lze princip metody: Nejprve se izoluje vzorek DNA z buněk odebraných vyšetřované osobě a ten se označí fluorescenčním činidlem. Označená DNA se pak hybridizuje se vzorky určitých DNA sekvencí (DNA array) na destičce. Po promytí se měří fluorecence na „DNAarray“ a hodnotí pomocí počítače. •genová exprese •komparativní genomická hybridizace •SNP •sekvenace Současná hybridizace dvou vzorků DNA značených odlišnými fluorochromy na normální metafázní chromozomy DNA pacienta (nádorová) značena zeleně (FITC) kontrolní DNA (zdr. jedinec) značena červeně (TRITC) Komparativní genomová hybridizace Genomová array CGH Identifikace mutací 1) přístupy zaměřené na stanovení délky DNA fragmentů (RFLP), 2) techniky založené na hybridizaci (ASO = allele-specific oligonucleotide; OLA = oligonucleotide ligation assay), 3) metody založené na principu heteroduplexní analýzy (DHPLC = denaturing high-performance liquid chromatography), 4) PTT test (protein truncation test), 5) MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification), 6) DNA sekvenování, je popsáno v rámci kapitoly zaměřené na sekvenování, 7) techniky založené na kvantifikaci DNA (qPCR), 8) HRM (high resolution melting point) ad1) ad2) ad3) DENATURACE (98 C) HYBRIDIZACE (98 C) LIGACE (54 C) PCR SEPARACE ds DNA ss DNA ss DNA F R Ligáza-65 použití univerzálních primerů inaktivace ligázy při 98 C fragmentová analýza Princip MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) ad5) A) NORMÁLNÍ HOMOZYGOT C) HETEROZYGOT B) DELETOVANÝ HOMOZYGOT 1 1 1 1 1 1 2 2 2 3 3 2 2 3 2 4 4 4 4 4 44 A B C 3 2 1 3 33 Detekce delecí Sekvencování Chemické (Maxam-Gilbetovo) sekvencování - příprava koncově značených jednořetězcových fragmentů - 4 paralelní vzorky – modifikace jednoho typu báze, kde je fragment štěpen Enzymatické (Sangerovo) sekvencování - Syntéza komplementárního vlákna k sekvenci kterou identifikujeme - 4 paralelní vzorky - do každého jeden dideoxyribonukleotid Pyrosekvencování Nová generace sekvencování (NGS) Výhody: • levnější a robustnější („high-throughput“) technologie (masivní paralelní sekvencování) • „high-throughput“ sekvencování umožňuje objev genů a regulačních elementů spojených např. se studovaným onemocněním • Cílené resekvencování – identifikace mutací • RNA sekvencování – analýza celého transkriptomu Limitace: • Značná pořizovací cena, relativně drahé analýzy pro menší rutinní laboratoře • Méně přesné čtení templátu (homopolymery), kratší délky sekvencovaných oblastí (cca 150-500 nukleotidů) • Náročná analýza dat NGS: postup DNA obohacení 454 Ion Torrent/Proton Illumina Porovnání jednotlivých přístupů Method Ion semiconductor (Ion Torrent sequencing) Pyrosequencing (454) Sequencing by synthesis (Illumina) Sequencing by ligation (SOLiD sequencing) Chain termination (Sanger sequencing) Read length up to 400 bp 700 bp 50 to 250 bp 50+35 or 50+50 bp 400 to 900 bp Accuracy 98% 99.9% 98% 99.9% 99.9% Reads per run up to 80 million 1 million up to 3 billion 1.2 to 1.4 billion N/A Time per run 2 hours 24 hours 1 to 10 days, depending upon sequencer and specified read length 1 to 2 weeks 20 minutes to 3 hours Cost per 1 million bases (in US$) $1 $10 $0.05 to $0.15 $0.13 $2400 Advantages Less expensive equipment. Fast. Long read size. Fast. Potential for high sequence yield, depending upon sequencer model and desired application. Low cost per base. Long individual reads. Useful for many applications. Disadvantages Homopolymer errors. Runs are expensive. Homopolymer errors. Equipment can be very expensive. Slower than other methods. Have issue sequencing palindromic sequence. More expensive and impractical for larger sequencing projects.