C7188  Úvod  do  molekulární  medicíny  1/12   Definice   Historie   Obsah  kurzu   doc.  RNDr.  Ondřej  Slabý,  Ph.D.   Masarykův  onkologický  ústav   Lékařská  fakulta  Masarykovy  univerzity   CEITEC   ©  Ondřej  Slabý,  2011   Úvod  do  molekulární  medicíny  1/12   Strana  2   ©  Ondřej  Slabý,  2011   Vymezení  pojmu  MOLEKULÁRNÍ  MEDICÍNA   [1]  Massoud  TF,  Gambhir  SS,  Trends  in  Molecular  Medicine,  2007       MOLECULAR  MEDICINE  is   a  branch  of  medicine  that  develops  ways  to  diagnose  and  treat  disease  by  understanding  the  way  genes,  proteins,     and  other  cellular  molecules  work.  Molecular  medicine  is  based  on  research  that  shows  how  certain  genes,     molecules,  and  cellular  funcNons  may  become  abnormal  in  diseases  such  as  cancer.              according  to  NaAonal  Cancer  InsAtute  (NCI)     Molekulární  medicína  je  obor  založený  na  aplikaci  poznatků  a  metod  molekulární  biologie     do  klinické  medicíny  vedoucí  k  cílené  prevenci  a  vyššímu  stupni  integrace  diagnózy  a  terapie.   Molekulární  medicína  je  širší  pojem,  nesprávně  synonymicky  používané  pojmy:       ~  Personalizovaná    medicína  ~  individualizovaná  medicína  ~  „adresná“  medicína   ~  Translační  medicína  („from  bench  to  bedside“)     Zahrnuje  obory  jako  farmakogeneNka/genomika,  nutrigeneNka/genomika,     ale  také  mikrobiologickou  DNA  diagnosNku,  prenatální  diagnosNku,...   Koncepce  a  hlavní  náplň  oboru  MOLEKULÁRNÍ  MEDICÍNA   1)  IdenNfikace  individuálních  geneNckých  dispozic  ke  konkrétním  chorobám      a  formulace  prevenNvních  opatření  (molekulární  epidemiologie,  např.  nutrigenomika)   2)  Aplikace  molekulárně-­‐biologických  metod  do  klinické  diagnosNky  (mikrobiologická  DNA   diagnosNka,  prenatální  diagnosNka,...)   3)  Zdokonalení  diagnosNky  a  přesnější  formulace  nozologických  jednotek  zohledňující   jejich  molekulární  patologii   4)  IdenNfikace  nových  terapeuNckých  cílů  (molekulárních  struktur  buňky)  co  nejvíce   specifických  pro  dané  onemocnění   5)  Příprava  léčiv  nové  generace  (21st  century  therapeuNcs,  cílená  léčba,  buněčná  terapie,   genová  terapie,...)   6)  Individualizace  léčby  na  základě  geneNckého  pozadí  jedince   7)  Zdokonalení  a  zrychlení  transferu  technologií  z  laboratoří  k  lůžku  pacienta  (from  bench   to  bedside)   8)  BioeNka  a  právo   Úvod  do  molekulární  medicíny  1/12   Strana  3   INTEGRACE  DIAGNÓZY  A  TERAPIE!!!   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Úvod  do  molekulární  medicíny  1/12   Strana  4   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Pacienti neodpovídající na léčbu nebo vykazující závažnou toxicitu Pacienti se stejnou diagnózou Pacienti odpovídající na léčbu bez znaků závažné toxicity INTEGRACE  DIAGNÓZY  A  TERAPIE   Dogma  JEDNA  NEMOC=JEDNA  LÉČBA   Zrušení  dogmatu  JEDNA  NEMOC=JEDNA  LÉČBA   Nosologická  jednotka  je  dnes  definována  jako  konkrétní  příčina,  která  vede  k  rozvoji     typického  souboru  příznaků.  Tato  „konkrétní“  příčina  ovšem  v  naprosté  většině  případů    není  definována  na  molekulární  úrovni.     Neexistují  dva  naprosto  stejné  případy  téže  nemoci     Jen  velmi  malá  část  lidských  nemocí  má  jednoduchou,  dokonce  jedinou  příčinu   (některé  dědičné  nemoci  a  závažné  infekce)     I  zde  -­‐  hemofilie,  tuberkulóza  a  AIDS  kolísají  individuální  příznaky  tak  značně,  že  je  nutné   hovořit  pouze  o  celkovém  klinickém  obrazu     1.  Genejcké  dispozice  ovlivňují  průběh  téměř  všech  nemocí   2.  Mohou  existovat  rozdílné  molekulární  podtypy  v  rámci  jedné  diagnózy         Příklad  molekulární  klasifikace  karcinomu  prsu       Existuje  pět  molekulárních  podtypů     karcinomu  prsu   Sorlie  et  al,  PNAS,  2001   ©  Ondřej  Slabý,  2009  Strana  5   Úvod  do  molekulární  medicíny  1/12   Zrušení  dogmatu  JEDNA  NEMOC=JEDNA  LÉČBA   Nejsou  dvě  léčby  stejné  =  účinky  jednoho  léčiva  se  liší  v  závislosN  na  geneNckém  pozadí   jedince  =  farmakogeneNka,  farmakagenomika     Volba  správné  terapie  nikoliv  pouze  na  základě  diagnózy,     ale  také  vzhlededem  ke  schopnosj  organismu  nakládat  s  příslušnou  látkou   (vliv  geneNky,  vliv  prostředí  –  interakce  složek  potravy)     FarmakokineNka  –  např.  metabolická  schopnost  organismu  (CYP2D6,  DPD)     →  toxicita,  rezistence   Farmakodynamika  –  přítomnost  molekulárních  změn     →  rezistence     Předpoklad  farmakogeneNky  a  farmakogenomiky:     Genejcké  změny  (predikjvní  markery)  spojené  s  fenotypy  toxicity  a  rezistence     jsou  předem  idenjfikovatelné.   ©  Ondřej  Slabý,  2009  Strana  6   Úvod  do  molekulární  medicíny  1/12   ©  Ondřej  Slabý,  2009  Strana  6   Cíl  tzv.  precizní  medicíny  (precision  medicine)   Molekulární  epidemiologie   Molekulární  patologie   Molekulární  diagnosNka   Molekulární  farmakologie   INDIVIDUALIZOVANÁ     MEDICÍNA   TRANSLAČNÍ  MEDICÍNA   výzkum   MOLEKULÁRNÍ  MEDICÍNA  KLINICKÁ  PRAXE   aplikace   aplikace   výzkum   Cílená  prevence,  integrace  diagnózy  a  terapie   Úvod  do  molekulární  medicíny  1/12   ©  Ondřej  Slabý,  2011  Strana  2   molekulární  biolog   lékař   Pouze  ilustrace   Myšleno  pouze     jako  stavba,   nikoliv   EU  parlament!   Úvod  do  molekulární  medicíny  1/12   INTEGRACE  DIAGNÓZY  A  TERAPIE!!!   ©  Ondřej  Slabý,  2009  Strana  7   Úvod  do  molekulární  medicíny  1/12   Strana  8   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Proč  je  investováno  tolik  financí  do  výzkumu  a  vývoje  v  oblasj  MOLEKULÁRNÍ  MEDICÍNY?   „If  it  were  not  for  the  great  variability  among  individuals,   Medicine  might  be  a  Science  not  an  Art“   Sir  William  Osler,  The  Principles  and  PracAce  of  Medicine,  1892   Úvod  do  molekulární  medicíny  1/12   Strana    20   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Úvod  do  molekulární  medicíny  1/12   ©  Ondřej  Slabý,  2009  Strana  9   Historie  molekulární  medicíny  –  „počátky“   1715  Giovanni  Ba~sta  Morgagni,  1858  Rudolf  Virchow   1859  Charles  Darwin,  1865  Gregor  Mendel,     1910  Thomas  Hunt  Morgan,  1944  Barbara  McClintok   1949  –  Linus  Pauling  –  pojem  Molekulární  onem.   1953  –  James  D.  Watson  a  Francis  Crick     –  sekundární  struktura  DNA     Nobelova  cena  –  1962     1957  –  Francis  Crick  a  George  Gamov   CENTRÁLNI  DOGMA  molekulární  biologie       1966  –  Marshall  Nirenberg,  Heinrich  Mathaei  a  Severo  Ochoa  rozlušNli  geneNcký  kód   Nobelova  cena  1968   Úvod  do  molekulární  medicíny  1/12   Strana    10   ©  Ondřej  Slabý,  2009   1970  David  BalNmore  izoloval  enzym  reverzní  transkriptázu  z  RNA  retroviru   1972  Paul  Berg  vytvořil  první  rekombinantní  molekulu  DNA   1974  Paul  Berg  navrhuje  v  Science  dobrovolné  moratorium  na  techniky  rekominantní  DNA   1974  Frederick  Sanger  zavedl  metodu  sekvenace  DNA   1976  První  biotechnologická  společnost  založená  v  Kalifornii  GENENTECH,  Inc  –  první  lék     připravený  in  vitro  pomocí  genového  inženýrství  –  lidský  inzulin  uvedený  na  trh  1982   Paul  Berg   1978  David  Botstein  zavedl  metodu  polymorfizmu  délky  restrikčních   fragmentů  (restricNon  fragment  length  polymorphisms-­‐RFLP)   Zásadní  metoda  pro  idenNfikaci  jednonukleoNdových  polymorfizmů  (SNPs)   Úvod  do  molekulární  medicíny  1/12   Strana    11   ©  Ondřej  Slabý,  2009   EcoR1  –  GAATTC   Restrikční  endonukleázy   1983  Kary  Mullis  v  Cetus  Corporajon  zavedl     polymerázovou  řetězovou  reakci  (PCR)       Karry  Mullis  s  hvězdou  seriálu  CSI:  Las  Vegas   Marg  Helgenberger   The  PCR  Song   There  was  a  jme  when  to  amplify  DNA,   You  had  to  grow  tons  and  tons  of  jny  cells.   Then  along  came  a  guy  named  Dr.  Kary  Mullis,   Said  you  can  amplify  in  vitro  just  as  well.   Just  mix  your  template  with  a  buffer  and  some  primers,   Nucleojdes  and  polymerases,  too.   Denaturing,  annealing,  and  extending.   Well  it’s  amazing  what  heajng  and  cooling  and  heajng  will  do.   PCR,  when  you  need  to  detect  mutajons.   PCR,  when  you  need  to  recombine.   PCR,  when  you  need  to  find  out  who  the  daddy  is.   PCR,  when  you  need  to  solve  a  crime.   (repeat  chorus)   Úvod  do  molekulární  medicíny  1/12   Strana    10   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Historie  molekulární  medicíny  –  moderní  éra  1980s-­‐2000s   Strana    15   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Úvod  do  molekulární  medicíny  1/12   Geny  a  nádorová  onemocnění   Peyton  Rous,     Nobelova  cena  1966   1910   Peyton  Rous  popsal  význam  viru  v  eNologii  sarkomu  kuřat   Rous  Sarcoma  Virus  (RSV)     Počátkem  osmdesátých  let,  byl  klonován  segment  DNA     z  nádorové  linie  močového  měchýře,  který  vykazoval  schopnost   indukovat  neoplasNckou  transformaci  v  jiných  buňkách     =ONKOGEN   J.  Michael  Bishop   Harold  E.  Varmus   Nobelova  cena,  1989   Onkogeny  jsou  defektní  formy  proto-­‐onkogenů  (RSV)   Nádorové  supresory   2001-­‐  Nobelova  cena   L  Hartwell,  R  Hunt,  P  Nurse   regulátory  buněčného  cyklu   Úvod  do  molekulární  medicíny  1/12   Strana    16   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Historie  molekulární  medicíny  –  moderní  éra  1980s-­‐2000s   Mutační  analýza     Počátkem  devadesátých  let  se  objevují  automajcké  sekvenátory  (příliš  nákladné)   Nejpoužívanější  jsou  stále  metody  založené  na  PCR   RFLP  –  polymorfizmus  délky  restrikčních  fragmentů   SSCP  –  polymorfizmus  konformace  jednořetězcové  DNA   DGGE  –  elektroforéza  v  gradientovém  denaturačním  gelu     Na  trhu  se  objevují  komerční  DNA  kity  –  diagnosjka     Genová  terapie   1987  –  první  rekombinantní  DNA  vakcína  pro  hepaNNdě  B,  vytvořená  inzercí  segmentu   virové  DNA  do  kvasinkového  vektoru   1990  –  první  podání  genové  terapie  (retrovirové  vektory  s  funkčním  enzymem)     u  pacientky  s  ADA  immunodeficiencí   Klinická  studie  se  SCID  X1  imunodeficiencí  u  14  dě•  (u  2  došlo  k  rozvoji  ALL)     Vývoj  nových  virových  i  nevirových  vektorů   S.  Altman  a  T.  Cech  –  objev  Ribozymů     1997  –  Ian  Wilmut  –  TVŮRCE  DOLLY   Úvod  do  molekulární  medicíny  1/12   Strana    17   ©  Ondřej  Slabý,  2009   SomaNcká  buňka  dospělé  ovce  byla  sloučena  s     neoplodněným  enukleovaným  oocytem  jiné  ovce     Ovečka  Dolly  (1997-­‐2004)   Makak  NeN  a  Diƒo   Autor  Don  Wolf,  1997   Úvod  do  molekulární  medicíny  1/12   Strana    18   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Historie  molekulární  medicíny  –  moderní  éra  1980s-­‐2000s   Polymorfizmy  DNA      Za  geneNcky  polymorfní  je  považován  znak  s  nejméně  dvěma  geneNcky  podmíněnými     variantami  v  jedné  populaci,  které  se  nachází  v  takových  frekvencích,     že  i  zřídkavá  má  frekvenci  alespoň  1%.   Mezi  lidmi  je  přibližně  99,9%  shoda  v  sekvenci  DNA   Zbývajících  0,1%  nás  činí  jedinečnými  (jak  vypadáme,  nemoci,  kterými  budeme  trpět,  …)     Bodové  (single-­‐nucleoNde  polymorphism  SNP,  vyslovuj  snip)   Frekvence  přibližně  jeden  1  SNP  na  1kb  DNA  sekvence   RepeNNvních  sekvencí  (satelity,  mikrosatelity  –  počty  repeNc)     1985  –  DNA  fingerprinjng  –  komplexnost  polymorfizmů     satelitů  umožňuje  vytvořit  unikátní  DNA  profil  jedince   1987  –  poprvé  uznán  DNA  fingerprinNng    jako  důkaz  u  soudu   počátek  forenzní  molekulární  biologie     DNA  polymorfizmy  jsou  genejckým  pozadím  souvisejícím  mimo  jiné  také  s  dispozicemi     k  civilizačním  chorobám  a  léčebnou  odpovědí  .   Sir  Alec  Jeffreys   1998  –  objev  RNA  INTERFERENCE  Craig  Mello  a  Andy  Fire  u  C.  Elegans     –NOVÝ  NÁSTROJ  GENOVÉ  TERAPIE       Úvod  do  molekulární  medicíny  1/12   Strana    19   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Craig  Mello  na  slavnostním  banketu  po  udílení  Nobelových  cen  za  rok  2006.   Úvod  do  molekulární  medicíny  1/12   Strana    21   ©  Ondřej  Slabý,  2009   HUMAN  GENOME  PROJECT     1985-­‐1990:  diskuse  o  sekvenování  lidského  genomu   –  “nebezpečné”  -­‐  “nesmyslné”  -­‐  “nemožné”     1988-­‐1990:  Založen  HUMAN  GENOME  PROJECT  (HGP)   20  laboratoří  z  USA,  Velké  Británie,  Japonska,  Francie,  Německa  a  Číny   Asi  2800  lidí,  vedoucí:  Francis  Collins,  NIH     Mezinárodní  spolupráce:  HUGO  (Human  Genome  Organisajon)     Cíle:   –  geneNcká  mapa  lidského  genomu   –  fyzická  mapa:  marker  každých  100  kbp   –  sekvenování  modelových  organismů  (E.  coli,  S.  cerevisiae,  C.  elegans,   Drosophila,  myš)   –  objevit  všechny  lidské  geny  (předpokl.  60-­‐80  Nsíc)   –  sekvenování  celého  lidského  genomu  (3000  Mbp)  do  r.  2005     s  rozpočtem  3  bil.  USD   Úvod  do  molekulární  medicíny  1/12   Strana    22   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Květen  1998   •  Craig  Venter  zakládá  soukromou  biotechnologickou     společnost  CELERA  GENOMICS,  Inc.  a  vyhlašuje  záměr     sekvenovat  celý  lidský  genom  za  3  roky  a  300  mil.  USD     metodou  whole-­‐genome  shotgun,  několik  desítek     zaměstnanců  (sponzorováno  Applied  Biosystems)   •  V  té  době  výsledek  práce  HGP:  sekvenováno     cca  4  %  lidského  genomu.     Celera  Genomics  &  akad.  spolupracovníci  publikují  dra…  genomu   Drosophila  melanogaster  (cca  2/3  z  180  Mbp)   •  ...  whole-­‐genome  shotgun  lze  použít  i  pro  velké  genomy   •  ...  Lidský  genom:  závod  mezi  Human  Genome  Project  a  Celera  Genomics     Únor  2001  -­‐  Remíza   HGP  publikuje  dra…  lidského  genomu  v  časopisu  Nature  15.2.2001.   Celera  Genomics  publikuje  svou  sekvenci  lidského  genomu  v  Science  16.2.2001.   „Discovery  can´t  wait“     Úvod  do  molekulární  medicíny  1/12   Strana    23   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Srovnání  přístupu  veřejného  konsorcia  a  Celera  Genomics   Pracovníci  veřejného  konsorcia  byli  zavázáni  tzv.  Bahamskou  deklarací,  která  stanovila,  že  se  výsledky  sekvenování  musí  do  24  hod.     vystavit  veřejně  na  internetu,  aby  všechna  pracoviště  mohla  využít  výsledků  ostatních.  Tato  data  ovšem  využívali  i  pracovníci  Celery,     kteří    ovšem  nebyli  Bahamskou  deklarací  vázáni  a  své  výsledky  nezveřejňovali.     Clone-­‐by-­‐clone   Whole-­‐genome  shotgun   Craig  Venter   Září  2007,  10  mil.  USD   32  million  DNA  fragmentů,  20  billionu  bazí   Total  variants:  4.1  million   3.1  million  SNPs   4000  genů  mělo  pozměněné  proteinové  produkty   Venter  netrpí  CF  ani  HunNgtonovou  chorobou     James  D.  Watson   Říjen  2007   Méně  než  1  mil.  USD   Publikován  v  GeneBank   Trvalo  méně  než  2  měsíce   Úvod  do  molekulární  medicíny  1/12   Strana    24   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Následovaly  sekvenační  analýzy     dalších  jedinců  z  různých  etnik,     které  přinesly  podstatné  informace     o  interpersonálních  rozdílech  ve     struktuře  genomů.   Úvod  do  molekulární  medicíny  1/12   Strana    25   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Nové  technologie  založené  na  principu  masivního  paralelního  sekvenování   next-­‐generaAon  DNA  sequencing  technology   Srpen  2009   Délka  projektu:  8  týdnů   48  000  USD  (Venter  10  MUSD  -­‐>  HUGO:  3  000  MUSD)   Roche     454  Genome/   Sequencer   plaŒrom   Solexa   Ilumina   SOLiD     Applied   Biosystems   Paralelní sekvenování miliónů sekvencí, celkem 100 – 3000 Mb/run, jednotlivé sekvence dlouhé 20 – 400 bp Molekulární  patologie  nádorových  onemocnění  –  buněčný  cyklus,  apoptóza,  genejcká     nestabilita  nádorů,  rizikové  faktory,  angiogeneze,  tvorba  metastáz,  mikroRNA,  nádor     jako  komplexní  tkáň,  histopatologická  klasifikace  nádorů,  mechanismus  účinku     vybraných  léčiv,  invazivita/chemorezistence  –  příklady  kolorektálního  karcinomu,     mamárního  karcinomu  a  glioblastomu     Náplň  příš•  přednášky   Take  home     1)  Co  je  molekulární  medicína?   2)  Co  znamená  spojení  „integrace  diagnózy  a  terapie“?   3)  Jaké  jsou  důvody  a  následky  individualizace  léčby?   4)  Jaké  milníky  v  historii  molekulární  biologie  umožnily     vznik  oboru  molekulární  medicína  a  jaké  nejnovější     poznatky  její  rychlý  vývoj  v  posledních  letech?   Úvod  do  molekulární  medicíny  1/12   Strana    34   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Úvod  do  molekulární  medicíny  1/12   Doporučená  literatura   Strana    35   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Úvod  do  molekulární  medicíny  1/12   Strana    36   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Dotazy?