C7188  Úvod  do  molekulární  medicíny  3/12   Moderní  metodické  přístupy     v  molekulární  medicíně  I       BIOLOGICKÝ  MATERIÁL,  GENOMIKA  I   Ondřej  Slabý,  Ph.D.   Masarykův  onkologický  ústav   Lékařská  fakulta  Masarykovy  univerzity   CEITEC   ©  Ondřej  Slabý,  2011   Úvod  do  molekulární  medicíny  3/12   Strana  2   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Interdisciplinární  charakter  biomedicínského  výzkumu  –  příklad  onkologického  výzkumu   Radiolog                  Klinický  onkolog       Chirurg          Patolog       Molekulární  biolog   Úvod  do  molekulární  medicíny  3/12   Strana  3   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Biologický  materiál  užívaný  pro  účely  molekulární  medicíny   Tkáň  (naCvní  vs.  fixovaná  –  př.  FFPE-­‐   formalin  fixed  paraffin-­‐embedded  Cssue;   chirurgický  resekát,  biopsie)   Plná  krev  (plazma  +  buňky)   Plazma  (tekuCna  po  odstranění  krevních  elementů,  obsahuje  faktory  hemokoagulace)   Sérum  (tekuCna  nad  sraženinou,  bez  faktorů  krevního  srážení)   Moč     Kostní  dřeň,  bronchiální  aspirát,  ejakulát,     bronchoalveolární  laváž,  kloubní  tekuCny,     mozkomišní  mok,  sputum,  stolice,  výtěry…   Banky  biologického  materiálu   archivace  vzorků  v  parách  kapalného  dusíku  při  teplotě  -­‐160°C   K  archivovanému  vzorku  na^vní  tkáně     uložen  fixovaný  parablok=morfologický  korelát     Úvod  do  molekulární  medicíny  3/12   Strana  4   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Odběr  klinického  materiálu     Klíčový  moment  rozhodující  a  kvalitě  celého  výzkumu!!!!!!   Všechny  odběry  musí  probíhat  stejně,  a  celý  proces  musí  být  přísně  kontrolován!   Zaznamenání  času  podvázání  cév   Tzv.  ischemické  zdržení     Vysoké  nároky  na  stabilizaci  především  při  práci  s  RNA   Nejčastěji  použiváne  stabilizační  činidlo  RNAlater   Doba  transportu  na  patologii   Fixace  vzorku   Kontrolovaná   archivace  vzorku   DNA  4oC   RNA  -­‐70oC   Úvod  do  molekulární  medicíny  3/12   Strana  5   ©  Ondřej  Slabý,  2009   5   Laserová  mikrodisekce  –  nástroj  k  získání  vybraných  buněčných  populací   laser  capture  microdissecHon  (LCM)   ©  Ondřej  Slabý,  2009  Strana  6   Úvod  do  molekulární  medicíny  3/12   Izolace  nukleových  kyselin   Homogenizace  tkáně  (ultrazvuk,  mechanicka,  rotor-­‐stator)   Lyze  buněk  (enzymaCcky-­‐proteináza  K,  chemicky-­‐SDS,  EDTA,  fyzikálně-­‐zahřívání…)   RNA  méně  stabilní  než  DNA!  (homogenizace  beta-­‐ME,  DTT)   Extrakce  směsí  fenol-­‐chloroform   Srážení  nukleových  kyselin  alkoholem   Přečištění  enzymy   Purifikace  nukleových  kyselin  chromatografií  (adsorpce  na  silikát)   Úvod  do  molekulární  medicíny  3/12   ©  Ondřej  Slabý,  2009  Strana  7   Úvod  do  molekulární  medicíny  3/12   Strana    24   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Úvod  do  molekulární  medicíny  3/12   ©  Ondřej  Slabý,  2009  Strana  8   Spektrofotometrická  kvan^fikace  a  čistota  nukleových  kyselin   Roztok  dvouřetězcové  DNA  má  při  260nm  absorbanci  1  při  koncetraci  50ug/ul   Roztok  jednořetězcové  DNA  má  při  260nm  absorbanci  1  při  koncetraci  30ug/ul   Roztok  jednořetězcové  RNA  má  při  260nm  absorbanci  1  při  koncetraci  40ug/ul   Proteiny  mají  díky  aromaCckým  aminokyselinám  absorpční  maximum  při  280  nm   Poměr  A260/A280  se  má  u  nekontaminované  DNA  pohybovat  v  rozmezí  1,8  až  2,0   Poměr  A260/A230<1,7  indikuje  kontaminaci  chaotropními  solemi  a  fenolem     Nanodrop    ND1000  –  umožňuje  kvanCfikaci  pouze  v  1ul  vzorku     Úvod  do  molekulární  medicíny  2/12   Strana    16   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Křivky  z  Nanodropu   Úvod  do  molekulární  medicíny  3/12   Strana    9   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Integrita  nukleových  kyselin   Agilent  Bioanalyzer  2100   Lab  on  a  chip  (LOC)  technology     Je  miniaturiziované  zařízení     implentující  kapilární  gelovou     elektroforézu  pro  účely  analýzy  NK   18S  rRNA   28S  rRNA   Poměr  28S/18S  ~  2,0     pro  nefragmentovanou  RNA   80%  rRNA   10-­‐20%  tRNA   1-­‐5%  mRNA   Úvod  do  molekulární  medicíny  3/12   ©  Ondřej  Slabý,  2009  Strana  10   Integrita  nukleových  kyselin   Úvod  do  molekulární  medicíny  2/12   Strana    11   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Integrita  nukleových  kyselin   RIN  =  RNA  Integrity  Number  (0  –  10)   The  RIN  value:  Schroeder  et  al,  2006   Úvod  do  molekulární  medicíny  3/12   Strana    12   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Integrita  nukleových  kyselin   Strana    14   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Úvod  do  molekulární  medicíny  3/12   Real-­‐^me  PCR  je  založena  na  sledování   průběhu  polymerázové  řetězové  reakce   (PCR)  přímo  během  reakce  (tzv.  „v   reálném  čase")  pomocí  fluorescenčních   sond  či  barviv,  které  detekují  množství   PCR  produktu  během  reakce  zvýšením  své   fluorescenční  akCvity.  Její  výhodou  oproC   konvenční  PCR  je  možnost  přesného   stanovení  výchozícho  počtu  kopií  cílové   templátové  sekvence  DNA,  čili  schopnost   kvanCfikace.  Real-­‐Cme  PCR  se  provádí  s   pomocí  přístrojů  zvaných  cyclery,  které   umožňují  jak  provádění  teplotního   cyklování,  tak  detekci  fluorescence  v   každém  cyklu  PCR.   Real-­‐Time  PCR  –  nejpoužívanější  a  nejstandardnější  metoda  studia  genové  exprese   Úvod  do  molekulární  medicíny  3/12   Strana    15   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Real-­‐Time  PCR  –  nejpoužívanější  a  nejstandardnější  metoda  studia  genové  exprese   Nejčastější  způsoby  detekce  amplifikačního  produktu   Specifické  TaqMan  sondy   Interkalační  barvivo  SYBR  green   Denaturační  křivka  kontrola  specifity  reakce   Úvod  do  molekulární  medicíny  3/12   Strana    17   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Real-­‐Time  PCR  –  nejpoužívanější  a  nejstandardnější  metoda  studia  genové  exprese   1)  Baseline  -­‐  fluorescenční  signál  je  pod  detekovatelným  limitem  detektoru   2)  fluorescence  exponenciálně  narůstá  společně  s  produktem  amplifikace.  Ovšem   společně  s  pokračující  amplifikací  se  snižuje  i  poměr  polymeráza  :  PCR   produkty.     3)  plateau  fáze  -­‐  koncentrace  vytvořených    amplikonů  dosáhne  koncentrace  10-­‐8   M,  zastaví  se  exponenciální  růst,  od  koncentrace  10-­‐7  M  už  Rn  dále  nenarůstá.       Úvod  do  molekulární  medicíny  3/12   Strana    18   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Real-­‐Time  PCR  –  nejpoužívanější  a  nejstandardnější  metoda  studia  genové  exprese   Treshold  (prahový)  cyklus  CT  –     cyklus,  při  kterém  Rn  signály  začnou  odpovídat  exponenciálnímu  růstu  množství  amplifikačního  produktu     Pro  určení  CT  vyhodnocovací  soyware  vypočítá  průměrnou  odchylku  Rn  v  několika  prvních  cyklech  a  na     základě  této  odchylky  rozpozná  následnou  změnu  vedoucí  od  baseline  (kterou  obvykle  představuje  asi     prvních  15  cyklů)  k  exponenciálnímu  průběhu     (treshold  změna  Rn  je  definovaná  jako  deseCnásobek  průměrné  odchylky  v  baseline  fázi  PCR)     CT  je  závislé  na  koncentraci  DNA  templátu,  účinnosC  amplifikace  a  funkčnosC  fluoroforového  systému.     Absolutní  kvanCfikace   Úvod  do  molekulární  medicíny  3/12   Strana    22   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Vztah  integrity  RNA  a  Ct  prahového  cyklu  při  měření  stejného  transkriptu  v  analogickém  vzorku   Úvod  do  molekulární  medicíny  3/12   Strana    19   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Real-­‐Time  PCR  –  nejpoužívanější  a  nejstandardnější  metoda  studia  genové  exprese   Normalizace  pomocí  endogenní  kontroly  –  rela^vní  kvan^fikace  metoda  Δ  Δ  Ct   Reference  –  obvykle  nějaké  housekeepingové  geny   jsou  akCvní  ve  všech  buňkách  zajišťují  základní  funkce  buněčného  metabolismu:   syntéza  nukleových  kyselin  a  proteosyntéza,transport  živin  a  jejich  zpracování,  biosyntéza   cytoskeletu  a  organel  (GAPDH,  HPRT1,  ACTB,  B2M,….)       ΔCt1  =  Ct  (gen)  –  ΔCt  (reference)  –  v  kalibračním  vzorku  (např.  nenádorový  střevná  epitel)   ΔCt2  =  Ct  (gen)  –  ΔCt  (reference)  –  v  analyzováném  vzorku  (např.  kolorektální  karcinom)     Δ  ΔCt  =  ΔCt2  –  ΔCt1     2-­‐ΔΔCt  =  [gen  ve  vzorku]  /  [gen  v  kalibrátoru]     (př.  3  znamená,  že  normalizovana  hladina  stanovovaného  genu  je  3x  vyšší  v  kolorektálním  karcinomu     než  v  nenádorovém  epitelu)     2-­‐ΔCt1  =  [gene]/[reference]      Rozdíly  v  množství  celkové  RNA  ve  vzorcích  a  asi  20%  chyba  reverzní  transkripce   Úvod  do  molekulární  medicíny  3/12   Strana    20   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Real-­‐Time  PCR  arrays   obvykle  cílené  na  geny  konkrétní  signální  dráhy  nebo  biologického  procesu     www.appliedbiosystems.com      www.sabiosciences.com     Úvod  do  molekulární  medicíny  3/12   Strana    20   ©  Ondřej  Slabý,  2009   High  resolu^on  mel^ng  (HRM)  –  analýza  tání  s  vysokým  rozlišením   O6-­‐metylguanin-­‐DNA  metyltransferáza  (MGMT)   v  predikci  odpovědi  na  léčbu  temozolomidem  (TMZ)   gen MGMT exprese Promotorová oblast exprimován GBM s metylovaným promotorem MGMT • Není reparační protein DNA - MGMT • Nejsou opravována poškození DNA indukovaná účinkem temozolomidu • Lepší odpověď na léčbu • Lepší přežití pacientů s glioblastomem Metylovaný bez« turned off » Nemetylovaný Úvod  do  molekulární  medicíny  3/12   Strana    20   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Úvod  do  molekulární  medicíny  3/12   ©  Ondřej  Slabý,  2009  Strana    20   Predik^vní  význam  metylace  MGMT  u  pacientů  s  mul^formním  glioblastomem     –  odpověď  na  nové  alkylační  agens  temozolomid   Stav metylace promotoru genu pro reparační protein MGMT stanovený metodou HRM Nemetylovaný promotor, Vyšší hladiny MGMT, Vyšší DNA reparační kapacita (- prognostický faktor) Metylovaný promotor, Nižší hladiny MGMT (+ prognostický faktor) Slaby  et  al.,  Cancer  Science,  2011   Úvod  do  molekulární  medicíny  3/12   Strana    20   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Úvod  do  molekulární  medicíny  2/12   Strana    23   ©  Ondřej  Slabý,  2009   DNA  microarrays  (čipy)  –  definice  a  ukázky   Miniaturizované  zařízení  nesoucí  na  svém  povrchu  imobilizované  fragmenty     nukleových  kyselin  v  přesně  určeném  uspořádání.    Tyto  fragmenty  jsou     sekvenčně  derivované  tak,  aby  mohly  specificky  hybridizovat  s  testovaným     geneCckým  materiálem,  který  je  předem  speciálně  označen  za  účelem     posthybridizační  detekce   Úvod  do  molekulární  medicíny  3/12   Strana    25   ©  Ondřej  Slabý,  2009   * * * * * 5µm Milióny kopií jedné sondy Přes 6 500 000 hybridizačních jednotek Testovaná NK Sonda = fragment NK 1.28cm GeneChip U133A - DNA čip Hybridizační  jednotka   U133  set  (A+B)   -­‐33  000  lidských     genů   -­‐1  000  000  hybridi-­‐   začních  jednotek       DNA  čip  (Affymetrix  GeneChip  U133A)   Úvod  do  molekulární  medicíny  3/12   Strana    21   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Základní  dělení  DNA  čipů     Dle  charakteru  detekce   1)  pasivní  –  pracovní  podmínky  pro  všechny  hybridizační  jednotky    jsou  stejné  –  Affymetrix,  Agilent   1)  akCvní  –  pracovní  podmínky  každé  hybridizační  jednotky  lze  ovlivňovat    individuálně  –  Nanogen     Dle  typu  sond   1)  cDNA  čipy  –  historicky  Agilent     2)  oligonukleoCdové  čipy  –  Affymetrix  (25mers),     Agilent  (60mers)     Dle  počtu  sond   1)  vyskohustotní  DNA  čipy  (celogenomové)  –  Affymetrix,  Agilent,  …   2)  nízkohustotní  DNA  čipy  (stovky  genů)  –  Eppendorf,  Superarray,  …   Úvod  do  molekulární  medicíny  2/12   Strana    35   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Experiment  s  DNA  čipem   Úvod  do  molekulární  medicíny  3/12   Strana    13   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Izolace  RNA  a  vliv  její  integrity  na  analýzu  expresních  profilů   Vzorek  č.  395-­‐2001-­‐1a   RIN  =  8,4   Vzorek  č.  03/271   RIN  =  2,8   c  =  0,4412  ug/ul   A260/A280  =  1,93   A260/A230  =  1,79   c  =  0,2412  ug/ul   A260/A280  =  2,03   A260/A230  =  1,82   RIN  =  RNA  Integrity  Number  (0  –  10)   Jako  minimální  RIN  vzorku   byla  stanovena  hodnota  7.   Úvod  do  molekulární  medicíny  2/12   Strana    31   ©  Ondřej  Slabý,  2009   U  cDNA  čipů  hybridizujeme  na     jednom  čipu  značenou  ss-­‐cDNA   získanou  z  testovaného  a     referenčního  vzorku.     Proto  je  nutno  každou  ss-­‐cDNA   označit  rozdílným  fluorochro-­‐   mem.  Standardně:  referenční   ss-­‐cDNA  je    Cy-­‐3  –  zeleně  a     testovaná  ss-­‐cDNA  Cy5  –     červeně   Po  hybridizaci  následuje  vymiz   přebytečného  materiálu  a     čtení  (skenování)  čipu  pomocí       fluorescenčního  skeneru   Dvoubarevný  čipový  experiment  (cDNA,Agilent)   Strana    27   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Úvod  do  molekulární  medicíny  2/12   Čipovač     Microarrayer       Spo|er       http://cmgm.stanford.edu/pbrown/mguide/index.html Výroba cDNA ČIPŮ Úvod  do  molekulární  medicíny  2/12   Strana    32   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Oligonukleo^dové  DNA  čipy  –  Affymetrix  –  výroba   syntézou  in  situ   -­‐oligonukleo^dové  čipy,  jednovláknové    fragmenty  NK  o  délce  ≈25  bazí   FOTOLITOGRAFICKÁ  SYNTÉZA   1.28  x  1.28+  cm  plocha  čipu   HJ  ~5    x  5  µm  průměr  plocha     (≈  miliony  sond  na  6,500,000  HJ)     Úvod  do  molekulární  medicíny  2/12   Strana    33   ©  Ondřej  Slabý,  2009   PŘÍPRAVA  OLIGONUKLEOTIDOVÝCH  SOND   mRNA  sekvence  daného   genu  -­‐>  virtuálně   vyselektováno  11-­‐20   specifických   oligonukleo^dových   úseků  reprezentujících   daný  gen-­‐>   reverzní  transkripce  do   sekvence  cDNA     -­‐>  fotolitografická  syntéza   přímo  na  povrchu  čipu   Affymetrix  GeneChip   Referenční  a  partnerské   sondy  v     referenčních  a   partnerských     hybridizačních     jednotkách.     Liší  se  cílenou  záměnou   jednoho  nukleo^du  v   centrální  oblas^   (nega^vní  kontrola).   Úvod  do  molekulární  medicíny  2/12   Strana    34   ©  Ondřej  Slabý,  2009   IVT,  značení  cRNA  bio^nem  a  posthybridizační  detekce   Izolace    RNA  /  mRNA   -­‐>  reverzní    transkripce     -­‐>  ss-­‐cDNA     -­‐>  PCR  syntéza  ds-­‐DNA   s  T7  promotory   -­‐>  lineární  amplifikace     a  zároveň  in-­‐vitro     reverzní  transkripce     s  inkorporací    NTPs   (pseudouridin  nesoucí  bio^n   -­‐-­‐nepřímá  metoda)   -­‐>  bio^nem  značená   cRNA     -­‐>  hybridizace       fragmentace   Úvod  do  molekulární  medicíny  2/12   Strana    35   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Faktory  ovlivňující  čipové  analýzy   heterogenita  souboru  pacientů,  kvalita  vstupního  materiálu,     rozdílnost  čipových  pla‚orem,  validace  výsledků     Biologická  variabilita  =  charakterisCka  individua  nebo  systému     (geneCcký  základ  a  jeho  variace,  vývojové  stádium,  fyziologický  stav,   teplota,  kulCvační  podmínky,  sledované  experimentální  podmínky,  atd.)     Biologickou  variabilitu  odlišit  od  technologické  variability   (zpracování  a  nanášení  vzorku,  čipy  a  jejich  výroba,  značení  cDNA,     hybridizace,    RNA  a  cDNA  amplifikace,  skenování  a  skener)   odlišit  -­‐pozadí  od  biologicky  důležitých  genů  včetně  těch     exprimovaných  na  nízké  úrovni   -­‐odlišit  nespecifické  změny     (stresové  reakce),  atd.   -­‐kontaminace  jinými  buněčnými     populacemi   Moderní  metodické  přístupy  v  molekulární  medicíně  II  –  faktory  ovlivňující  čipové  analýzy,    základní  staCsCcké  přístupy  k  analýze  čipových  dat,  další  čipové  technologir  SNP  čipy,  CGH   čipy,  mikroRNA  čipy,  ChiP–on-­‐chip,  využi„  genomiky  pro  molekulární  klasifikaci  nádorových   onemocnění,  jak  navrhovat  studie  a  jak  číst  publikace  –  výhody  a  limitace  genomických   metod     Náplň  příšz  přednášky   Take  home   Interdisciplinární  charakter  biomedicínského  výzkumu   Biologický  materiál  užívaný  pro  účely  molekulární  medicíny     Odběr  klinického  materiálu  (stabilita,  archivace)   Laserová  mikrodisekce   Izolace  nukleových  kyselin     Kvan^fikace  a  stanovení  kvality  nukleových  kyselin   Real-­‐Time  PCR  (definice,  způsoby  detekce,  absolutní  a  rela^vní  kvan^fikace)   Real-­‐Time  PCR  arrays   DNA  čipy  (definice  a  základní  členění)   cDNA  čipy   oligonukleo^dové  čipy   Faktory  ovlivňující  čipové  analýzy         Úvod  do  molekulární  medicíny  2/12   Strana    36   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Úvod  do  molekulární  medicíny  2/12   Strana    37   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Dotazy?