Jméno a UCO:
Datum:
ÚLOHA A.
Detekce aktivity askorbát peroxidasy v polyakrylamidovém gelu
TEORETICKÝ ÚVOD
Askorbát peroxidasa (APX) je enzym zodpovědný za detoxifikaci peroxidu vodíku u rostlin. U rostlin se vyskytují tři izoenyzmové formy lišící se lokalizací v buňce. Všechny askorbát peroxidasy katalyzují reakci:
2 askorbát + H202 ->   2 monodehydroaskorbát + 2 H20
Role askorbát peroxidasy při obranné reakci byla podpořena pozorováními, že její aktivita narůstá při aplikaci různých environmentálních stresů. V některých případech však můžeme po infekci rostliny patogenem pozorovat drastický pokles její aktivity, který poté potencuje nekrózu buněk způsobenou převážně oxidačním stresem.
Využití nativní polyalkrylamidové elektroforézy pro stanovování aktivit celé řady enzymů má převážně největší význam při studiu aktivace jednotlivých izoenzymových forem. Toto stanovení aktivity APX je založeno na schopnosti askorbátu redukovat nitro-blue tetrazolium (NBT) v přítomnosti N,N,N',N'-tetraethylendiaminu (TEMED) na nerozpustný barevný formazan. V přítomnosti H202 je APX schopna zabránit tvorbě formazanu díky velmi rychlé oxidaci askorbátu. Proto je aktivita APX pozorována na gelu jako achromatický proužek.
POSTUP PRÁCE
Jednotlivé skupiny si rozdělí izolaci z listů po aplikaci cryptogeinu a kontrolních listů po aplikaci vody sesbíraných v časových intervalech Oh, 12h a 24h po aplikaci.
Izolace askorbát peroxidasy
1. 0,3 g tkáně vložte do třecí misky, zmrazte v tekutém dusíku a rozetřete v 0,6 ml izolačního pufru (100 mM fosfátový pufr (pH=7.0), 5 mM askorbát, 1 mM EDTA).
2. Homogenát přeneste do 1.5 ml zkumavky a centrifugujte při 12 000 x g 5 min při 4°C.
3. Supernatant přeneste do nové 1.5 ml zkumavky a opět centrifugujte při 20 000 x g 40 min při 4°C.
4. Odsajte supernatant a uchovávejte ho na ledu.
Příprava polyakrylamidového gelu
1. Gel propláchněte vodou, vložte do elektroforetické vaničky a přilijte elektroforetický pufr obsahující 2 mM askorbát.
2. Spusťte elektroforézu na 30 minut při konstantním proudu 15 mA/gel. Elektroforézu provádějte při 4°C.
Příprava a nanesení vzorků
1. Smíchejte 60 u.1 enzymového izolátu s 12 u.1 nanášecího pufru.
2. Na gel nanášejte 15 u.1 jednotlivých izolátu v následujícím pořadí:
Gel č.l: (15 u.1 izolátu): voda Oh, voda 12h, voda 24 h, mezera, cry 0 h, cry 12 h, cry 24h
3. Elektroforézu provádějte při konstantním proudu 15 mA/gel po dobu 2 hodin při 4 °C. Detekce aktivity askorbát peroxidasy v gelu
Všechny následující kroky budou prováděny při pokojové teplotě.
1. Ekvilibrujte gel 5 minut v 20 ml ekvilibračního pufru I (50 mM fosfátový pufr (pH=7.0), 2mM askorbát).
2. Poté inkubujte gely 10 minut v 20 ml ekvilibračního pufru II, do kterého přidejte 6 u.1 peroxidu vodíku.
3. Poté gel promyjte 1 minutu v 20 ml promývacího pufru (50 mM fosfátový pufr (pH=7.0)) a ponořte ho do detekčního pufru(50 mM fosfátový pufr (pH=7.8), 28 mM TEMED, 2.45 mM NBT). Aktivita askorbát peroxidasy bude detekována jako achromatický proužek na tmavém pozadí.
VYHODNOCENÍ
Srovnejte změny aktivity askorbát peroxidasy po aplikaci cryptogeinu ve srovnání s kontrolou (voda) v závislosti na čase. -Výsledek zdůvodněte.
Jméno a učo:
Datum:
ÚLOHA C. Klonování PCR produktu do plasmidu
TEORETICKÝ ÚVOD
Při klonování PCR produktů do plasmidů se využívá vlastnosti Taq polymerasy, a jiných non-proofreading polymeras, přidávat na konec nově syntetizovaného řetězce jednu bázi - adenin - navíc. Klonovací vektor je poté v lineární formě, kdy na každém konci nese jednu bázi - thymin nebo uracil - navíc. Za optimálních podmínek poté dochází k hybridizaci a ligaci PCR fragmentu do vektoru (Obrázek 1). PCR fragment hybridizuje do tzv. MCS (multicloning site) místa, které poté umožňuje použití širokého spektra restriktáz pro jeho případné vyštěpení z vektoru a re-klonování do jiného vektoru. MCS místo se nachází uvnitř genu lacZ kódujícího galaktosidasu, takže úspěšné včlenění PCR produktu do vektoru má za následek ztrátu aktivity, která tak může být využita pro selekci úspěšných transformátů pomocí barevného substrátu X-gal. Vektor rovněž nese rezistenci na jedno nebo dvě antibiotika (obvykle na ampicilin) a obsahuje T7 a SP6 promotor pro případnou produkci vklonovaného PCR produktu.
Obr. 1: Schéma klonovacího vektoru pDRIVE (Oiagen)
Před vlastním klonováním je vždy nutné PCR produkt přečistit na agarózovém gelu, abychom se vyhnuli klonování případných vedlejších produktů PCR reakce (dimery primerů, nespecifické produkty). Množství PCR produktu (ng) při ligaci se poté spočítá na základě vzorce:
(množství vektoru (ng) x délka PCR produktu (bp) x molární poměr) /délka vektoru (bp) Ligační reakce většinou poté probíhá při pokojové teplotě nebo 4°C po dobu 1-2 hodin. Poté dochází ke vložení ligovaného vektoru do kompetentních buněk. V našem případě budou použity termo-kompetentní buňky.
Kompetentní buňky jsou skladovány při -70°C a využívá se jejich schopnosti po rozmrazení a vystavení krátkému teplotnímu šoku přijmout DNA. Po teplotním šoku je k buňkám obvykle přidáno SOC médium a jsou 2 hodiny inkubovány při 37°C. Poté jsou vyočkovány na misku s antibiotikem (ampicilinem) a následující den je pozorován počet úspěšných transformantů. Protože může docházet i k ligaci vektoru bez vloženého PCR produktu, je do média na kultivačních miskách přidán barevný substrát X-gal s induktorem IPTG, kdy v případě ligace samotného vektoru dochází k růstu modrých kolonií (enzym galaktosidasa je aktivní) a v případě úspěšné ligace PCR produktu do vektoru k růstu bílých kolonií (enzym galaktosidasa je inaktivován vloženým PCR produktem).
PCR produkt pDrive vektor Ligation Mix PCR voda [1 h inkubovat při 3 -►
Teplotní šok SOC médium
Kompetentní buňky -►
Kultivace na miskách, screening kolonií
Ob. 2: Schéma transformace buněk JM109
POSTUP PRÁCE
Amplifikace vybraného obraného genu (PRla nebo PR5a nebo PAL nebo EFla) Připravte reakční směs dle uvedené tabulky do PCR zkumavky:
FW Primer (5 uM) 1,5 ul Rev Primer (5 uM) 1,5 u.1 GoTaq qPCR M. Mix 2x kone 10 u.1 PCR voda_5 ul
Templát
2 jil
Reakční směs jemně promíchejte a krátce stočte a vložte do cycleru. Na cycleru nastavte následující program:
95°C 95°C 60°C 72°C 72°C
2:30 min
30 s "
30 s -40x
20 s -7:00 min
Analýza PCR produktu a jeho přečištění
Přečištění bude prováděno pomocí Wizard Gel Extraction Kit (Promega)
1. Připravte 1,5% agarózový gel.
2. Na gel naneste 20 u.1 PCR produktu smíchaného s 3 u.1 Nanášecího pufru a do jedné jamky a 2.5 u.1 délkového markeru (GeneRuller 50 bp) do druhé jamky.
3. Spusťte elektroforézu: 200 V, 20 minut.
4. Po skončení elektroforézy vynulujte váhu na 1,5 ml zkumavku.
5. Dejte gel na transiluminátor a vyřežte ze dvou drah proužek o velikosti 250 bp.
6. Oba proužky přeneste do 1,5 ml zkumavky a zvažte.
7. Do zkumavky přidejte Binding buffer v poměru 10 u.1 roztoku na 10 mg gelu.
8. Inkubujte směs 10 minut při 55°C, kdy průběžně zkumavku vortexujte, abyste urychlili rozpuštění gelu.
9. Poté přeneste celou směs na kolonku (pokud je směsi více jak 800 u.1 tak nadvakrát).
10. Stočte kolonku 1 min při 14000 x g.
11. Vylijte protekly roztok a přidejte na kolonku 700 u.1 roztoku Wash Buffer.
12. Centrifugujte 1 min při 14000 x g.
13. Vylijte protekly roztok a přidejte na kolonku 500 u.1 roztoku Wash Buffer.
14. Centrifugujte 1 min při 14000 x g.
15. Vyhoďte zkumavku, kolonku přeneste do nové 2.0 ml zkumavky a centrifugujte 5 min při 14000 x g.
16. Vyhoďte zkumavku, kolonku přeneste do nové 1,5 ml zkumavky a na její střed napipetujte 30 u.1 PCR vody.
17. Centrifugujte 1 min při 14000 x g, PCR produkt je přečištěn, změřte jeho koncentraci na NanoFotometru.
Klonování PCR produktu do plasmidu pGEM-TEasy a jeho následná transformace do buněk E. coliJM109
1. Rozmrazte 2x Ligation Master Mix, pGEM-TEasy klonovací vektor a PCR vodu.
2. Připravte ligační směs:
pGEM-TEasy klonovací vektor PCR produkt Ligation buffer, 2x ImProm II Ligasa PCR voda
1 lil
1-4 u.1 (vypočtěte na základě vzorce) 5 ul
1 lil do 10 ul
3. Jemně ligační směs promíchejte, krátce stočte a inkubujte 1 hodinu při pokojové teplotě.
4. Rozmrazte potřebný počet alikvotů kompetentních buněk JM109 na ledě a předehřejte SOC medium na pokojovou teplotu.
5. Do zkumavky s kompetentními buňkami přidejte 2 u.1 ligační směsi, opatrně promíchejte a inkubujte 20 minut na ledě.
6. Poté umístěte zkumavku do termostatu na 42°C přesně na 40s a poté ji vraťte na 2 minuty do ledu.
7. Přidejte 950 ul SOC media a inkubujte za třepání (250 rpm) 2 hodiny.
8. Od tohoto bodu provádějte všechny činnosti v laminárním boxu a sterilně.
9. Poté si připravte nalité LB misky s ampicilinem (100 u.g/ml) a X-gal/IPTG
10. Napipetujte na připravené misky 100 u.1 SOC media s kompetentními buňkami a důkladně medium rozetřete bakteriologickou hokejkou.
13. Nechte z misek odpařit zbytek rozetřeného média, misky zavřete a umístěte dnem vzhůru do termostatu na 37°C.
14. Následující den popište výsledek.
Zaočkovaní kolonie pro izolaci plasmidu
Ze selekční misky vyberte jednu kolonii nesoucí plasmid s inzertem a pomocí malé špičky ji přeneste do 2 ml LB média s ampicilinem (100 u.g/ml) a inkubujte na třepačce při 37°C 12-16 hodin.
Izolace plasmidu z kultury E. coli
1.
2.
Přeneste 600 u.1 bakteriální kultury do 1.5 ml zkumavky.
Přidejte 100 u.1 Cell Lysis pufru a převracením šestkrát směs ve zkumavce promíchejte (vzorek by měl celý zmodrat).
3. Ihned přidejte 350 u.1 vychlazeného Neutralizačního roztoku a převracením směs ve zkumavce pořádně promíchejte (vzorek by měl celý zežloutnout).
4. Centrifugujte 3 min při 14 000 x g.
5. Supernatant opatrně přeneste na kolonku umístěnou ve zkumavce.
6. Centrifugujte 15 s při 14 000 x g.
7. Odstraňte protekly roztok a na kolonku napipetujte 200 u.1 Endotoxin Removal Wash pufru.
8. Centrifugujte 15 s při 14 000 x g.
9. Odstraňte protekly roztok a na kolonku napipetujte 400 u.1 Wash pufru.
10. Centrifugujte 15 s při 14 000 x g.
11. Přeneste kolonku do nové zkumavky, přidejte 30 u.1 Elučního pufru a nechte 1 min inkubovat na stole.
12. Centrifugujte 15 s při 14 000 x g.
13. Plasmidová DNA je připravena k použití, změřte její koncentraci a čistotu na NanoFotometru.
Příprava roztoku plasmidu o definované koncentraci
1. Na základě znalosti velikosti plasmidu s PCR produktem (přibližně 3200 bp) a střední molekulové hmotnosti 1 páru bazí DNA (650g/mol) vypočítejte koncentraci plasmidové DNA při následujícím počtu kopií:
100 kopií/u.1 ....................
1 000 kopií/u.1 ....................
10 000 kopií/u.1 ....................
100 000 kopií/u.1 ....................
1000 000kopií/u.l ....................
2. Na základě vypočtených hodnot zřeďte plasmidovou DNA PCR vodou na požadovanou koncentraci v celkovém objemu 100 u.1.
VYHODNOCENÍ
Uveďte celkový počet kolonií po transformaci.
Uveďte kvantitu a čistotu vyizolované plasmidové DNA.
Uveďte vypočítané hodnoty koncentrací plasmidové DNA pro jednotlivý počet
kopií/u.1.
Jméno a UCO:
Datum:
Úloha D.
Stanovení změny exprese genů pro pathogenesis related (PR) proteiny u rostlin tabáku
TEORETICKÝ ÚVOD
Na počátku byly PR (pathogenesis related) proteiny identifikovány jako proteiny, které se nevyskytují ve zdravých rostlinách a po infekci patogenem dochází k jejich masivní akumulaci. Do dnešní dobyje známa celá řada PR proteinů, které byly rozděleny do 17 tříd, jak je uvedeno v tabulce níže. Každá třída může být dále dělena na kyselé a bazické homology. Syntéza kyselých forem PR proteinů je obvykle spojena s infekcí patogenem a u rostlin jejich syntéza vyvolává tzv. systémově navozenou rezistenci (SAR - systemic acquired resistance). Na druhé straně syntéza bazických forem PR proteinů je spojena s poškozením nebo napadením rostliny herbivorním hmyzem. Jejich syntéza je poté spojena s tzv. rezistencí proti herbivornímu hmyzu (IRH - induced resistance against herbivores).
Třída	Typický zástupce	Funkce
PR-1	PR-1 (tabák)	neznámá
PR-2	PR-2 (tabák)	|3-l,3-glukanasa
PR-3	P, Q (tabák)	chitinasa
PR-4	~R' (tabák)	chitinasa
PR-5	S (tabák)	podobný thaumatinu
PR-6	Inhibitor 1 (rajče)	proteinasový-inhibitor
PR-7	P69 (rajče)	endoproteinasa
PR-8	Chitinasa (okurka)	chitinasa
PR-9	'lignin-forming peroxidase' (tabák)	peroxidasa
PR-10	~PRr (petržel)	podobný ribonuklease
PR-11	chitinasa třídy V (tabák)	chitinasa
PR-12	RS-AFP3 (ředkvička)	defensin
PR-13	THI2.1 (Arabidopsis)	thionin
PR-14	LTP4 (ječmen)	lipid-transfer protein
PR-15	OxOa (ječmen)	oxalát oxidasa
PR-16	OxOLP (ječmen)	podobný oxalát oxidase
PR-17	PRp27 (tabák)	neznámá
RT-qPCR:
V praxi se často setkáváme s potřebou provést kvantifikaci transkriptu vybraného genu. V současné době se ke kvantifikaci transkriptu vybraných genů využívá především metoda reverzní transkripce ve spojení s metodou kvantitativní polymerázové řetězové reakce (RT-qPCR).
Reverzní transkripce
V prvním kroku je nejprve provedena reverzní transkripce izolované celkové RNA. Reverzní transkripce (RT) je enzymatický proces, při kterém je podle templátové RNA syntetizována cDNA. RT je katalyzována enzymem reverzní transkriptázou (RNA-dependentní DNA polymeráza). Pro průběh reakce je tedy nezbytná přítomnost RNA, reverzní transkriptázy, směsi deoxyribonukleotidtrifosfátů (dNTP), reakčního pufru a primerů. Zpravidla se pro tyto účely využívají tři typy primerů:
• oligo dT primery - používají se v případě mRNA obsahující polyA 3'-konec, v případě dlouhých transkruptů nemusí dojít k úplnému přepisu
• směs náhodných hexaoligonukleotidů - nasedají náhodně na templátovou RNA, jsou vhodné zejména pro přepis celkové RNA a delších transkriptu
• sekvenčně specifické primery
qPCR
V následujícím kroku je poté přepsaná cDNA specificky namnožena pomocí kvantitativní polymerázové řetězové reakce (qPCR). Principem qPCR je kvantifikace množeného produktu v každém jednotlivém cyklu PCR. K detekci vznikajícího produktu mohou být použity různé systémy, které jsou založeny na stanovení změny intenzity fluorescenčního záření během amplifikace. Obvykle se používají interkalační barviva nebo specifické sondy.
Vyhodnocení
Fluorescence je měřena během každého cyklu PCR a její intenzita je úměrná množství nově vzniklé DNA. Kvantifikace se provádí prostřednictvím matematické analýzy amplifikační křivky a hodnoty Ct (Cycle treshold), při které došlo k překročení nastavené hladiny fluorescence. Pro vyhodnocení real-time PCR se může použít buď relativní, nebo absolutní kvantifikace. Absolutní kvantifikace umožňuje přímo určit výchozí počet kopií cílových molekul. Pro stanovení je třeba sestavit kalibrační křivku pro sérii standardů a z této křivky se pak odečítá koncentrace neznámého vzorku. Relativní kvantifikace popisuje relativní změnu exprese genu vůči vnitřnímu standardu. Jako vnitřní standard se využívá tzv. house-keeping gen, jehož hladina exprese je za podmínek experimentu konstantní. Pro výpočet exprese cílového genu ve vztahu k odpovídajícímu house-keeping genu je možno použít několik metod. Metody používané pro výpočet relativní kvantifikace jsou buď již zmíněná metoda kalibračních křivek, nebo častěji používaná srAfriávací Ct metoda. Základním předpokladem při srovnávacíAACt metodě je, že amplifikace cílového i house -keeping genu probíhá se stejnou účinností. K výpočtu celkového množství cílového genu se poté používá vztah:
p_2 -AACt
kde: AACt= ACt testovaného vzorku- ACt kontrolního vzorku ACt testovacího vzorku=Ct cílového genu Ct house-keeping genu
Literatura
1. Buchanan B. B., Gruissem W., Jones R. L: Biochemistry & molecular biology
2. Edreva A. (2005): Pathogenesis-related proteins: Research progress in the last 15 years. Gen. Appl. Plant Physiology 31(1-2), 105-124.
3. Mikes V., Milat M-L, Ponchet M., Ricci P., Blein J-P. (1997): The fungal elicitor cryptogein is a sterol carrier protein. FEBS Letters 416,190-192.
4. van Loon L. C, Rep M., Pieterse C. M. J.(2006): Significance of Inducible Defense-related Proteins in Infected Plants. Annu. Rev. Phytopathol. 44,135-162
POSTUP PRÁCE
Izolace celkové RNA z listu tabáku
Jednotlivé skupiny si rozdělí izolaci celkové RNA z listů po aplikaci cryptogeinu a kontrolních listů po aplikaci vody, sesbíraných v různých časových intervalech po aplikaci.
1. Odeberte 100 mg tkáně a vložte ji do 2.0 ml zkumavky společně s drtícím olůvkem.
2. Vložte zkumavky do drtící vložky, zašroubujte vložku víčkem a vhoďte ji do kapalného dusíku. Po vymražení zasuňte vložku do pouzdra a asi minutu třepejte.
3. Poté vyjměte zkumavku z vložky, otevřete ji, pomocí pinzety vejměte olůvko a přidejte 1 ml Tri Reagentu. Inkubujte zkumavku přibližně 5 minut při pokojové teplotě.
4. Přidejte 200 u.1 chloroformu, vortexujte 15 s a nechte stát 15 minut při pokojové teplotě.
5. Centrifugujte 15 minut při 12 000 x g.
6. Horní fázi přeneste do čisté zkumavky, přidejte 1/10 izopropanolu, promíchejte a nechte stát 7 minut při pokojové teplotě.
7. Centrifugujte 10 minut při 12 000 x g.
8. Supernatant přeneste do nové zkumavky a přidejte takové množství izopropanolu, aby celkový přidaný objem isopropanolu byl 500 ul.
9. Promíchejte zkumavky a nechte stát 7 minut při pokojové teplotě.
10. Centrifugujte 10 minut při 12 000 x g.
11. RNA pelet promyjte 1 ml 75% ethanolu a centrifugujte 10 minut při 12 000 x g.
12. Odstraňte ethanol a nechte RNA pelet vyschnout.
13. Rozpusťte RNA v 10 u.1 formamidu.
Stanovení koncentrace a čistoty vyizolované RNA pomocí Nano-fotometru
Do dvou zkumavek napipetujte 9 u.1 DEPC vody. Do jedné přidejte 1 u.1 formamidu (BLANK) a do druhé 1 u.1 vyizolované RNA. Promíchejte zkumavky na vortexu a krátce stočte.
1. Na fotometru nastavte měření koncentrace RNA a ředící koeficient lOx.
2. Na čočku měřící kyvety napipetujte 3 u.1 DEPC vody s formamidem a zakryjte vrškem s faktorem 10
3. Zmáčkněte tlačítko pro měření Blanku (modré).
4. Čočku a vršek otřete tampónem a poté na čočku napipetujte 3 u.1 ředěného vzorku RNA.
5. Zakryjte čočku vrškem s faktorem 10 a zmáčkněte tlačítko pro měření vzorku (zelené)
6. Vytisknete koncentraci a hodnoty čistoty A26o/28o, A230/260 a naměřené spektrum.
Reverzní transkripce izolované RNA
1. Nařeďte vyizolovanou RNA na koncentraci 0.2 u.g/u.1 a umístěte ji na led. Připravte reakční směs:
5 x RT ImPromlI buffer 2.0 pil
25 mM MgCI2 2.2 ul
dNTPs 1.0 pil
Random Hexamers 0.5 u.1
Voda 2.6 pil
Reverse transcriptase 0.5 u.1
RNasin 0.1 u.1
2. Přidejte do reakční směsi 1 u.1 naředěné RNA o koncentraci 0.2 u.g/u.1. Směs jemně promíchejte a krátce stočte. Vložte zkumavku do termocycleru a nastavte následující program:
25°C 10 min
42°C 45 min
72°C 15 min
4°C hold
Amplifikace genu pro PRla, PR5, PAL a EFla pomocí RealTime PCR
1. Připravíme si reakční směs vztaženou na 1 vzorek dle následující tabulky, kdy kamplifikaci využijeme primery pro geny PRla nebo PR3 nebo PR5a nebo PAL a EFla:
2xGoTaq qPCR M. Mix 7.5 u.1
F primer (10 u.M) 0.5 u.1
R primer (10 nM) 0.5 u.1
Voda 5.0 pil
2. Reakční směs promícháme, krátce stočíme a přidáme 1.5 u.1 cDNA vzniklé po reverzní transkripci nebo kvantifikačních standardů. Vložte zkumavku do termocycleru a nastavte následující program:
95°C	2:30	
95°C	0:20	.45 x
60°C	0:40 .	
95°C	0:15	
60°C	0:30	
95°C	0:15	
VYHODNOCENÍ
Uveďte koncentraci a na základě naměřených dat zhodnoťte čistotu izolované RNA Na základě výsledku RealTime PCR vypočítejte metodami absolutní nebo relativní kvantifikace za použití delta Ct metody, zdali dochází po přidání cryptogeinu ve sledovaných časových intervalech (8 a 24h) ke zvýšení transkriptů vybraných PR proteinů a o jak velké zvýšení se jedná.
Dále na základě vypočtených výsledků porovnejte metodiky relativní a absolutní kvantifikace.
Jméno a UCO:
Datum:
Úloha E
Identifikace jednotlivých druhů Václavek ze vzorku půdy
TEORETICKÝ ÚVOD
V současné době je na světě rozlišováno přes 40 druhů václavek (rod Armillaria), které se vyskytují na všech kontinentech s výjimkou Antarktidy. Poprvé byl rod václavka identifikován v 18. století, ale až v roce 1973 objevení bifaktoriálního sexuálního inkompatibilitního systému umožnilo spolehlivě identifikovat jednotlivé druhy václavek. V Evropě bylo do současnosti identifikováno sedm druhů václavek, Armillaria borealis, cepistipes, ectypa, gallica, mellea, ostoyae a tabescens [2]. Václavky se vyskytují téměř na všech druzích porostů, mezi něž patří především listnaté a jehličnaté lesy, ovocné sady a parky. Výskyt jednotlivých druhů je omezen jednak klimatickými a geografickými podmínkami a na druhé straně výskytem vhodných hostitelů [2]. Václavky se v lese podílejí na rozkladu odumřelé dřevní hmoty, čímž v mnohém připomínají chování mykorhizních hub. V mnoha případech však přechází k nekrotrofnímu parazitizmu, resp. saproparazitizmu, na celé škále dřevin, především pak na smrku, borovici a dubu. Byly však pozorovány i na nahosemenných a krytosemenných rostlinách, na celé řadě bylin, na obilninách nebo na okrasných rostlinách. Každoročně pak způsobují obrovské škody na lesních porostech [1,2]. Některé druhy mohou být obligátními saprotrofy, avšak všechny druhy jsou schopné napadat stresem oslabené hostitele. Některé druhy dále produkují antibiotické látky, které jim pomáhají udržet kontrolu nad infikovaným hostitelem [2]. Jednotlivé druhy václavek se liší jednak svou patogenitou a také spektrem napadaných hostitelů. Proto je z hlediska lesního hospodářství velmi důležité odlišovat od sebe jednotlivé druhy.
V současné době jsou k identifikaci jednotlivých druhů václavek nejvíce používané párové testy objevené Hinkitou v roce 1973, avšak v poslední době se k identifikaci začínají používat molekulárně-biologické metody, mezi něž především analýza restrikčních fragmentů ribozomální DNA.
Reštrikční analýza.
Reštrikční endonukleasy jsou enzymy, které rozpoznávají ve dvoušroubovicové DNA specifickou sekvenci složenou obvykle ze 4 až 6 párů bazí a v tomto místě DNA specificky štěpí. Většina rozpoznávaných sekvencí restrikčními enzymy má dokonalou dvojčetnou rotační symetrii. Tyto sekvence jsou známy jako tzv. palindromy. Celá řada restrikčních
enzymů (např. Hinf I, Mbo I) katalyzuje štěpení dvou vláken DNA v polohách symetricky rozmístěných okolo středu palindromové sekvence. Vznikají tak fragmenty s kohezními či lepivými konci. U některých restrikčních enzymů (Alu I) naopak místo štěpení prochází přímo dvojčetnou osou palindromu. Vznikají pak fragmenty se zarovnanými či tupými konci [18].
Polymorfie délky restrikčních fragmentů (RFLP) poté poskytuje cenné informace o rozdílech mezi sekvencemi u jednotlivých druhů organizmů a je v současné době jednou z nejpoužívanějších metod v taxonomii a fylogenezi.
Identifikace na základě ribozomální RNA
Geny kódující ribozomální RNA jsou z hlediska taxonomického a fylogenetického velmi často používané. ITS oblast rDNA je velmi polymorfní, čímž se stává pro taxonomické a fylogenetické studie velmi výhodnou. Tato oblast leží mezi malou jadernou rDNA a velkou jadernou rDNA a je 5.8S rDNA rozdělena na oblasti ITS 1 a ITS 2 [3]. Pro amplifikaci této oblasti u hub byly navrženy primery ITS 1 a ITS 4 (obrázek 1).
ITÍSl
A li I
li-				/r
li    18S rDNA	ITS1	5.8S	ITS2	23S í'DNA U
AR2
ITS4
Obrázek 1: Umístění ITS oblasti a primem ITS 1, ITS 4, ARM1 a ARM2 na rDNA [3]
Detekce václavek na základě RFLP analýzy ITS oblasti
Pro specifikou detekci václavek poté byly navrženy primery ARM1 a ARM2 ležící na okrajích oblastí ITS1 a ITS2 (obrázek 1). Tyto primery se používají pro specifickou amplifikaci všech sedmi evropkých druhů václavek. Pro dosažení velmi vysoké citlivosti metody pro identifikaci václavek se vzorků půdy se využívá tzv. nested PCR, při které dochází k amplifikaci požadované oblasti pomocí dvou párů primerů. První pár, tzv. externí, se většinou vyznačuje nižší specifitou a slouží k před-množení požadované oblasti. Druhý pár, tzv. interní, je poté vysoce specifický a používá se k namnožení požadované oblasti z již před-množeného vzorku. Při identifikaci václavek ze vzorků půdy lze využit jako externí pár primerů primery ITS1 a ITS4 a jako interní pár primery ARM1 a ARM2.
Pro určení konkrétního druhu václavky se poté využívá RFLP analýza oblasti namnožené pomocí primerů ARM1 a ARM2 využívající reštrikční endonukleázy Hinf\ a Alu\. Délky restrikčních fragmentů pro jednotlivé druhy václavek jsou uvedeny v tabulce níže.
Izolát	Délka amplikonu (bp) ITS/AR	Reštrikční fragmenty Hinfl (bp)	Reštrikční fragmenty Alu\ (bp)
A. borealis Ala	868/711	293, 172, 56, 31, 75, 68	41, 97, 180, 222, 323
A. cepistipes 204b	868/711	293, 227, 43, 132	41, 97, 180, 222, 323
A. gallica 147b	868/711	294, 227, 43, 63, 69	41, 97, 180, 222, 323
A. mellea 185b	882/724	148, 159, 401	40, 47, 97, 149, 214, 325
A. ostoyae C2a	870/713	294, 228, 31, 75, 69	41, 97, 180, 222, 323
/A. tabescens T4a	847/690	295, 125, 93, 32, 129	35, 70, 96, 138, 181, 327
Literatura
1. Jankovský L. 1997. Biológie Václavek, Dizertační práce MZLU, Brno.
2. Shaw C.G., Kile, G.A. 1991. Armillaria Root Disease, Agriculture Handbook 691, Department of Agriculture. Washington D.C., United States
3. White, T.J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protocols: A Guide to Methods and Aplications: 315-322, Academic Press, Inc.
POSTUP PRÁCE
Izolace DNA z půdy pomocí izolačního kitu PowerSoil DNA
1. Do třecí misky navažte přibližně 250 mg vzorku půdy a rozetřete s trochou mořského písku a směs přeneste do připravených rozbíječích zkumavek. Promíchejte opatrným vortexováním.
2. Přidejte 60 u.1 roztoku Cl a několikrát promíchejte obracením zkumavky nebo vortexujte.
3. Umístěte rozbíječi zkumavky vodorovně a vortexujte maximální rychlostí 10 minut.
4. Centrifugujte 30 sekund při 10 000 x g.
5. Přeneste supernatant do čisté 2 ml mikrozkumavky.
Poznámka: Očekávejte 400 až 500 u.1 směsi. Směs může stále obsahovat určité množství půdních částic.
6. Přidejte 250 u.1 roztoku C2 a vortexujte 5 sekund. Inkubujte 5 minut při 4°C.
7. Centrifugujte 1 minutu při pokojové teplotě a při 10 000 x g.
8. Přeneste do čisté 2 ml mikrozkumavky (přiložena) maximálně 600 u.1 supernatantu.
9. Přidejte 200 u.1 roztoku C3 a krátce vortexujte. Inkubujte 5 minut při 4°C.
10. Centrifugujte 1 minutu při pokojové teplotě při 10 000 x g.
11. Přeneste do čisté 2 ml mikrozkumavky (přiložena) maximálně 750 u.1 supernatantu.
12. Přidejte 1200 u.1 roztoku C4 a vortexujte 5 sekund.
13. Přeneste přibližně 675 u.1 do kolonky a centrifugujte 1 minutu při 10 000 x g při pokojové teplotě. Vylijte přefiltrovanou kapalinu a přidejte dalších 675 u.1 směsi do kolonky a centrifugujte 1 minutu při 10 000 x g při pokojové teplotě. Přidejte do kolonky zbytek směsi a centrifugujte 1 minutu při 10 000 x g při pokojové teplotě.
Poznámka: Každý vzorek je nutné rozdělit na tři dávky.
14. Přidejte 500 u.1 roztoku C5 a centrifugujte 30 sekund při 10 000 x g při pokojové teplotě.
15. Vylijte proteklou kapalinu.
16. Centrifugujte znovu 1 minutu při 10 000 x g při pokojové teplotě.
17. Opatrně přeneste kolonku do čisté 2 ml mikrozkumavky (přiložena). Zabraňte potřísnění kolonky roztokem C5.
18. Přidejte 80 u.1 roztoku C6 doprostřed bílé membrány uvnitř kolonky a centrifugujte 30 sekund při pokojové teplotě při 10 000 x g.
19. Vyjměte kolonku. DNA ve zkumavce je nyní připravena pro další použití.
Měření čistoty izolované DNA pomocí Nano-fotometru
1. Na fotometru nastavte měření koncentrace dsDNA.
2. Na čočku měřící kyvety napipetujte 3 u.1 PCR vody a zakryjte vrškem s faktorem 10.
3. Zmáčkněte tlačítko pro měření Blanku (BLANK).
4. Čočku a vršek otřete tampónem a poté na čočku napipetujte 3 u.1 vzorku DNA.
5. Zakryjte čočku vrškem s faktorem 10 a zmáčkněte tlačítko pro měření vzorku (SAMPLE).
6. Vytisknete hodnoty čistoty A26o/28o, A230/260 a naměřené spektrum.
Příprava 1. Reakční směsi nested-PCR
Připravte reakční směs dle uvedené tabulky do PCR zkumavky:
PrimerlTSl(l uM) 1,5 ul
Primer ITS4 (1 uM) 1,5 ul
Kapa 2G Mix 2x konc 15 u.1
PCR voda_10 ul
DNA 2 \x\
Reakční směs jemně promíchejte a krátce stočte a vložte do cycleru. Na cycleru nastavte následující program:
95°C 2,5min
95°C 30s~|
55°C 30s [- 35x
72°C 20S-1
Příprava 2. Reakční směsi nested-PCR
Připravte reakční směs dle uvedené tabulky do PCR zkumavky:
Primer ARM1 (5 uM) 1,5 ul
Primer ARM2 (5 uM) 1,5 ul
Kapa 2G Mix 2x konc 10 u.1
PCR voda_5_uJ
1 PCR reakce 2 u.1
Reakční směs jemně promíchejte a krátce stočte a vložte do cycleru. Na cycleru nastavte následující program:
95°C 2,5min
95°C 30s-
60°C 30s -
72°C 20s-
40x
Reštrikční analýza PCR produktu
Připravte reakční směs dle uvedené tabulky do PCR zkumavky:
PCR reakční směs 10 x Reakční pufr Enzym Hinf I (Alul)
16 ul
2ul
2ul
Reakční směs jemně promíchejte, krátce stočte a inkubujte 15 min při 37°C. Analýza Restrikčních fragmentů pomocí agarózové elektroforézy
Připravte 2% agarosový gel - navažte 2 g agarózy, přidejte 100 ml lx TBE pufru a agarosu důkladně rozvařte v mikrovlné troubě. Poté nechte zchladnout agarosu na cca. 70°C, přidejte 2 u.1 Midori green DNA stain (http://www.nippongenetics.eu/dnarna-electrophoresis/dna-stains/midori-green-dna-stain/), promíchejte a nalijte do připravené vaničky. Vložte hřebínek a nechte asi 20 minut tuhnout.
Opatrně vytáhněte hřebínek, vložte nalitý gel do elektroforetické aparatury a zalijte TBE pufrem tak, aby byl gel cca 3mm pod úrovní hladiny (na aparatuře je značka maxima). K tomu si připravte cca 400ml lxTBE pufru.
Na parafilm naneste po kapkách nanášecí pufr, kapku smíchejte se 4 u.1 restrikčních směsí a ke zbytku PCR a naneste do jamky.
Naneste vzorky na gel v následujícím pořadí:
Délkový marker - PCR produkt - RA Hinfl - RA Alul
Elektroforézu provádějte při 100V cca 20 minut (čas je proměnlivý).
VYHODNOCENÍ
Uveďte koncentraci a na základě naměřených dat zhodnoťte čistotu izolované DNA Na základě délky amplifikátu a výsledku reštrikční analýzy určete, jaký druh václavky obsahoval váš vzorek půdy, výsledek zdůvodněte.
Jméno a učo:
Datum:
ÚLOHA F
Exprese a purifikace rekombinantních proteinů
Teoretická část
Pomocí různých expresních systémů je možné vytvořit rekombinantní protein odvozený od konkrétního genu, nebo části genu. Expresní systémy lze rozdělit do dvou hlavních tříd, prokaryotní a eukaryotní. Nejznámější a nejpoužívanější systém pro expresi proteinů je bakteriální expresní systém (E. coli). Výhodou tohoto systému je především jeho jednoduchost, vysoký výtěžek exprimovaného proteinu a v neposlední řadě jeho nízká časová a finanční náročnost. Na druhou stranu bakteriální systém neumožňuje posttranslační modifikace (možné ovlivnění terciární struktury proteinu) a je schopen exprese proteinů omezené velikosti (maximálně kolem 150 kDa). Typ exprese (cytosol nebo inkluzní tělíska) nelze ovlivnit a závisí zejména na struktuře proteinu.
Lineární molekula DNA obsahující gen pro daný protein (inzert) nese na svých koncích reštrikční místa kompatibilní s vektorem, která jsou potřebná pro tvorbu ligačních přesahů a začlenění inzertu do vektoru. Dále také obsahuje start a stop kodon a signální sekvenci usnadňující purifikaci výsledného proteinu.
Inzert se pomocí ligázy začleňuje do expresního vektoru. Každý expresní vektor obsahuje specifické sekvence potřebné pro integraci inzertu, selekci bakteriálního klonu a expresi proteinu (obr. 1).
• 77 promotor - sekvence, na kterou specificky nasedá T7 RNA polymeráza. Tato polymeráza pochází z bakteriofága A , což zajišťuje vazebnou specificitu pouze na daném úseku expresního vektoru.
• T7počátek transkripce - v tomto místě začíná T7 RNA polymeráza syntetizovat mRNA
• His Tag sekvence - sekvence kódující polyhistidinovou kotvu (His Tag). Pokud His Tag nepotřebujeme, je možné jej z vektoru vyštěpit.
• Klonovací místo - do tohoto místa lze vložit inzert. Obsahuje několik specifických sekvencí pro různé reštrikční endonukleázy, plní tak funkci univerzálního klonovacího místa.
• 77 terminátor - ukončuje transkripci inzertu
• Lad sekvence - kóduje lac represor, který se bez přítomnosti IPTG váže do blízkosti T7 promotoru a blokuje tak činnost T7 RNA polymerázy. V přítomnosti IPTG se lac represor váže na tyto molekuly, T7 RNA polymeráza nasedá na promotor a zahajuje transkripci.
• pBR322 počátek replikace - nutné pro replikaci vektoru během kultivace bakteriální kultury
• AmpR sekvence - kóduje rezistenci kampicilinu (nutné pro selekci klonů se zabudovaným vektorem)
Vektor s inzertem je poté potřeba vložit do tzv. kompetentních buněk. To jsou takové buňky, které jsou schopny přijmout DNA z prostředí. E. coli cizorodou DNA za normálních okolností nepřijímá, proto se kompetence buněk navozuje narušením buněčné stěny a membrány chloridem vápenatým. Nejčastěji se používají kompetentní buňky BL21 DE3, což jsou geneticky upravené klony E. coli umožňující cíleně ovlivnit a načasovat expresi proteinu (exprese se indukuje přídavkem IPTG). Transformované buňky se kultivují v LB (Luria-Bertani) médiu za standardních podmínek (37°C; 200 -250 rpm) za přítomnosti antibiotika a IPTG. Nejvyšší hladiny exprese buňky dosahují ve stacionární fázi (4 - 6 h). Po překročení této doby začínají v médiu docházet živiny, hromadí se odpadní látky, buňky se přestávají dělit a postupně odumírají. V této fázi také klesá exprese proteinu, který může být navíc poškozen stresovým stavem umírajících buněk.
Po expresi proteinu následuje purifikace, která zajišťuje odstranění všech nečistot a získání čistého produktu. Při purifikaci se uplatňují afinitní značky (tágy) připojené k proteinu (His Tag, c-myc, aj.), které umožňují jednoduchou jednokrokovou adsorpční purifikaci. Tyto tágy ovšem nesmí ovlivňovat terciární strukturu proteinu ani jeho biologickou aktivitu. Zároveň se musí dát snadno a specificky odstranit od nativního proteinu. Nejběžněji používaným tágem při purifikaci proteinů je polyhistidinová kotva (His6). Jde o metalafinitní metodu, při které dochází k poměrně silné interakci mezi imobilizovanými ionty kovů (Ni2+, Cu2+, Co2+, Zn2+) a histidinovými zbytky. Po důkladném odmytí nenavázané proteinové frakce a nečistot následuje uvolnění polyhistidinové kotvy pomocí imidazolu, který má vyšší afinitu vůči částicím kovu než histidinové zbytky.
Purifikovaný produkt je na závěr potřeba charakterizovat, tzn. potvrdit identitu, zjistit čistotu a koncentraci proteinu. Identita proteinu se nejčastěji určuje imunoanalýzou na western-blotu nebo pomocí hmotnostní spektrometrie. Ke stanovení čistoty proteinů ve většině případů postačuje denaturační polyakrylamidová gelová elektroforéza.
Literatura:
1. Chong S., et al., Single-column purification of free recombinant proteins using a self-cleavable afinity tag derived from a protein splicing element. Gene. 1997, roč. 192, s. 271-281.
2. Takacs, Bela J. a GIRARD, Marie-Francoise. Preparation of clinical grade proteins produced by recombinant DNA technologies. Journal of Immunological Methods. 1991, roč. 143, s. 231-240
3. SHIH, Yan-Ping, et al. High-throughput screening of soluble recombinant proteins. Protein Science. 2002, roč. 11, s. 1714-1719
Postup práce
Příprava, růst kultury a sklízení kultury
1. Do sterilní 250 ml Erlenmeyerovy baňky nalijte 30 ml autoindukčního média (Overnight Express™ Instant LB Medium - Novagen); 30 u.1 ampicilinu (100 mg/ml) a 750 u.1 predpestované noční kultury.
2. Baňky dejte na třepačku a inkubujte přes noc při 37°C.
3. Připravte si dvě sterilní mikrozkumavky a do každé odeberte 700 u.1 narostlé kultury.
4. Centrifugujte 2 min při pokojové teplotě a při 5 OOOxg.
5. Odeberte supernatant, pelet použijte v dalších krocích.
Příprava hrubého lyzátu
1. Pelet v první mikrozkumavce rozsuspendujte ve 100 u.1 lyzačního pufru (50 mM fosfátový pufr pH 8; 0,3 M NaCI; 0,2 mg/ml lysozym; 0,1% triton).
2. Inkubujte 10 min na ledu.
3. Přidejte 10 u.1 DNAse pufru a 5 u.1 DNAsy.
4. Inkubujte 10 min při 37°C.
5. Centrifugujte 10 min při 4°C a při 20 OOOxg.
6. Odeberte supernatant a uchovejte pro další použití.
Purifikace proteinu
I. Pelet ve druhé mikrozkumavce rozsuspendujte v 700 u.1 HEPES pufru.
2. Přidejte 70 u.1 FastBreak™ Reagent/DNAse I pufru a 75 u.1 HisLink™pryskyřice.
3. Inkubujte 30 minut na třepačce při laboratorní teplotě.
4. Přeneste lyzát s pryskyřicí na kolonku. Jestliže v mikrozkumavce zůstane zbytek pryskyřice, přidejte 100 u.1 HisLink™ Binding/Wash pufru a přeneste na kolonku.
5. Centrifugujte 5 s při pokojové teplotě a při maximálních otáčkách.
6. Vylijte proteklou kapalinu, umístěte kolonku zpět do mikrozkumavky a přidejte 500 u.1 HisLink™ Binding/Wash pufru.
7. Centrifugujte 5 s při pokojové teplotě a při maximálních otáčkách.
8. Opakujte promytí 500 ulHisLink™Binding/Wash pufrem.
9. Centrifugujte 5 s při pokojové teplotě a při maximálních otáčkách.
10. Vyjměte kolonku, opatrně ji otřete, abyste zajistili odstranění zbytků HisLink™Binding/Wash pufru a vložte do nové, čisté mikrozkumavky.
II. Na kolonku naneste 200 u.1 HisLink™ Elution pufru, kolonku zavřete,dobře promíchejte a inkubujte 3 min při pokojové teplotě.
12. Centrifugujte 1 min při pokojové teplotě a při 10 OOOxg.
SDS PAGE
1. Podle uvedené tabulky připravte 12% SDS polykrylamidový gel.
Koncentrační gel (5%)		Separační gel (12%)	
30%akrylamid	850 ul	30%akrylamid	4 ml
1M Tris(pH6.8)	625 ul	1,5M Tris(pH8.8)	2,5 ml
10% amonium persulfát	50 ul	10% amonium persulfát	100 ul
10% SDS	50 ul	10% SDS	100 ul
TEMED	5 |il	TEMED	4 pil
Voda	3,4 ml	Voda	300 ul
		glycerol	3 ml
2. Mezi připravená skla nalijte nejprve separační gel, pak ihned přilijte koncentrační gel a mezi skla zasuňte hřebínek.
3. Gel nechte tuhnout 20 minut.
4. Tuhý gel umístěte do elektroforetické vany a přilijte elektroforetický pufr (25 mMTris-CI; 150mMglycin; 0.1%SDS).
5. K 15 ul hrubého lyzátu a k 15 ul purifikovaného proteinu přidejte 4 ul nanášecího pufru a naneste vzorky na gel v následujícím pořadí:
délkový marker - hrubý lyzát - purifikovaný protein
6. Spusťte elektroforézu, podmínky separace: konstantní proud 30 mA/gel, 40 minut.
7. Po elektroforéze první gel propláchněte 15 minut v MiliQ vodě a následně ponořte do 50 ml barvy koloidní coomasieBioSafe, s druhým gelem proveďte blotting.
8. Gel ponořený do koloidní coomasie po dvou hodinách vyjměte a propláchněte vodou a naskenujte.
Vyhodnocení
Jméno a UČO:
Datum:
Úloha G.
Vliv polymorfismu v genu pro alkoholdehydrogenázu na její aktivitu
TEORETICKÝ ÚVOD
Alkoholdehydrogenáza je enzym oxidující primární a sekundární alkoholy a dioly. Zřejmě nejvýznamnějším z těchto alkoholů je ethanol, jehož metabolismus je lokalizován v gastrointestinálním traktu, především v játrech (až 98 %). Zde dochází účinkem ADH ve spolupráci s koenzymem NAD+ k oxidaci ethanolu na acetaldehyd. Vznikající acetaldehyd je pak dále oxidován aldehyddehydrogenázou (ALDH) na acetát, který ve svalové tkáni vstupuje do citrátového cyklu jako acetyl-CoA a je postupně přeměněn na C02, H20 a energii v podobě 15 molekul ATP (obr. 1). Existuje několik typů ADH a ALDH enzymů, které jsou kódovány různými geny. Ukázalo se, že tyto různé varianty mohou u lidí ovlivňovat riziko vzniku závislosti na alkoholu. Přepokládá se, že mechanismus vzniku závislostí spojených s výskytem určitých forem ADH a ALDH je způsoben lokálním zvýšením obsahu acetaldehydu vyplývající buď z rychlé oxidace ethanolu, nebo pomalejší oxidace acetaldehydu.
Obr. 1: Metabolismus ethanolu
U lidí bylo identifikováno sedm různých genů pro ADH (ADH1A, ADH1B, ADH1C, ADH A, ADH 5, ADH6, ADH7) nacházejících se na chromosomu 4. Jednotlivé formy ADH byly pak na základě podobného obsahu aminokyselin a kinetických parametrů rozděleny do pěti tříd. Třída I obsahuje geny pro ADH1A, ADH1B a ADH1C, které mají hlavní podíl na oxidaci ethanolu v játrech. Do třídy II patří gen pro ADH4, který se uplatňuje při oxidaci ethanolu až při vyšších koncentracích. Gen pro ADH5 patřící do třídy III kóduje enzym zvaný formaldehydehydrogenáza a vyznačuje se velmi nízkou
CH3CH2OH + NAD+ <—> CH3CH=0 + NADH + H+
dýchací řetězec
í> 14ATP + H20
afinitou pro ethanol. mRNA ADH6 (třída IV) byla izolována z jater plodu i z jater dospělých jedinců, tento enzym však doposud nebyl z tkáně vyizolován a je o něm známo jen málo. Do poslední rodiny V patří ADH7, který se podílí na oxidaci retinolu a v menší míře také na oxidaci ethanolu.
U genů pro ADH1B a ADH1C bylo objeveno několik SNPs ovlivňujících kinetické vlastnosti těchto enzymů. Například polymorfismus nacházející se v kódující oblasti ADH1B genu, který vede k záměně aminokyseliny argininu v pozici 48 za histidin (ADH1B*48H) nebo polymorfismus v genu ADH1C vyznačující se záměnou valinu v pozici 350 za izoleucin (ADH1C*350I). Tyto substituce mají za následek produkci atypických forem enzymů s mnohonásobně zvýšenou Vmax pro oxidaci etanolu na acetaldehyd oproti formám klasickým (zvýšení až o 70%). Výsledky řady analýz ukazují, že polymorfismy ADH1B*48H a ADH1C*350I se právě vyskytují u osob s nadměrnou konzumací alkoholu. Přímá souvislost mezi polymorfismy a alkoholismem však doposud nebyla potvrzena.
Reštrikční analýza
Reštrikční endonukleasy jsou enzymy, které rozpoznávají ve dvoušroubovicové DNA specifickou sekvenci složenou obvykle ze 4 až 6 párů bazí a v tomto místě DNA specificky štěpí. Většina rozpoznávaných sekvencí restrikčními enzymy jsou tzv. palindromy. Některé reštrikční enzymy katalyzují štěpení dvou vláken DNA v polohách symetricky rozmístěných okolo středu palindromové sekvence (Hha\); vznikají tak fragmenty s kohezními či lepivými konci. Jiné reštrikční enzymy naopak štěpí řetězec přímo ve středu palindromu (Ssp\). Vznikají pak fragmenty se zarovnanými či tupými konci.
K analýze jednotlivých polymorfismů se využívá reštrikční analýza pro ADH1B s využitím restriktasy Hha\ a pro ADH1C Ssp\. Jako materiál pro analýzu slouží vzorek lidské krve, ze kterého se amplifikuje část oblasti genu obsahující daný polymorfismus a následně se provede reštrikční analýza. Pro amplifikaci části genu ADH1B je potřeba pro zanesení restrikčního místa použit mismatchový primer.
Restikční místo pro HhaV. G CG|C       Restikční místo pro SspV. AAT| ATT
C | GC G TTA | TAA
Záměna Arg/Val v genu ADH1B je výsledkem jednonukleotidové substituce G/A, přičemž pouze G podléhá štěpení Hhal. Obdobně záměna Val/lle v genu ADH1C je výsledkem téže jednonukleotidové substituce G/A, kdy štěpení Ssp\ podléhá A.
Aktivita ADH
Aktivita ADH se měří kolorimetrickou metodou využívající redukci N,N-dimethyl-4-nitrosoanilinu (NDMA) a ethanolu jako substrátu. Výrazně žlutý NDMA je v přítomnosti NADH+H+ enzymaticky redukován na bezbarvý hydroxylaminový derivát. Jde tedy o recyklaci koenzymu, který se redukuje při oxidaci ethanolu a následně se opět oxiduje při redukci NDMA. Změna zbarvení reakční směsi se pozoruje při 440 nm.
Odběr kapilární krve
Kapilární krev se používá v případech, kdy je třeba jen malé množství vzorku. Hlavní zásady při odběru:
■ prohřátím místa vpichu (bříško prstu, ušní boltec, u kojenců pata) zabezpečit dobré prokrvení (přiložit teplý vlhký obklad 3 min před vlastním odběrem)
■ místo vpichu dezinfikovat
■ vpich směřovat ze strany do bříška prstu, kde je lepší prokrvení než ve středu
■ po nabodnutí lancetou první kapku otřít (příměs tkáňového moku), další tvorbu kapek podpořit lehkým tlakem (při silném vymačkávání je v krvi příměs tkáňového moku)
■ krev se obvykle odebírá do speciálních kapilárních krevních zkumavek nebo do malých plastových či skleněných zkumavek. U proužkových testů se kapka krve aplikuje přímo.
■ po odběru přiložit na místo vpichu vatu smočenou dezinfekčním prostředkem
Zpracování krve
Krev odebraná bez použití protisrážlivých prostředků se po kratší době sráží, v důsledku přeměny rozpustného fibrinogenu na vláknitou síť fibrínu. Odstředěním (10 min., 10 OOOxg, pokojová teplota) sražené krve se získá sérum. Doba srážení musí být dostatečná (při pokojové teplotě po 15-30 min). Předčasné oddělení séra od krevních elementů však může vést k dodatečné tvorbě fibrinu a koagulaci séra.
Postup práce: Odběr vzorku krve
Odběr kapilární krve se provádí z boku špičky prstu (toto místo je nejméně citlivé na bolest)
1. Připravte si sterilní, jednorázovou autolancetu - odšroubujte sterilní čepičku a nastavte hloubku vpichu.
2. Otřete prst kapesníčkem s alkoholem a vyčkejte, dokud prst nebude úplně suchý.
3. Uchopte jednorázovou autolancetu mezi ukazováčkem, prostředníčkem a palcem. Přitiskněte autolancetu pevně z boku ke špičce prstu (toto místo je nejméně citlivé na bolest) a palcem stiskněte spoušť na doraz.
4. První malou kapku otřete a další tvorbu kapek podpořte jemným masírováním prstu směrem ke konečku.
5. Krev odeberte do sterilní mikrozkumavky. Odeberte vzorek pro PCR a zbytek krve nechte srážet 30 min.
PCR
2
1.
Smíchejte 4 ul odebrané krve se 4 ul 5 nM EDTA.
Připravte reakční směsi dle uvedené tabulky do PCR zkumavky:
Reakční směs Hhal
Reakční směs Sspl krev
Sspl F primer (10 uM) Sspl R primer (10 uM) Kapa MasterMix B DMSO
krev
2,5 jíl 1,5 ul 1,5 ul 12,5 ul 1,3 ul 5,7 |il
2,5 |il 1,5 ul 1,5 ul 12,5 |il 1,3 |il 5,7 |il
Hhal F primer (10 uM) Hhal R primer (10 uM) Kapa MasterMix B DMSO
PCR voda
PCR voda
3.   Reakční směsi jemně promíchejte, krátce stočte a vložte do termocycleru. Na termocycleru nastavte následující program:
95°C 5 min
95°C 30 s 1
55°C 30 s MOx
72°C lmin J
72°C 5 min
Reštrikční analýza
1.   Připravte reakční směsi dle uvedené tabulky do PCR zkumavky:
Reakční směs H hal PCR produkt lOx reakční pufr Enzym Hha\ PCR voda
10 ul 2ul
7ul
Reakční směs Sspl PCR produkt lOx reakční pufr Enzym Sspl PCR voda
10 ul 2ul
7ul
2. Reakční směs promíchejte, krátce stočte a inkubujte 20 min při 37°C.
3. Připravte si 1,5% agarosový gel.
4. K 10 ul reštrikční směsi a 10 ul PCR reakce přidejte 2 ul DNA nanášecího pufru a naneste vzorky na gel v následujícím pořadí:
Délkový marker - PCR produkt - RA Hnal - RA Sspl
Aktivita ADH
1. Sraženou krev centrifugujte 10 min při pokojové teplotě při 10 000 x g.
2. Opatrně odeberte sérum a přeneste do sterilní mikrozkumavky.
3. Připravte reakční směsi dle uvedené tabulky do PCR zkumavky:
Vzorek Reference Sérum 12,5 ul Sérum 12,5 ul
Reakční pufr 37,5 ul Reakční pufr 36,5 ul
Pyrazol (0,5 M) 1 ul
4. Reakční směs promíchejte, krátce stočte a inkubujte 20 min při 25°C. Reakci ve vzorku bez pyrazolu zastavte přídavkem 5 ul 0,5 M pyrazolu.
5. Změřte rozdíl absorbance při 440 nm.
Vyhodnocení
Na základě výsledku reštrikční analýzy určete, zda váš vzorek krve obsahoval některý z polymorfismů v genu pro ADH -    Vypočtěte aktivitu ADH (£440 N DMA = 34 . 103 M_1.cm_1)