Pokročilé praktikum z Biochemie cerne a jeste tlustsi logo labiny.tif 1f d370f01 em_tmv Patogen Hostitelská rostlina Elicitory – látky, které jsou schopné vyvolat obranou reakci u rostlin • uvolňované patogenem do prostředí • součást patogenu • glykoproteiny, chitinové fragmenty, proteiny, nízkomolekulární látky, anorganické látky, atd. Patogen obvykle nese gen avirulence (avr), jehož produkt (elicitor) je rostlinou rozpoznáván pomocí genu rezistence (R). Avr Avr R R cerne a jeste tlustsi logo labiny.tif salicylic%20acid-b A representation of the 3D structure of myoglobin, showing coloured alpha helices. This protein was the first to have its structure solved by X-ray crystallography by Max Perutz and Sir John Cowdery Kendrew in 1958, which led to their receiving a Nobel Prize in Chemistry. NADPH NADP+ O2 O2- . Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ H+ H+ H+ Ca2+ Ca2+ Cl- K+ P Ca2+ dna P gsta1 salicylic%20acid-b Ranná fáze obranné reakce řádově minuty od přidání elicitoru Pozdní fáze obranné reakce řádově hodiny od přidání elicitoru PKC CaMDPK MAPK cerne a jeste tlustsi logo labiny.tif Obranné proteiny * Skupina PR (pathogenesis related) proteinů * Syntetizovány ve velké míře při napadení nebo poškození rostliny * Dle funkce a účinku se dělí do tříd, v každé třídě se vyskytují dvě isoformy – kyselá a bazická * Kyselé isoformy jsou vylučovány do extracelulárního prostředí, bazické poté do vakuoly * Exprese kyselých forem bývá často spojena s tzv. systémově navozenou rezistencí (SAR) cerne a jeste tlustsi logo labiny.tif Rozdělení PR (pathogenesis related) proteinů van Loon L. C., Rep M., Pieterse C. M. J.(2006): Significance of Inducible Defense-related Proteins in Infected Plants. Annu. Rev. Phytopathol. 44, 135-162. Třída Typický zástupce Funkce PR-1 PR-1 (tabák) neznámá PR-2 PR-2 (tabák) β-1,3-glukanasa PR-3 P, Q (tabák) chitinasa PR-4 `R' (tabák) chitinasa PR-5 S (tabák) podobný thaumatinu PR-6 Inhibitor I (rajče) proteinasový-inhibitor PR-7 P69 (rajče) endoproteinasa PR-8 Chitinasa (okurka) chitinasa PR-9 `lignin-forming peroxidase' (tabák) peroxidasa PR-10 `PR1` (petržel) podobný ribonuklease PR-11 chitinasa třídy V (tabák) chitinasa PR-12 Rs-AFP3 (ředkvička) defensin PR-13 THI2.1 (Arabidopsis) thionin PR-14 PR-15 PR-16 LTP4 (ječmen) OxOa (ječmen) OxOLP (ječmen) lipid-transfer protein oxalát oxidasa podobný oxalát oxidase PR-17 PRp27 (tabák) neznámá cerne a jeste tlustsi logo labiny.tif Obranné proteiny * Skupina PR (pathogenesis related) proteinů * Enzymy účastnící se syntézy signálních molekul, fytoalexinů, tvorby H2O2, atd. * fenylalaninamoniak lyasa * lipooxygenasa * ACC syntasa * 5-epiaristolochene syntasa * NADPH oxidasa * 3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA syntasa cerne a jeste tlustsi logo labiny.tif Kys.linolenová 13-hydroxyperoxid 12-oxophytodienová kys. Kys. jasmonová MFCD00171441 lipooxygenasa alen oxidasa syntasa alen oxidasa cyklasa OPDA reduktasa 3x b-oxidace Fenylalanin trans-skořicová k. kys. benzoová kys. salicylová SA-glukosid MFCD00002439 PAL BA-2-hydroxylasa Signální molekuly cerne a jeste tlustsi logo labiny.tif HR, nekróza, Oxidativní vzpl. Patogen Lokální odpovědi Proteinkinasa C SIPK WIPK Ca2+ PLC NADPH ox. fenylalanin k. skořicová SA Součásti buněčné stěny Phytoalexiny Fenolické l. Kyselé PR proteiny Obranné reakce Fragmenty buň. stěn Napadení, Herbivorní hmyz Proteinkinasy WIPK Ca2+ NADPH ox. Sek. metabolity Proteinásové Inhibitory Bazické PR proteiny Exprese genů PLA2 Systémový transport JA linolenová kyselina OPDA Mechanické poškození Saliva: cellulase - - Exprese genů cerne a jeste tlustsi logo labiny.tif Cryptogein * proteinový elicitor patřící do skupiny elicitinů vylučovaný houbou Phytophtora cryptogea vyvolávající velmi silnou obrannou reakci u rostlin tabáku vedoucí k nekróze * obsahuje hydrofobní kavitu, do které se mohou vázat steroly a mastné kyseliny, proto je řazen mezi lipid transfer proteiny (LTP) cerne a jeste tlustsi logo labiny.tif O2 O2- NAD(P)H 2H+ ATP ADP+Pi H+ H+ K+ Cl- K+ Cl- Syntéza obranných proteinů (PR1a, PR1b, PR3a) Aktivace enzymů (NADPH oxidasa, LOX, STR, PAL) Ca+ Ca+ dna . cerne a jeste tlustsi logo labiny.tif Identifikaci jednotlivých druhů václavek v Evropě bylo popsáno sedm druhů václavek: A. borealis, A. cepistipes, A. ectypa, A. gallica, A. mellea, A. ostoyae and A. tabescens Hlavní ekologická funkce: Dekompozice dřevní hmoty, ale velmi častý přechod k nekrotrofnímu parazitismu druhy hodnocené jako slabí parazité A. borealis, A. ectypa, A. gallica and A. tabescens druhy hodnocené jako vážní parazité na stresovaných dřevinách A. mellea, A. ostoyae and A. cepistipes Identifikace jednotlivých druhů václavek Párové testy Založeny na kompatibilitě neznámého izolátu s testovacím druhem Časově náročné, v případě diploidních vzorků jsou výsledky často špatně interpretovatelné Metody založené na analýze sekvence DNA * RAPDs (random amplified polymorphic DNAs) * RFLPs (restriction fragment length polymorphisms ) – IGS a ITS oblasti * sekvenace specifických oblastí > Nutnost čistého mycelia václavky nebo plodnic > ITS2 5.8S rDNA Malá jaderná rDNA Velká jaderná rDNA Umístění ITS oblasti a primerů ITS1, ITS4 ITS1 ITS4 ITS1 Identifikace jednotlivých druhů václavek na základě RFLP analýzy ITS oblasti A. borealis TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTATTGAAACTTGAA-TCGTAGCATTG-AGAACTGTTGCTGACCTGTTAAAGGGTATGTGCACGTTCGACGT G A. ostoyae TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTATTGAAACTTGAA-TCGTAGCATTG-AGAGCTGTTGCTGACCTGTTAAAGGGTATGTGCACGTTCGACGT G A. gallica TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTATTGAAACTTGAAATCGTAGCATCG-AGAACTGTTGCTGACCTGTTAAAGGGTATGTGCACGTTCGACGT G A. cepistipes TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTATTGAAACTTGAA-TCGTAGCATTG-AGAACTGTTGCTGACCTGTTAAAGGGTATGTGCACGTTCGACGT G A. tabescens TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACTGAAACTTGAA-TCGTAGCATGGCAGAACTGTTGCTGACCTGTTAAAGGGTATGTGCACGTTTGAAGT G A. mellea TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAATGAAACTTGAATTTGTAGCATTG-AGAACTGTTGCTGACCTGTTAAAGGGTATGTGCACGTTCAAAGT G ****************************** *********** * ******* * *** ********************************** * *** A. borealis TTGCG--TTCTATTC--ATCCACCTGTGCACCTTTGTAGACTTGATTAACTTTCGCTCTCGAG--CGGTTAGAAGGGTTGCTTTC---------GAGCT C A. ostoyae TTGCG--TTCTATTC--ATCCACCTGTGCACCTTTGTAGACTTGGTTAACTTTCGCTCTCGAG--CGGTTAGAAGGGTTGCTTTC---------GAGCT C A. gallica TTGCG--TTCTATTC--ATCCACCTGTGCACCTTTGTAGACTTGATTAACTTTCGCTCTCGAG--CGGTTAGAAGGGTTGCTTTC---------GAGCT C A. cepistipes TTGCG--TTCTATTC--ATCCACCTGTGCACCTTTGTAGACTTGATTAACTTTCGCTTTCGAG--CGGTTAGAAGGGCTGCTTTC---------GAGCT C A. tabescens TTGCG--TTTTATTC--ATCCACCTGTGCACCTTTGTAGACTTGGTTAACTTTCGCTCCAAGGGCTGGATAGAAGGGTTGCTTTC---------GAGCT C A. mellea TTACGGGTTCTGTTCTAATCCACCTGTGCACCTTTGTAGACTTGGTTAAGCTTCGCTTTCGAG--CGGTTTGAAGGGTTGCTTGCTTTCGAGCTAAGCT C ** ** ** * *** ********************************* ****** * ** * ****** ***** * ***** A. borealis CCTTTGTCT-ATCAAGTCTATGTCTATATAATCTCTTGTATGTCTAGAATGTCTTGTTTATGGGACGCAAGTC-TTTAAATCTTATACAACTTTCAACA A A. ostoyae CCTTTGTCT-ATCAAGTCTATGTTTATATAATCTCTTGTATGTCTAGAATGTCTTGTTTATGGGACGCAAGTCCTTTAAATCTTATACAACTTTCAACA A A. gallica CCTTTGTCT-ATCAAGTCTATGTCTATATAATCTCTTGTATGTCTAGAATGTCTTGTTTATGGGACGCAAGTCCTTTAAATCTTATACAACTTTCAACA A A. cepistipes CCTTTGTCT-ATCAAGTCTATGTCTATATAATCTCTTGTATGTCTAGAATGTCTTGTTTATGGGACGCAAGTC-TTTAAATCTTATACAACTTTCAACA A A. tabescens CCTTTGTCTTACCAAGTCTATGTCTATATAATCTCTTGTATGTCTAGAATGTCTTGTTTATAGGACGCAAGTCCTTTAAATCTTATACAACTTTCAACA A A. mellea CGTTTGTCTTACCGAGTCTATGTCTATATAAACTTTTGTATGTTTAGAATGTCTTGTTTATAGGACGCAAGTC-TTTAAATGTTATACAACTTTCAACA A ********* ************* ********** ******** ***************** *********** ******* ****************** AR1 Sekvenční homologie ITS1 oblasti Primer Sekvence (5‘ 3‘) Délka Amplikon (bp) Tm (°C)b AR1 CTGACCTGTTAAAGGGTATGTGC 23 b 690-724 59.94 AR2 AAGCTGAATCCTTCTACAAAGTCAA 25 b 59.85 bTm byla vypočtena programem Primer 3 AR1 ITS2 5.8S rDNA ITS1 AR2 ITS oblast > Lochman, J., Serý, O. and Mikes, V. (2004) The rapid identification of European Armillaria species from soil samples by nested PCR. FEMS Mcrobiology Letters 237, 105-110. Identifikace václavek se vzorků půdy * Izolace DNA z 0.5g půdy pomocí kitu (Mobio) A260/280= 1.8 * Nested PCR reakce s vnějšími primery ITS1, ITS4 a vnitřními primery AR1, AR2 1 krok 2 krok Délky amplikonů a restrikčních fragmentů Izolát Délka amplikonu (bp)d ITS/AR Restrikční fragmentye HinfI (bp) A. borealis A1a 868/711 293, 172, 56, 31, 75, 68 A. cepistipes 204b 868/711 293, 227, 43, 132 A. gallica 147 b 868/711 294, 227, 43, 63, 69 A. mellea 184 b 882/724 148, 159, 401 A. ostoyae C2 a 870/713 294, 228, 31, 75, 69 A. tabescens T3 a 847/690 295, 125, 93, 32, 129