Vliv pH a teploty na spektrální vlastnosti fluoroforů
V tomto experimentu je ukázán vliv pH na fluorescenci a absorpci fluorescenční značky
fluoresceinu rozpuštěné ve stejné koncentraci v roztocích o různém pH. Je rovněž
demonstrován vliv teploty na intenzitu fluorescence.
Materiál
 Fluorescein - NIST-traceable standard - 50 µM (Molecular Probes, Invitrogen)
 Spektrofluorometr vybavený kryostatem (chlazenou vodní lázní)
 Pufr 5 (20 mM MES, pH 5.0)
 Pufr 7 (50 mM fosfát sodný, pH 7.0)
 Pufr 9 (50 mM glycin, pH 9.0)
 Kyveta
Postup
1. Připravte vzorky fluoresceinu 10 000x naředěním roztoku NIST standardu jeho
přidáním 1,5 µL do 1499 µL roztoku pufru 5, pufru 7 a pufru 9 a následným
dalším naředěním (150 µL 1000x zřeď. roztoku do 1350 µL příslušného pufru).
2. Změřte excitační spektra vzorků při λ(em) = 515 nm
Pozn. Začněte měřením fluoresceinu v pufru 9, pak v pufru 7 a nakonec změřte
při stejných nastaveních fluorescein v pufru 5.
3. Změřte emisní spektra vzorků při λ(ex) = 488 nm
4. Znovu změřte emisní a excitační spektrum fluoresceinu v pufru 9 při 20°C,
zahřejte vzorek vodní lázní na 40°C a znovu změřte spektra.
Obr. 1: Vliv pH na excitační a emisní spektrum fluoresceinu.
Výsledky
Při změně pufru z pH 7 na pH 5 a při zvýšení teploty dochází ke snížení intenzity
fluorescence fluoresceinu.