Úloha 4 3.12.2014 Rozlišení mutantů X Při prvním experimentu v biotechnologické laboratoři BTP (Biotechnology for purification) dostáváte za úkol rozlišit dvě mutantní varianty X1 a X2 proteinu, který se používá k rozkladu nebezpečných látek v pitné vodě. Omylem došlo k záměně štítků na reakčních rezervoárech s enzymy. Jste informováni o tom, že oba typy enzymu obsahují jeden tryptofan. Víte, že mutant X1 má tryptofan umístěn výrazně blíže k povrchu a je tedy více v kontaktu s okolním roztokem, než je tomu v případě druhé varianty proteinu X2. Rozlišení obou enzymů je životně důležité pro obnovení dodávek pitné vody obyvatelům v oblasti sužované suchem. Při řešení tohoto problému jste využili své znalosti o zhášení fluorescence. Víte, že ze závislosti intenzity fluorescence na koncentraci zhášedla se dá určit, u kterého z proteinů je tryptofan blíž povrchu a takto proteiny identifikovat. Pro zhášení fluoroforu platí základní Stern-Volmerova rovnice: kde F0 je intenzita fluorescence bez přítomnosti zhášedla, F je intenzita fluorescence za přítomnosti zhášedla, KSV je Stern-Volmerova konstanta a [Q] je koncentrace zhášedla. Provedli jste měření intenzity fluorescence proteinů odebraných z rezervoárů A a B. Intenzita fluorescence byla změřena bez přítomnosti zhášedla. Následně jste provedli s každým proteinem měření závislosti fluorescence na postupně vzrůstající koncentrací zhášedla - akrylamidu. Naměřené absolutní hodnoty intenzity fluorescence jsou v tabulce níže. Sestavte Stern-Volmerův graf pro závislost relativního úbytku fluorescence na koncentraci akrylamidu. Určete směrnici závislosti a odpovězte na následující otázky. 1. Je akrylamid zhášedlem dynamickým nebo statickým? 2. Jaké jsou konstanty KSV příslušné jednotlivým mutantním variantám enzymu? 3. Ve kterém z rezervoárů je enzym X1? Stručné odpovědi mi společně s grafem zašlete emailem. Správná dílčí odpověď = 0.5 bodu. Pozn. K určení směrnice a tedy hodnoty Ksv použijte lineární regresi podle video-návodu zde. ][10 QK F F SV X1 X2 rezervoár Koncentrace akrylamidu [M] 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 1 Balázs, Beáta A 944 911 891 870 853 834 B 944 794 697 621 560 510 2 Duranová, Tereza A 977 943 922 901 883 864 B 977 822 722 643 580 528 3 Jůzová, Kateřina A 940 908 887 867 850 831 B 940 791 694 619 558 508 4 Kaštovský, Jakub A 951 918 898 877 860 841 B 951 800 703 626 565 514 5 Korenčiaková, Zuzana A 960 927 907 886 868 849 B 960 808 709 632 570 519 6 Linhartová, Kateřina A 986 952 931 910 891 872 B 986 830 729 649 585 533 7 Murgašová, Katarína A 938 906 886 865 848 829 B 938 790 693 617 557 507 8 Pavelka, Vít A 957 924 903 882 865 846 B 957 805 707 630 568 517 9 Rathouzská, Šárka A 986 952 931 910 891 872 B 986 830 729 649 585 533 10 Stojaspal, Martin A 975 942 921 899 881 862 B 975 821 720 642 579 527 11 Vondrová, Lucie A 981 947 926 905 886 867 B 981 825 724 646 582 530 12 Weisová, Veronika A 957 924 903 882 865 846 B 957 805 707 630 568 517 13 Zigová, Hana A 961 928 908 887 869 850 B 961 809 710 633 571 520