v = [i. E v - rychlost iontu v elektickém poli E - intenzita elektrického pole /u - elektroforetická pohyblivost v = [i . E v - rychlost iontu v elektickém poli E - intenzita elektrického pole /u - elektroforetická pohyblivost + FE - elektrická síla FE=QxE Q - náboj iontu E - intenzita elektrického pole FF - frikční síla FF = -67ir|ľv rj - viskozita roztoku r - poloměr iontu v - rychlost iontu Během elfo se vytvoří ustálený stav, ustálí se rychlost iontu. Platí: FE = FF při určité rychlosti 1 Q x E = 67rr|rv V = jLl x E H = Q/67iTir Elektroforetická pohyblivost - vztažena vždy na prostředí, ve kterém se látka pohybuje -jednotky rr^V^s-1 - hodnota pro většinu iontů ~ 10"8 - výjimky: H+ 362,5 x 10"9 m^s"1 OH- 205,5 x ÍO-^V-V1 Iontové pohyblivosti a pKa vybraných látek (25 °C) Iontová pohyblivost jll . 10-9 (m^V-i.s-1) Na+ 51,9 - P - Alanin (+1) 36,7 3,552 Histidin (+1) 29,6 6,04 Tris 29,5 8,076 ci- -79,1 - kyselina octová -42,4 4,819 Kyselina propionová -39,1 4,874 Kyselina kapronová -30,2 4,857 - znaménko určuje směr pohybu iontu pohyblivost kationtů - kladné znaménko pohyblivost aniontů - záporné znaménko Získání údajů o pohyblivosti 1. literární prameny publikované obsáhlé tabulky Hirokawa T. ondali. J. Chromatog. 271, Dl (1983) přepočet z dostupnějších limitních iontových vodivostí Ámol F X - molární iontová vodivost F - Faradayova konstanta ( 96487 C mol-1) z - počet elementárních nábojů nesených iontem 2. Empirické rovnice Joklova: M = (\z r^r~ ~ 9 >6 )• 10 M - relativní iontová hmotnost možnost korelací - u podobných iontů dosadit do rovnice a zjistit číselné konstanty problém - u malých iontů (hlavně kovových) zůstává část hydratačního obalu, jehož velikost se těžko odhaduje Příklad použití Joklovy rovnice Stanovení mobility kyseliny octové Bez korelace: \M |= ( 485 V60 ,05 - 9 ,6 ). 10 - 9 Kyselina octová Mr = 60,05 M = -42,4 . 10"9m2/Vs H= -52,9 . 10-9 Korelace: 37 ,1 = ( X = 401,94 X ^Jl\ ,08 - 9 ,6 ). 10 " 9 Kyselina propionová Mr = 74,08 M = -37,1 . 10-9 m2/Vs , |= ( 401 ,94 _ 9 6) 10 -9 1 1 V60 >05 M= -42,3. 10-9 Skutečná pohyblivost - vliv vnějšího prostředí vliv iontové síly - Onsagerova rovnice 0 -(0,23 //°zzD + 31,3.10~9 z)^7^ R 1+ // ljul - iontová pohyblivost /jU°/ -lim itní iontová pohyblivost lzR I - náboj protiontu I - iontová síla Vliv teploty H(T) = n(T0)[l + a(T-T0)] a * 0,02 zvýšením teploty o 10 °C se zvýší pohyblivost přibližně o 20% Efektivní pohyblivost vliv chemických rovnováh na pohyblivost iontů Tiselius: Látka, přítomná v roztoku ve více formách, které jsou navzájem v rychlé dynamické rovnováze, migruje elektrickým polem jako jediná látka o určité efektivní pohyblivosti ju : l Xj - molární zlomky jednotlivých forem látky jU. - iontové pohyblivosti jednotlivých forem látky Princip metody Zónová elektroforéza MIM Izotachoforéza 4++++ Vlastnosti izotachoforetických zón 1. Samozaostmjící efekt L Intenzita el. pole Teplota T Pohyblivost Měrná vodivost Koncentrace protiiontu 2. Koncentrace v izotachoforetických zónách c = c X L X JU + JU R JU + X R M L Při analýzách s neměnnou koncentrací vedoucího elektrolytu je koncentrace látek v zónách konstantní - lze využít délku zóny pro kvantitativní vyhodnocení - koncentrace látek v původním vzorku nemá žádný vliv na výslednou koncentraci látky v adjustované izotachoforetické zóně Diskontinuální elektroforéza Tris/HCl pH 6,8 Tris/HCl pH 8,8 Tris/gly pH8,8 Tris/HCl pH 6,8 Tris/gly pH8,8 Diskontinuální elektroforéza Tris/gly pH8,8 Gly Cl" pH = 6,8 pH = 8,8 Diskontinuální elektroforéza Tris/gly pH8,8 Tris/gly pH8,8 Diskontinuální elektroforéza Tris/gly pH8,8 Tris/gly pH8,8 Historie 1897 - Kohlrausch - teoretické základy metody 1923 - Kendall - první pokusy separace látek na izotachoforetickém principu 1953 - Longsworth - demonstrována možnost užití izotachoforézy jako analytické kapilární separační metody 1963 - Konštantínov a Ošurkovová - separace kationtů kovů v tenkostenné skleněné kapiláře 1967 - popis prvního izotachoforeografu 1970 - začal se používat název izotachoforéza Komerční přístroje 1974 - Tachophor 2127 LKB, Bromma, Švédsko 1975 - IP-1B (následovaly IP-2A a IP-3A), Shimadzu, Kyoto, Japonsko 1983 - CS Isotachophoretic Analyser, Villa LABECO, Spišská Nová Ves, Slovensko Další výrobci: ITABA, Švédsko (Tachophor Delta) JZD Odra Krmelín (Agrofor) Villa LABECO, Spišská nová ves, Slovensko Detektory Vodivostní Rozsah 30 kQ - 20 M Q Detekční limit 1 x 10"10M Fotometrický 254, 289 nm (405) detekční limit 5 x 10"12 M (kyselina pikrová) Předseparační kolony Délka 90 a 160 mm Průměr 0.8 mm Separační kolony Délka 90 a 160 mm Průměr 0.3 mm Dávkování vzorku mikrostříkačkou nebo dávkovacím kohoutem (30jal) Možnost práce v roztocích s metanolem (do 30%) Maximální napětí 15 KV Maximální proud 500 jjA Promytí systému vodícím ellytem Promytí nanášecího ventilu a prostoru pro koncový ellyt Nanesení vzorku Volba elektrodového systému ■ rozpustnost (vyšší mastné kyseliny-často nutno používat směsná rozpouštědla jako voda- metanol) ■ chemická stabilita (oxidace ěi redukce v elektrolytu, srážení iontů z roztoku např Pb2+ ěi Ag+ x Cl- ■ionizace analyzovaných látek (velmi důležité kriterium pro všechny elektromigraění metody) V případě slabých kyselin a bází je stupeň jejich ionizace závislý na pH prostředí (v ITP na pH dané zóny) Ostwaldův zřeďovací zákon: Jednosytná slabá kyselina (HA) Disociační konstanta je rovna: C C y — h+ a' ha ~ — lha Disociační stupeň pak: a — a- _ K HA Pro efektivní pohyblivost platí: A a A K M ni K „A + c + HA H + HA H+ +A- KHA + CH + Slabá kyselina je disociována z 50% při pH=pKHA, tedy: a A A 0,5 JLl A a A Pro ph>pKHA-\ 0.1 ^A »A K = 0,1 ha je disociace větší než 10% což už je podmínka pro migraci analyticky využitelnou k ha + ch + Analogická situace je u slabých bazí: _ c 0.1 cH+ = 0.9 KHA -1 - pH = -0.045 - pK, HA Mfí=Mf H+ B K + c BH H+ PHpKHA-l Kationty Vedoucí elektrolyt: 5-50 mMKOH + protiion protiion pH Koncový elektrolyt Kyselina octová 4,2 -5,2 GABA Kyselina propionová 4,4 - 5,4 Kreatinin MES 5,7-6,7 Histidin, imidazol veronal 6,9 - 7,9 Imidazol, triethylendiamin asparagin 8,3 - 9,3 Triethanolamin, Tris glycin 9,1-10,1 Triethanolamin, NH3 (3 -alanin 9,8 -10,8 NH3, ethanolamin Anionty Vedoucí elektrolyt: 2-20 mM HC1 + protiion + aditivum (0,05 - 0,2% polyvinylalkohol, 0,05 - 0,5% hydroxyetyl celulóza, 0,05 - 0,5% Triton X-100) protiion pH Koncový elektrolyt P - Alanin 3,1-4,1 Kyselina glutamová Kyselina propionová Kyselina kapronová EACA 4,1-5,1 Kyselina glutamová Kyselina propionová Kyselina pivalová Kreatinin 4,5 - 5,5 Kyselina pivalová MES Histidin 5,5-6,5 MES, HEPES Imidazol 6,6 - 7,6 MES, veronal Tris 7,6 - 8,6 Glycin + Ba(OH)2 Asparagin + Ba(OH)2 Ammediol 8,3 - 9,3 Glycin + Ba(OH)2 EACA + Ba(OH)2 ethanolamin 9,0-10,0 EACA + Ba(OH)2 Jevy provázející separaci Elektroosmotický tok v = s š E V f Sternova vrstva \ ^pohybové rozhraní X 8 - permitivita roztoku r| - viskozita roztoku \ - elektrokinetický potenciál ( zeta potenciál) e č E v =--- 77 možnosti řešení: zvýšení viskozity roztoku přídavkem 0,05 - 0,3 % derivátu celulosy (hydroxy propyl-, hydroxy ethyl-, hydroxypropylmethyl-) do vedoucího elektrolytu obrácení znaménka elektrokinetického potenciálu přídavkem kationogenního smáčedla (např. 1mM cetyltrimethylamonium bromid) do vedoucího elektrolytu snížení elektrokinetického potenciálu přídavkem 0,05 - 0,2% neionogenních smáčedel (Triton X-100, polyetylenglykol, polyvinylalkohol) do vedoucího elektrolytu Jouleovo teplo - elektrický ohřev je hlavním limitujícím faktorem velikosti hnacího proudu -výraznejšou ovlivňovány iontové pohyblivosti separovaných látek -vznikají teplotní gradienty a tedy další nehomogenity -ohřev ovlivňuje disociaci slabých kyselin a zásad -může docházet k destrukci termolabilních látek Největší problém u krátkých zón, které předcházející zóna ovlivňuje příklad: vodící ion 5mMNaBr terminál jodičnan 50 juA je třeba 10 mm, aby teplota v zóně dosáhla ustálené hodnoty Kapiláry: FEP - kopolymer perfluorovaného polyetylénu a polypropylénu PTFE - Feflon (polytetrafluoroetylen) - nevhodný kruhový průřez, špatná tepelnou vodivost - dobrá chemická a mechanická odolnost, malý elektroosmotický tok a snadno se vyrábějí r Účinnost termostatovém: T = T0 + q E T- střední teplota zóny T0 - termostatovací teplota Kvocient q s e stanovuje experimentálně tak, že při různých termostatov acích teplotách měříme proud protékající kapilárou (např. 1 mol/l KCl) v závislosti na vloženém napětí. Ideálně q = O Tachofor (0,8 mm) q = 1,36KmW'1 Gravitace Rozdílná hustota ITP zón vede k deformaci rozhraní možnosti řešení: - separace v inertních nosičích a gelech - hustotní gradient neionogenní látky - podmínky nulové gravitace - stabilizace zón gravitací tenké kapiláry ování kolon VillaLABECO: Předseparační kolona Délka 90 a 160 mm Průměr 0.8 mm Separační kolona Délka 90 a 160 mm Průměr 0.3 mm Koncentrační kaskáda první část kapiláry naplněna koncentrovaným roztokem vedoucího elektrolytu (vyšší separační kapacita x nižší citlivost [kratší zóna]) druhá část kapiláry naplněna vedoucím elektrolytem o nižší koncentraci Izotachoforesa s protiproudem vedoucího elektrolytu původní rychlost vEL se snižuje o rychlost toku protiproudu vH na rychlost v metoda zvyšuje migrační dráhu zón (separační kapacitu) migrační rychlost můžeme snížit max. o 30% (jinak dochází k narušení ostrosti zónových rozhraní) Technika kontinuálního dávkování protiproud nastaven tak, aby vykompenzoval elektromigrační pohyb zón metoda slouží k zakoncentrování velkých objemů naředěných vzorků vlastní separace pak probíhá bez protiproudu DETERMINATION Of ORGANIC ACIDS in SILAGE MAIN FEATURES : Aliphatic organic acids are usually the major fermentation products present in silage, therefore their content is a main criterion of quality of the silage. Isolde fluoric re sis is a suitable method (or their determination because in 10 - f 5 minutes it is possible to analyse the main components (formic, acetic, lactic, propionic, butyric acid, P04 or other interesting components]. Reproducibility of the method is approximately 2% and pre-treatmem of the sample is very simple (dilution}. A similar result can be obtained in the analysis of rumen liquids. tsolachophoreogram of silage extract A - record from preparation column / I, - 250 jiA I B - record from analytical column / L - 50 uA / X - unidentified zones, NR - impurities from solution Determined concentration / % I: formic • 0,07; PO^ - 0,20; laclic -2,10; acetic -0.69. propionic -0,06; butyric -0.19 Operational conditions: leading electrolyte ; 10"2 m HCl * 2.2.1Q-2 M c-aminocaptoic acid + 0,1°A melhylhydtoxyethylcellulose/MHEC; terminating electrolyte: 5.10"3 Mtaproicacid Sample : 100 g of silage extracted in 900 ml of water /16 hour /, diluted 1: 250 V = 30pi DETERMINATION of NITRATES and NITRITES in VEGETABLES MAIN FEATURES : Isotachophoresis is a very simple and reliable method (or determination of nitrates and nitrites in vegetables. Only a very simple sample pre-treatment is needed : homogenizalion and extraction in water. Ptactically no interference of constituents can disturb the analysis. The resilts were compared with more tedious specttometric methods. To achieve lower detection limits, the leading electrolyte, with a lower concentration of leading ion, was used in analytical column. OXALIC B / NO, OXALIC NO, NO, 10,6 10 CI 5j5 mln Isotachophoreogram of radish extract (10 g in 100 ml water) Determined concentrations : 2100mgNaNO3 and 3.7 mg NaN02 in 1 kg of the sample A - preseparation column B - analytical column Operational conditions: leading electrolyte preseparation column : 8x10'3 M CI" -H.5xlO-3M Ba2f * (J-alanine ♦ 0.1% HEC ; pH = 4.0 analytical column : 1x10'3 U CV + 1x10'3 M Bas* + p-alanine ; pH=4.0 terminating electrolyte: 10"3 M oxalic acid (citric acid) ♦ TRIS V = 30ul; I, =200uA;l2 = 15uA DETERMINATION of GLUTAMATE in FOOD MAIN FEATURES : Today the glutamate is the most widely used food additive (or taste intensification, mainly in soups and sauces. Only extraction of the sample with water and simple filtration are needed in a pre-treatment step. High speed and precision and no interferences are typical features of this determination. UP allows the simultaneous determination of other anion substances such as 5-monophosphate, oitrate, inosine 5-monophosphate, etc. Isotachophoreograms of glutamate determination in soup (A) and sauce (B). Operational conditions: leading electrolyte: ICr2 M CI" + 2.10"2M histidine + 0.1 % methylhydroxyethylcellulose / MHEC /; pH = 6.0 terminating electrolyte : 5.10"3 M morpholinethanesulfonic acid V = 30pJ ANALYSIS of DRINKING and SURFACE WATER MAIN FEATURES : Isotachophoresis was applied to identify and quantify simultaneously the most frequently determined macrocumponents ( Ci", SO,,2", N03") and microeomponents ( N02", F", POf ) in water. It is possible to determine another ionogenic components. Precision and accuracy of results are better than classical methods. C1T 1 rr— so, 31 min 20 41 Isotachophoreograms of Danube water / Siirsky Kanal/. A - record of macrocomponents in preseparation column /1, ■ 250 nAI B - record of mocrocomponents in analytical column /12 = 7.5 I Determined concentrations / in mg/1 /: CI -41,9; N03-3e,7; S04-93,7 NOj-0.89; F-0,16; PO4-1,01 10 Conditions : leading electrolyte : preseparation column : 3.1Q'3 M CI + 3.1 IT3 M 6ISTRIS propane + 1.5.10"3 M p-alanine ♦ 0,1 % hydroxyetnylcellulose / HEC /, pH = 3,68 analytical column : 2.10'3 M CI + 1.5.1Q-3 M p-alanine * 0,1 % HEC, pH = 3.54 terminating electrolyte 5.10'3 M citric acid V = 30uf DETERMINATION of ALKALINE METALS and ALKALINE EARTH METALS ,--TBA Fig. 1. Isotachoprweograms of analysis from analytical column: A - model mixture 1 concentration cca 5.10"5 maul; B - analysis of d/inking water diluted 1:4/ determined concentration in mg/l: K - 4.5; Na = 8; Ca = 67; Mg = 15 / Conditions : leading electrolyte : 10J M NH4* ♦ acetic acid. pH=5: dissolution : H20 : PEG 55 : 45 ftolj ♦ 0.2% HEC terminating elecirolvle ; 3,10-J M TBACIO,, dissolution: H;0, «)sp. /B/3,10'3 M TEACIO,, dissolution : Hp I, =250pA, l2 ■ 50 pA, V = 30 ^1 ,--TEA TEA Fig. 2. Isotachophoreogramol urine analysis : A - oreseoaration column: evaluated macrocomponents DETERMINATION of THIODIACETIC ACID in URINE MAIN FEATURES : Thiodiacetic acid is one of the metabolites of carcinogenic vynil chloride. A direct correlation has been established between the amount of thiodiacetic acid in urine and the exposure of the organism. At present, mostly GS -method is used for this purpose. But this method is laborious and time-consuming because extraction and derivation steps are needed. ACETIC -I- -.....' ■ ■ ■_ 29,5 ■'■ 29 22 20 Isotachophoreograms of urine from person exposed to vinyl chloride: A - record from preparation column / L = 200 uA / B - record from analytical column (only part between arrows was analysed, l2 = 50 uA) Determined concentration: 9,2 .10s mow (0,46 nmol) Operational conditions: leading electrolyte: Preparation column : 10'2 M CI + p-alanine + 0,2 % hydroxypropylcellulose/HPC/, pH=3,4 Analytical column : 10'2 M CI + p-alanine + 0,2 % HPC, pH=4.3 terminating electrolyte: 5.10'2 m acetic acid V = 5uJ (urine) Elektrokinetický potenciál Elektrická dvojvrstva na rozhraní s tuhou fází může vzniknout různými mechanismy: adsorpcí iontů z roztoku (zvláště pokud jde o iont, který je sám součástí mřížky), ionizací povrchových skupin, substitucí za iont podobné velikosti ale jiné valence, rozštěpením krystalu. Kolem tuhé fáze se shromáždí ionty opačného náboje. Nejblíže povrchu je Sternova vrstva, složená výhradně z opačně nabitých iontů, vázaných elektrostatickými i adsorpčními silami. Pro úplnou neutralizaci povrchového náboje se protionty shromažďují i v difúzni vrstvě, kde jsou udržovány výhradně elektrostatickými silami. Elektrický potenciál mezi povrchem a objemovou fází klesá lineárně ve Sternově vrstvě a nelineárně (limitně k nule) v difúzni vrstvě. Průběh potenciálu v difúzni vrstvě popisuje Gouyho-Chapmanova teorie E = Eq exp(x//) J/2 eTs0kBT e21000^4 £r£pkBT e 2 2000^4 A/2 -1/2 / je efektivní tloušťka dvojvrstvy. E0 potenciál Sternovy vrstvy, e = 1,602-1019 J je elementární náboj, zi náboj příslušného iontu, ci jeho (molární) koncentrace, kB = 1,38-10-23 J/K Boltzmannova konstanta, NA = 6,023-1023 Avogadrova konstanta, s0 = 8,854-10 12 permitivita vakua, sr relativní permitivita (pro vodu a zředěné vodné roztoky při 25°C sT = 78,5). S rostoucí koncentrací elektrolytu se difúzni vrstva stlačuje až do vymizení (Sternova vrstva je pak nábojem ekvivalentní nabitému povrchu a označuje se jako Helmholtzova vrstva). Pokud se elektrická dvojvrstva a roztok vůči sobě pohybují, je část difúzni vrstvy strhávána proudící kapalinou. Potenciál mezi roztokem a pohybující se dvojvrstvou je elektrokinetický potenciál (^-potenciál), který závisí na uspořádání fázového rozhraní (na jeho velikosti a tvaru relativně ke směru proudění). Glycin a jeho iontové rovnováhy • In stacking gel, pH 6.8: H3N-CH2-C —^ H2N-CH2-C o- o- - Negatively charged form is disfavored. — Average electrophoretic mobility is very low. In separating gel, pH 8.8 + // _ // H3N-CH2-C -—-^ H2N-CH2-C o- o- - Negatively charged form is favored. - Average electrophoretic mobility much higher. Jednosytná slabá báze (BH) Disociační konstanta je rovna: K BH CH+ °B BH Disociační stupeň pak: a BH BH KBH +cn Pro efektivní pohyblivost platí: V A = M A • a A v a = v a c h + k bh + c h Ostwaldův zřeďovací zákon: B + H+ BHH CBH+ = a . c CB = (1-a).c CH+= (1-a).c (1 - a ).c(l - a ).c _ (\-a)2.c a .c a (l-a)2.cH+ l{\-a) BH a a kbh + ch + Slabá báze je disociována z 50% při pH=pKBH, tedy: a A A 0,5 A Pro pH