BioAFM – od molekul k buňkám
aneb na co si nesáhnu, tomu nevěřím
Jan Přibyl
CEITEC MU, Masarykova univerzita
Kamenice 5/A35, CZ-62500 Brno
pribyl@nanobio.cz
CEITEC MU
University Campus Bohunice
22
Rozlišení mikroskopických metod
4
Mikroskop atomárních sil:
základní popis instrumentace
5
AFM mikroskop základní komponenty
Povrch vzorku
Detektor
Regulace zpětné vazby
Kantilever a hrotem
Laser
Fotodioda
4-segmentová
PZT skener
(PiezoElectric Tube)
6
AFM mikroskop blokové schéma
7
Kantilever a hrot
8
Kantilever a hrot
6 mm
2mm
tl. 1 mm
Nosič kantileveru
kantilever
hrot
100-200 um
50-100 um
5 um
• Nosič kantileveru je poměrně univerzální pro všechny typy AFM mikroskopů
• Kantilever a hrot se liší velmi – tvar, velikost, materiál, vlastnosti.
Reflexní vrstva (zlato)
9
Druhy kantileverů
Dle
tvaru
Dle materiálových vlastností
– vyjádřeno konstantou tuhosti Force Constant [N/m]
K. tuh. [N/m] 10-130 1-10 0.1-1.0 0.005-0.1
Materiál kr. křemík pol. křemík sklo Si3N4
Res. f. [kHz] 200-500 100-200 15-100 1-20
Speciální aplikace – další materiálové vlastnosti: vodivé, magnetické,
koloidní hroty
10
Kantileverové pole – výběr
dle konstanty tuhosti
Charakteristika kantileverů
uvedená na krabičce s nimi
Skutečná konstrukce kantileverů a
hrotů je velmi složitá
11
Druhy hrotů
Tvar – vyjádření pomocí poloměru zakřivení Curvature Radius R [nm]
Ultraostré Standardní Speciální aplikace Bezhrotové
R
R 1 nm 10 nm 100 nm NA
12
Ohyb
kantileveru
(DFL
deflection)
Torzní síly
(LF latheral
forces)
Změna vlastností kantileveru
Při kontaktu s povrchem
Projeví se jako změna polohy
odraženého laserového
paprsku na detekční fotodiodě
DFL
LF
13
Efekt ostrosti hrotu R na rozlišení mikroskopu
Ultraostrý hrot
= reálný obraz
Standardní hrot
= R ~ velikosti
studovaného objektu
Neostrý hrot
= nemožnost sledovat
detailní strukturu
14
Laser, fotodioda a kantilever
15
Povrch vzorku
Kantilever a hrotem
Laser
Fotodioda
4-segmentová
PZT skener
(PiezoElectric Tube)
PZT skener (PiezoElectric
Tube)
Odraz laserového paprsku od horní
plochy kantileveru je detekován na
čtyřsegmentové fotodiodě.
= detekce ohybu kantileveru
(→ interakce hrot-povrch)
DFL
LF
Lze sledovat v okně
Aiming, ale program
Nova si převádí obraz z
fotodiody do podoby 2D
obrázku automaticky.
Okno Aiming je tedy
dobré jen k počátečnímu
nastavení laseru.
16
Aiming: počáteční nastavení laseru
Obraz laseru co nejblíže špičce a zároveň co
nejvyšší signál
Obraz není na středu fotodiody
Jednotky LASER jsou relativní a u
každého typu kantileveru mohou nabývat
jiných hodnot (obecně lze konstatovat, že
by hodnota měla být vždy vyšší než 20)
Poloha a
intenzita LASER
se ladí
pohybem
laserové LED
pomocí koleček
s označením
LASER.
17
Aiming: počáteční
nastavení laseru
„Vynulování“ polohy laseru pohybem
fotodiody na střed obrazu laseru:
Provede se pohybem koleček
PHOTODIODE (na měřící hlavě)
Také jednotky DFL a LF jsou relativní
slouží
k určení polohy (po vynulování musí
být < 0.1)
18
Ohyb kantileveru
(DFL deflection)
Kontaktní mód
• Měřenou veličinou v kontaktním módu je ohyb kantileveru
(= deflection, DFL)
• V programu Nova se zobrazuje ohyb kantileveru (resp. pohyb obrazu
laseru na fotodiodě v důsledku ohybu kantileveru) jako veličina DFL [nA].
• Veličina DFL je převáděna program automaticky do výškového profilu a
má tedy význam spíše pro přiblížení k povrchu vzorku.
19
SetPoint: vyjadřuje relativní míru zvýšení ohybu
kantileveru při kontaktu se vzorkem
DFLint
ohyb (kontakt)
DFL0
bez ohybu
(kontaktu)
20
Semikontaktní mód
• Měřenou veličinou v semi kontaktním módu je amplituda kmitu
(= magnitude, MAG)
• V programu Nova se zobrazuje amplituda kmitu kantileveru jako veličina
MAG [nA], což je relativní veličina přímo úměrná velikosti amplitudy.
Reálnou velikost amplitudy lze však určit až pomocí MAG-výška křivky.
• Veličina MAG je převáděna program automaticky do výškového profilu a má tedy
význam spíše pro přiblížení k povrchu vzorku.
A0
volná
amplituda
Aint
tlumená
amplituda
(= interakce)
21
A0
volná
amplituda
Aint
tlumená amplituda
(= interakce)
SetPoint: vyjadřuje relativní míru utlumení (snížení) volné
amplitudy při kontaktu se vzorkem
22
PZT
Piezo-elektrody
23
Piezo-elektrody PZT
• Duté elektrody z keramického materiálu potažené kovovými
elektrodami.
• Aplikace napětí způsobuje změnu velikosti krystalové mřížky →
posun vzorku / hlavy
• Přesné řízení napětí = přesné řízení pohybu (rozlišení v řádu
pm)
Dva základní typy AFM mikroskopie - dle pozice PZT:
Skenování próbou
•Pohyb v x,y,z osách i
oscilaci ve sken. hlavě
•Rozsah 100-150 um
•Horší rozlišení
Skenování vzorkem
•Pohyb v x,y,z osách vzorek
•Oscilátor ve sken. hlavě
•Rozsah 3-7 um
•Výborné rozlišení, nízký šum
24
Piezo-elektrody PZT
V softwarovém nastavení programu Nova
1. Přiblížení hrotu k povrchu:
- Nejprve krokovým motorem s mikrometrickým šroubem
- Po prvním kontaktu s povrchem dokončení Z-piezem
Poloha Z-skeneru
Skok signálu zprostředkovaný
Z-piezem
Přiblížení k povrchu probíhá automaticky po kliknutí
na ikonu LANDING v okně Approach.
25
2. FBloop (zpětnovazebná smyčka, FeedBack Loop)
- Zpětná vazba kontinuálně udržuje konstantní ohyb kantileveru při pohybu nad skenovaným
vzorkem
- Zapnutí/vypnutí smyčky se projeví kontaktem hrotu se vzorkem:
VYPNUTO
ZAPNUTO
VYP
ZAP
vzorek
VYP
ZAP
PZT
26
3. SCAN: většina parametrů skenování je řízeno PZT
Výběr rychlosti skenování.
Pro malé molekuly 0.35 – 0.7 Hz
(lze využít jiné jednotky rychlosti)
Počet bodů (pixelů): možnosti 128x128; 256x256,
512x512 a 1024x1024 pix.
Velikost zobrazované oblasti (10 nm až 6.664 um)
Velikost kroku při skenování.
27
Detailní nákres trubkového
piezo-skeneru pro AFM mikroskop
28
Nelineární průběh pohybu piezo-elektrod v závislosti
na aplikovaném napětí
Nativní data z AFM mikroskopu
jsou nakloněná. Při
vyhodnocování se odstraňuje např.
polynomální regresí
29
Oscilátor
30
Oscilátor (PV,
PiezoVibrations) vždy
umístěn ve skenovací
hlavě
31
Parametry oscilátoru se nastavují v okně Resonance
Amplitude = napětí aplikované na oscilátor [V]
Gain = Lock-In zesilovač signálu
DFL x = prosté matematické vynásobení
intenzity signálu (zesílí i šum)
Intenzita oscilace kantileveru je vyjádřena
relativním parametrem
MAG [nA], který je úměrný reálné hodnotě kmitu
kantileveru, ale pro její určení je potřeba provést
MAG-výška spektroskopii
32
Další komponenty
33
ClosedLoop smyčka (v ose X, Y)
Založeno na sensorech elektrické kapacity
ClosedLoop
Sensory elektrické kapacity
• Korekce teplotního driftu
• Linearizace posunu piezo-elektrod
34
Krokový motor s mikrometrickým šroubem (motorized stage)
Pro přiblížení vzorku do dosahu
(rozsahu) piezo-elektrod
(lze ovládat i ručně)
35
Příprava nosičů a vzorků
36
Atomárně rovné povrchy
1. HOPG Highly Ordered Pyrolytic Graphite
• Kishův grafit, původně odpadní produkt při výrobě
oceli
• Hexagonální, planární struktura
• C-C vazba 142 pm, vzdálenost mezi rovinami 335
pm
• Vodivý, vysoce hydrofóbní
• Planární struktura – čištění loupáním
• Syntetická forma grafitu, vysoká chemická čistota
• Tradiční podklad pro imobilizaci vzorků pro
elektronovou mikroskopii, použitelný pro SEM, STM
i AFM (→ vodivost)
• Imobilizace spontánní adsorpcí na povrch
(→ hydrofobicita)
37
Atomárně rovné povrchy
1. HOPG Highly Ordered Pyrolytic Graphite
Na větších plochách
jsou viditelné šupiny
Na malých plochách
atomárně rovný
38
Atomárně rovné povrchy
2. Slída (muskovit, Mica)
•„Kočičí stříbro“, jméno Muskovit dle
města Moskvy (těžba nejkvalitnější
suroviny)
•Chem. struktura: K2O·Al2O3·SiO2
•Vysoce hydrofilní povrch
•Dobře chemicky modifikovatelný
•Imobilizace iontovou interakcí
i kovalentní vazbou biomolekul
•pKa ~ 3, při fyziologickém pH je povrch
záporně nabitý
•Mica = křemičitan, z hlediska chemické
modifikace lze povrch popsat jako
hydratovaný oxid křemičitý Si-OH
39
Atomárně rovné povrchy
2. Slída (muskovit, Mica)
Velice rovná na větších i malých plochách
40
Ostatní povrchy
1. Zlato
•Inertní kov používaný zejména v
elektrochemii jako pracovní
elektroda
•Vodivost: použitelný pro STM i
AFM
•Hydrofóbní: spontánní adsorbce
biomolekul (proteinů)
•Chemická vazba pomocí
koordinačně-kovalentní vazby
thiolů (-SH)
• Příprava zlatých vrstev napařením
•Ve vodě nestabilní, potřeba
aplikovat adhezivní vrstvu
(Al/Cr/Ti)
Napařená vrstva zlata: tvořena
nanočásticemi (4-50 nm)
41
Ostatní povrchy
2. Sklo
•Nekrystalická (amorfní) hmota (podchlazená kapalina)
•Laboratorní sklo: 75% SiO2 plus Na2O, CaO, borát a aditiva v minoritním
zastoupení
•Z hlediska chemické modifikace k němu přistupujeme jako ke slídě, tj. je
to hydratovaný oxid křemičitý Si-OH
•Méně hydrofilní než slída
•Drsnost povrchu (amorfnost materiálu, příprava lisováním) je mnohem
vyšší než u slídy
•Nelze použít pro zobrazování malých molekul
•Typicky použití tam, kde i při optické mikroskopii, tj. pro velké (např.
chromozóm) či celobuněčné útvary (bakterie, buňka, spermie)
42
Makroskopické útvary na skle
sklo
A. Thiooxidans
zachycený na
skle
spermie
zachycen
á na skle
43
Ostatní povrchy
3. Plasty
Fibroblast
na PS
• Plastové povrchy většinou jako součást standarních pomůcek
(PS/PP misky)
• Neobsahují fční skupiny vhodné pro kovaletní imobilizaci
• Hydrofóbní povrchy: spontánní (nespecifická) adsorpce biomolekul
Nemodifikovaný
polystyren (PS)
44
+ + +
Imobilizační postupy
1. Proteiny
Povrchy: slída nebo HOPG (velmi nízká drsnost)
P
pHIEP
nulový náboj
P
+
+
+
+
+
+
+
+ P
-
-
-
-
-
-
-
OH
OH OH OH
SiSi
- - -
Si
Protein: náboj se řídí dle IEP a pH prostředí
Imobilizace proteinu na slídu: pKa (slída) < pH < IEP
P
+
+
+
+
+
+
+
+
- - -
Si
45
46
Imobilizace proteinu na HOPG
HOPG
A. Imobilizace spontánní (nespec.) adsorpcí proteinu na hydrofóbní
povrch (nejlépe při pH = IEP
P PP
Adsorpce lysozymu
na HOPG
47
B. Imobilizace iontovou interakcí
→ Vytvoření náboje na povrchu HOPG
HOPG
COO-COO-
COO-
HOPG
Vytvoření karboxylových
skupin elektrochemicky
(E ~ 2 V vs. Ag/AgCl)
Adsorpce
dlouhořetězcových
(C16/C18) alkanů
zakončených vhodnou
fční skupinou
Možnost využití záporného
náboje pro imobilizaci iontovou
interakcí
Nebo kovalentní vazba:
aktivace karboxylu (např. NHSester,
vazba NH2-skupiny)
NH2 NH2
NH2 NH2
NH2
HOOC HOOC HOOC HOOC HOOC
HOPG HOPG
48
Imobilizační postupy
2. DNA
Povrchy: slída nebo HOPG (velmi nízká drsnost)
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
- -
- - - - - - - - - - - - - - - - - - -
slída
Problém:
DNA (cukr-fosfátová kostra) i slída za fyziologického pH shodný
(záporný) náboj
→ Na povrch slídy je nutno zavést kladný náboj
49
SiO
O
O
CH3
CH3
CH3
R
OH
Si
R
OO
OH
- CH3
OH
N(Et)3
OH OH OH
OHOH OH OHOH OH OO O OO O
R-propyltrimethoxysilane
+
cat.
Si
Si Si
Silanizace
= chemická modifikace povrchu slídy
- Kovalentní modifikace povrchového SiOH
alkoxysiloxany
- cíl: zavedení požadované fční skupiny na povrch
slídy
- lze použít i pro sklo, křemen, křemík, titan a TiO2
- katalýza silnou bazí
- průběh reakce lze dobře sledovat změnou
kontaktního úhlu
Silanizace
Hydrofobizace
50
SiO
O
O
NH2
Si
O
NH2
SiO
O
O
SH
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane
MPTS(3-Aminopropyl)trimethoxysilane
APTES
3-(Ethoxydimethylsilyl)propylamine
APDMES
Nejčastěji používané alkoxysiloxany
51
Problém praktického provádění: self-polymerizace
SiO
O
O
R2
R1
R1
R1
SiO
O
O
R2
R1
R1
R1
H O H
Si OO
R2
SiO
O
O
R2
R1
R1
Si
O
O
R2
+
-R1OH
• Zejména při použití APTES a provádění silanizace v kapalině
• Stačí i stopy vodních par pro spuštění
• Vzniklé útvary ruší topografickou studii povrchu
• Řešení: provádění silanizace v parách (vakuum, sušidlo)
• Nové monoalkoxy-deriváty siloxanů, nemohou polymerovat:
Si
O
NH2
3-(Ethoxydimethylsilyl)propylamine
APDMES
52
Polymerní struktury vzniklé na
povrchu slídy při provádění
silanizace v APTES, katalýza TEA
53
Vytvoření kladného náboje na
povrchu HOPG:
Adsorpce dlouhořetězcových
(C16/C18) alkanů zakončených
vhodnou fční skupinou
NH2 NH2
NH2 NH2
NH2
HOPG
Imobilizační postupy
2. DNA na povrchu HOPG
HOPG
54
Imobilizační postupy
3. Nanočástice
Povrchy: nejčastěji slída nebo HOPG (velmi nízká drsnost)
ale také sklo, zlato, atp.
Např. pro studium zlatých nanočástic (AuNP) lze použít slídu
modifikovanou merkapto-derivátem siloxanu (SH-mica)
OH
Si
SH
OO
OH
OH OH OH
SiO
O
O
SH
Si
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane
MPTS
55
Si
- - - - - - - - - - - - - - - -
Au
+
+
+
+
+
+
+
+
P P
P
P
P P
+
+
+
+ Au
+
+
+
+
+
+
+
+
P P
P
P
P P
+
+
+
+
AuNP konjugované s proteinem
se zachycují na podkladní přes
můstek tvořený navázaným
proteinem
56
Imobilizační postupy
4. Bakterie, spory
sklo
+ + ++ +
+ +
+
++ ++
Některé bakterie přes adhezivní vrstvu
poly-L-lysinu:
pLL
Jiné standardním nátěrem na podložní
sklo:
sklo
57
Imobilizační postupy
5. Eukaryotické buňky
Standardní pěstování buněčných kultur v PS miskách
Vhodné je použití adhezivním vrstvy pLL nebo adhezivních proteinů
58
Použití fixačních činidel
• Problém s adhezivitou buněk mimo inkubátor (37oC, 5% CO2)
• Umožňuje studium buněk i dlouho po vyjmutí z inkubátoru
• Poškozuje skutečnou strukturu buněk, nelze studovat procesy na
živých buňkách
• Příklady: EtOH, k. octová, paraformaldehyd, glutardialdehyd
59
CEITEC AFM CoreFacility
60
CEITEC AFM CoreFacility
JPK NanoWizard3
Bruker FastScan Bio
NTMDT NTgra Vita
NTMDT Solver Next
61
AFM visualization of biomolecules and
bioobjects
Bare metal (gold) electrodesBacteria on glass slideSpermWhole cells (cell synapse)Individual biomolecules
IgG
Nanoparticles
(gold nanoparticles BSA modified)
DNA
J. Hejátko – YM mapping
P. Bouchal – YM mapping
J. Paleček - DNA
M. Pešl, V. Rotrekl CMCs
J. Sládková – CMCs
A. Meli - CMC
M. Kalbáčová – TiO2 NT
H. Kolářová - DNA
I. Crha - sperms
Cooperation:
62
AFM spektroskopie
Automatizace AFM
63
Force Distance curves (FD curves)
64
FD křivka - popis
65
ScanAssyst – Automatizace AFM měření
66
ScanAssyst - princip
67
Děkuji za pozornost