Využití hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF
nejen v proteomice
Ondrej Šedo
Seminář Biochemie
Brno, 16. 10. 2014
Research programme 4: Genomics and Proteomics of Plant systems
Research Group Proteomics
Proteomics Core Facility
Využití hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF
nejen v proteomice
1. Historie a princip MALDI-TOF MS
2. Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS
3. MALDI-TOF MS v klinické diagnostice
2
3
Princip MALDI-TOF MS
- MALDI-TOF MS = Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization –
- Time of Flight Mass Spectrometry
Hmotnostní spektrometrie s laserovou desorpcí a ionizací
s průletovým analyzátorem
O H
O H
O O H
O H
O OC H3 C H3
O O H
O H
O
O HO
C H3
+
66431
50
100
150
200
250
300
Intens.[a.u.]
40000 50000 60000 70000 80000 90000 100000
m/z
+
Princip MALDI-TOF MS
- MALDI-TOF hmotnostní spektrum proteinu
4
Karas M., Bachmann D., Bahr U., Hillenkamp F., Int. J. Mass. Spectrom. Ion Proc. 78 (1987) 53.
Tanaka K., Waki H. Ido Y., Akita S. Yoshida Y. Yoshida T., Rapid Commun. Mass Spectrom. 2 (1988) 2.
Koiči Tanaka
OH
OH
O OH
OH
O CH3
O OH
N
OH
O
O OH
CH3 nano-kobalt, glycerol
Koiči TanakaMichael Karas, Franz Hillenkamp
Historie MALDI-TOF MS
- Nobelova cena za chemii 2002
5
Převzato z www.promega.com
Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS
- peptidové mapování
6
6 0 0 1 1 0 0 1 6 0 0 2 1 0 0 m / z
5 0 0
1 0 0 0
1 5 0 0
2 0 0 0
2 5 0 0
3 0 0 0
a . i .
Přesnost stanovení MW< 0,001 %
Detekční limit ~ fmol
Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS
- MALDI-TOF hmotnostní spektrum
směsi peptidů po proteolýze proteinu
7
organismus
proteáza
databáze
modifikace
molekulová
hmotnost
peptidů
Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS
- databázové prohledávání
8
Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS
- výsledek databázového prohledávání
9
m/z
800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
2.6
2.8
3.0
[Abs. Int. * 1000]
649.360
223-228
841.485
483-489
927.512
161-167
1163.587
66-75
1249.571
35-44
1283.664
361-371
1305.664
402-412
1362.621
89-100
1386.562
286-297
1439.763
360-371
1479.750
421-433
1567.707
347-359
1639.901
437-451
1667.784
469-482
1823.899
508-523
1850.870
529-544
1888.945
169-183
2045.057
168-183
Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS
MS/MS ion search
10
Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS
- výběr prekurzorového iontu
11
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
4x10
Intens.[a.u.]
600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200
m/z
1567.69
Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS
- výběr prekurzorového iontu
12
175.131
1452.530
334.176
425.233
120.084
591.297262.174
1567.710720.335
830.374 977.399 1121.437
1381.500
70.054
478.214
0
1
2
3
4
5
4x10
Intens.[a.u.]
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
m/z
Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS
- MS/MS data
13
organismus
proteáza
databáze
modifikace
molekulová
hmotnost
peptidů
a jejich
MS/MS
fragmentů
Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS
- databázové prohledávání na základě
MS/MS dat
14
Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS
- identifikace peptidu na základě MS/MS dat
15
Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS
- identifikace peptidu na základě MS/MS dat
peptid DAFLGSFLYEYSR
16
Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS
- separace směsi proteinů před MS analýzou
první rozměr
IEF
IEF proužek na SDS gel
druhý rozměr
SDS-GE
klesajícíMW
rostoucí pI
vzorek
-+
+
-
2D GE – dvoudimenzionální gelová elektroforéza
1) IEF – izoelektrická fokuzace
2) SDS-PAGE – denaturující elektroforéza v polyakrylamidovém gelu
17
Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS
- separace směsi proteinů před MS analýzou
18
Bouchal P., Struhárová I., Budinská E., Vyhlídalová T., Zdráhal Z., van Spanning R., Kučera I.
Biochim Biophys. Acta 6 (2010) 1350.
MALDI-TOF MS v klinické diagnostice
- úskalí při zavádění proteinových markerů
do klinické diagnostiky
- nižší produkce markerů u asymptomatických malých nádorů
- stejné proteiny produkují i zdravé tkáně
- ovlivnění hladiny markeru jinými onemocněními
- ekonomická/diagnostická výhodnost oproti současným postupům
- stabilizace vzorků po odběru (inhibice proteáz, rozpad krvinek)
- vhodnost metody analýzy a interpretace výsledků
- preanalytická fáze (vliv věku, rasy, pohlaví, stravy, režimu, léků…)
19
MALDI-TOF MS v klinické diagnostice
- identifikace bakterií
9626
4305
4812
6423
6888
889066135932
3208 8090
4044
4588
5506 91772962 5051
10103
3583
0
2000
4000
6000
Intens.[a.u.]
2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000
m/z
20
I. MALDI-TOF hmotnostní spektrometr
II. Databáze referenčních spekter
III. Software pro vyhodnocení dat
6000 8000 10000 m/z
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
a.i.
6000 8000 10000 m/z
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
a.i.
4491
4368
4363
4356
4354
2807
1909
1769
667
658
655
MALDI-TOF MS v klinické diagnostice
Identifikace bakterií
21
5186
7134
78575735
94904559 68703565
2590 6125 8954
7430
Izolát
0
1
2
3
4
4x10
Intens.[a.u.]
5188
2594
47473932 5737 7859
94932867 4529 72913436 68732279
5407
6127
0
2
4
6
8
4x10
Intens.[a.u.]
5188
4561 5737
754068732593 949161253770 895554353308
Lactobacillus plantarum CCM 7039T
0
2
4
6
4x10
Intens.[a.u.]
2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000
m/z
- srovnání získaných dat
s databází referenčních
MALDI-TOF hmotnostních
spekter známých
mikroorganismů
Lactobacillus plantarum DSM 1055
22
38 Bruker Biotyper bioMérieux VITEK MS
MALDI-TOF MS v klinické diagnostice
- identifikace bakterií
Výhody:
- doba analýzy ~ minuty
- identifikace na úrovni druhu, případně i detailnější
- minimální náklady na analýzu
- identifikace vzorků s abnormálním fenotypem
Nevýhody:
- vysoká pořizovací cena
- problémy s rozlišením blízce příbuzných druhů
- identifikace ze směsných vzorků není možná
24
MALDI-TOF MS v klinické diagnostice
- identifikace bakterií
CEITEC (Central European Institute of Technology
CZ.1.05/1.1.00/02.0068) funded from the European
Regional Development Fund
GAČR P206/12/G151, 13-26693S
OP VK Z.1.07/2.3.00/30.0019
Research programme 4: Genomics and Proteomics of Plant systems
Research Group Proteomics
Proteomics Core Facility
25