Souhrn 1. přednášky •Kvasinky – historie využití a výzkumu •Kde všude a jak kvasinky rostou? •Vztahy k lidskému zdraví •Příklady biotechnologií hustopece_kvasinka_vinna2 Hustopeče u Břeclavi Osnova 2. přednášky •Taxonomie kvasinek •Základní charakteristiky kvasinek •Podmínky růstu •Morfologie buněk a kolonií •Killer toxiny Taxonomie kvasinek - Kvasinky se řadí do říše houby (ačkoliv jsou to mikroskopické jednobuněčné organizmy), superskupiny Opisthokonta, domény (nadříše) Eukaryota. Netvoří však žádnou přirozenou taxonomickou skupinu, a proto je nemožné je jednotně definovat. Jako takové jsou roztroušeny ve dvou odděleních hub, buď jako houby vřeckovýtrusné nebo stopkovýtrusné (asko-, basidio- a deuteromycetes + kvasinkové mikroorganismy) - wikipedie Hedges, Nat Rev Genet, 2002 Saccharomyces cerevisiae: nadříše › Eukaryota říše › Fungi (houby) oddělení › Ascomycota (vřeckovýtrusé) pododdělení › (hemi) Ascomycotina třída › Ascomycetes řád › Saccharomycetales (kvasinkotvaré) čeleď › Saccharomycetaceae rod › Saccharomyces druh › Saccharomyces cerevisiae hustopece_kvasinka_vinna2 Taxonomie kvasinek oddělení: pododdělení/třída: - netvoří žádnou přirozenou taxonomickou skupinu - jsou roztroušeny ve dvou odděleních hub, buď jako houby vřeckovýtrusné nebo stopkovýtrusné (cca 1000 druhů) - - - Basidiomycota + Tremellomycetes (Cryptococcus neoformans) TRENDS in Genetics 22 (2006) Většina využívaných kvasinek je z třídy (hemi)ascomycetes Pivo, víno Chleba Lidský Patogen Využívá laktozu Rostlinný Patogen Halotolerant Lidský Patogen Využívá alkany Pivo Lidský patogen rody: Taxonomie kvasinek Basidiomycota Saccharomyces cerevisiae: nadříše › Eukaryota říše › Fungi oddělení › Ascomycota pododdělení › Ascomycotina třída › Ascomycetes řád › Saccharomycetales čeleď › Saccharomycetaceae rod › Saccharomyces druh › Saccharomyces cerevisiae Schizosaccharomyces pombe: nadříše › Eukaryota říše › Fungi oddělení › Ascomycota pododdělení › Taphrinomycotina třída › Archiascomycetes řád › Schizosaccharomycetales čeleď › Schizosaccharomycetaceae rod › Schizosaccharomyces druh › Schizosaccharomyces pombe Taxonomie kvasinek Srovnání průměrné % shody sekvence proteinů v taxonech Hemiascomycotina a Chordata •% odlišnost sekvence proteinů: –S. cerevisiae a C. glabrata ~ člověk a ryba –mezi druhy S. sensu stricto ~ mezi řády savců –Proteiny člověka a hlodavců jsou si více podobné (lze rekonstruovat změny , jimiž genomy během evoluce od společného předka prošly) než proteiny druhů ze skupiny sensu stricto, mezi nimiž mohou vznikat životaschopné hybridy! Vychází převážně z analýzy rDNA; nověji srovnáním rozdílů sekvencí aminokyselin v ortologních proteinech. Přes velkou morfologickou podobnost vykazují kvasinky velké rozdíly v genomu. Genomy (sekvence) kvasinek ze vzdálenějších větví fylogenetického stromu ani srovnat nelze Srovnání průměrné % shody sekvence proteinů v taxonech Hemiascomycotina a Chordata Většinou jednobuněčné organismy (+ hyfy, + kolonie) Nejčastěji kulaté až oválné (3-15 mikrometrů) Množí se většinou pučením (+ Schizosaccharomces, Trichosporon: štěpením – tzv. poltivé - podlouhlé) Zpracovávají zdroje uhlíku kvašením (vyjímky Lipomyces ...) rozdíl mezi S.c. a S.p. je cca 300MYA •Potřebují vodné prostředí, kyslík a živiny • •volná voda (nikoli chemicky vázanou) - Vodní aktivita = volně přístupná voda/fyziologicky využitelná voda = available water (aw) •aw = poměr tlaku vodních par nad substrátem a tlaku par destilované vody • • –0,95: Pseudomonas, Escherichia,…,většina bakterií –0,85: kvasinky (Candida, Torulopsis, Hansenula) –0,75: většina halofilních mikroorganismů –0,65: xerofilní plísně (Aspergillus) –0,4: potlačení růstu veškeré mikroflóry • •Bakterie vyžadují vyšší hodnoty aw (víc dostupné vody) než kvasinky a plísně (z toho důvodu např. chléb napadají plísně, nikoliv bakterie) •Aktivitu vody lze snížit proslazováním nebo solením (marmelády, nasolování masa … lze takto potlačovat i růst bakterií v kvasinkových izolátech) • •Xerotolerantní kvasinky rostou i za zvýšeného osmotického tlaku – (aw=0.65), rod Zygosaccharomyces (rouxii, bailii, bisporus) – rostou přednostně v potravinách s vysokým obsahem cukru či solí; ostatní (S. pombe, Debaryomyces hensenii, Hansenula anomala) vyšší osmotický tlak tolerují, ale lépe rostou za standardních podmínek (více polyolů, ATPázové pumpy), •Lipomyces mají pouzdro – při zvýšené koncentraci solí upravují jeho složení • •Test: schopnost růstu na 50-70% glukose (většina pouze do 40 %) nebo na 10% NaCl debaryomyces Debaryomyces hensenii Podmínky růstu - kyslík -Většina kvasinek je obligátorně aerobní (vyžadují aspoň stopová množství kyslíku nezbytné pro syntézu některých esenciálních metabolitů – ergosterol, nenasycené mastné kyseliny) • - fermentativní typy (Sacharomces c., S. p.) – pro fermentaci jsou vhodnější anaerobní podmínky, ale S.c. i v aerobních podmínkách fermentují -respirativní typy (většina) – převládá energeticky výhodnější respirace nad fermentací - nefermentativní typy (nemají alkoholdehydrogenásu - neprodukují ethanol) – rody Lipomyces, Cryptococcus, Saccharomycopsis • •- teploty, při nichž mohou kvasinky růst: • - mezofilní (0 – 48 °C) – většina druhů • - psychrofilní (-2 – 20 °C) – voda, půda v Antarktidě (některé Leucosporidium, Cryptococcus, Candida) • - termofilní (ne méně než 20 °C) – potenciální patogeny (Candida, Cyniclomyces) • •Maximální teploty, které některé kvasinky přežívají, se pohybují kolem 57-59 °C •Laboratorní podmínky 25-30 °C (S.c. i S.p. – rostou i při 15°C a přežívají krátkodobě 50°C), •teplotně senzitivní mutanty (ts, 37°C), chladově sensitivní mutanty (cs, 20°C), živiny •Nejčastějším zdrojem uhlíku a energie jsou mono-, di- a oligosacharidy (jsou schopny hydrolyzovat i polysacharidy jako škrob, xylany či celulozu … nebo methanol (Pichia pastoris), alkany apod. •Zdrojem dusíku jsou amonné ionty a aminokyseliny • •Laboratorní podmínky: • •YPD/YES – bohaté médium = 10g/l yeast extract, 20g/l pepton, 20g/l dextrose (2%glukosa)/u S.pombe supplements: A, H, L, U, K •Sabouraudův agar (1892) = 10g/l pepton, 40g/l dextrose (4%glukosa), 20g/l agar, pH 5.6 •Syntetické SD médium = 6.7g/l yeast nitrogen base w/o amino acids (aminokyseliny se přidávají dle potřeby), 20g/l dextrose (2% glukosa) •Minimální agarová půda = 5g/l (NH4)2SO4, 1g/l KH2SO4, 0,5g/l MgSO4 x7H2O, 10g/l glukosa, 1ml/l Wickerhamův roztok, 20g/l agar •Wickerhamův roztok: 0.2mg biotin, 200mg inositol, 20mg riboflavin, 40mg thiamin, 40mg pyridoxin, 20mg kyselina p-aminobenzoová, 40mg kyselina nikotinová, 0,2mg kyselina listová (na 100ml vody) • Forsburg and Rhind, Yeast (2006) - Živiny určují morfologii/buněčnou formu – kvasinková nebo pseudohyfy nebo sporulace … - limitování klíčových živin spouští různé vývojové odpovědi - zdroje uhlíku a dusíku jsou monitorovány signálními dráhami Sporulace/meiosa Granek and Magwene, PLoS Genet (2010) - Živiny určují morfologii/buněčnou formu – kvasinková nebo plísňová/pseudo/hyfální - často se tato stádia odlišují infekčností (hyfy v napadeném organismu zatímco „normálně“ kvasinková forma/ nebo naopak) fig75_3 Kvasinková forma - morfologie -za běžných podmínek (bohaté C i N zdroje) převládá kvasinková f. -rotační elipsoid, kulaté, protáhlé – rod Dipodascus až 130 mikrometrů -3-15 mikrometrů (bakterie -Haploidní spory vřeckovýtrusných kvasinek vzniklé při sporulaci diploidních buněk (pohlavní rozmnožování) Saccharomyces Schizosaccharomyces Lipomyces Hanensula Metschnikowia Nematospora -při nedostatku dusíku v kombinaci s ne-fermentovatelným uhlíkatým zdrojem dochází k indukci sporulace a meiosy - při vyčerpání živin na misce mohou (krajní) buňky začít meiotické dělení (diploidní S. cerevisiae) - meiosa je indukovana IME1 transkripčním faktorem (v ime1D se meiosa neindukuje vs. v pIME1 overexprimovaných buňkách je indukována meiosa i bez vyčerpání živin tj. 2% glukosa) ade2 (červená barva) ukazuje haploidizaci heterozygotního diploida (některé hapl. bílé vs červené) šipky ukazují vřecka se čtyřmi sporami Purnapatre a Honigberg, Curr Genet, 2002 - různé vývojové programy (formy) vedou k mnoho-buněčným strukturám (pseudohyfy) - tvorba biofilmu na pevném podkladu se sníženým množstvím agaru (málo glukozy) - naopak tvrdý agar (4%, + suchá) a UV záření indukuje „stopkování“ (složená z kvasinkových nikoli pseudohyfálních buněk) – zvyšuje šanci na diseminaci S. pombe C. albicans S. cerevisiae - Buňky v jamkách jsou chráněny před UV, zatímco ty na povrchu jsou zabity - různé vývojové programy (formy) vedou k mnoho-buněčným strukturám - tvorba biofilmu na pevném podkladu se sníženým množstvím agaru (málo glukozy) - naopak tvrdý agar a UV záření indukuje „stopkování“ - různé tvary kolonií: - hladké i „fluffy“ kolonie – kulaté a oválné buňky (S.c.) – není určující faktor - drsné kolonie – protáhlé buňky (Pichia) - slizovité kolonie – pouzdra (Lipomyces) - obvykle krémová barva – - červený pigment (Rhodotorula, Sporidiobolus) - černý pigment (melanin – Aureobasidium) - používá se např. pro odlišení C.d. od C.a. (kultivace na Staibově agaru při teplotě 37°C) Kolonie Granek and Magwene, PLoS Genet (2010) rho1_L Kolonie Granek and Magwene, PLoS Genet (2010) - různé vývojové programy (formy) vedou k mnoho-buněčným strukturám - tvorba biofilmu na pevném podkladu se sníženým množstvím agaru (málo glukozy) - naopak tvrdý agar a UV záření indukuje „stopkování“ - různé tvary kolonií: - hladké i „fluffy“ kolonie – kulaté a oválné buňky (S.c.) – není určující faktor - drsné kolonie – protáhlé buňky (Pichia) - slizovité kolonie – pouzdra (Lipomyces) - obvykle krémová barva – - červený pigment (Rhodotorula, Sporidiobolus) - černý pigment (melanin – Aureobasidium) - používá se např. pro odlišení C.d. od C.a. (kultivace na Staibově agaru při teplotě 37°C) Např. odlišení C.d. od C.a.: 24h kultivace na Staibově agaru při teplotě 37°C (a) C. dubliniensis (b) C. albicans Morfologie kolonie - Candida Extracelularní matrix Stovicek et al, Fungal Gen Biol (2010) - závisí na ECM (extracellular matrix tj. glykoproteiny) - ECM zachycuje vodu a chrání kolonii před vyschnutím - buněčná adhese je důležitá pro všechny specifické morfologie (… biofilm, flokulace) - závisí na FLO11 (adhesin – glykoprotein – faktor důležitý pro flokulaci, biofilm, pseudohyfy) ECM Laboratorní kmeny jsou hladké (např. S288C - Genotyp: MATα SUC2 gal2 mal mel flo1 flo8-1 hap1) Ryan et al, Science (2012) - Flo8, Mfg1 jsou TF aktivující transkripci Flo11 - Dig1 je represor transkripce Flo11 - FLO11 = adhesin (glykoprotein – faktor důležitý pro uchycení - buněčná adhese je důležitá pro všechny specifické morfologie (… biofilm, flokulace) - Flo11, Flo8, Mfg1 faktory jsou konzervovány … a podílí se na invasivních vlastnostech (virulenci) patogenních kvasinek C. albicans S.c. kmen S1278b Ryan et al, Science (2012) - Flo8, Mfg1 jsou TF aktivující transkripci Flo11 - Dig1 je represor transkripce Flo11 - FLO11 = adhesin (glykoprotein – faktor důležitý pro uchycení - buněčná adhese je důležitá pro všechny specifické morfologie (… biofilm, flokulace) - tvořen matrix s mikrokoloniemi kvasinek, hyfami a pseudohyfami (komplexní struktura) - více rezistentní než planktonické buňky - významně přispívá k rozvoji a odolnosti kandidóz (rezistentní k antimykotickým látkám) - ECM a adhesiny/flokuliny FLO1, FLO11 jsou potřebné pro tvorbu biofilmu - váží např. peptidy na povrchu hostitelské buňky (C. albicans = ALS2, 3, 6, 7, 9 exprimovány při vaginální infekci zatímco ALS1, 2, 3, 4, 5, 9 exprimovány při orální infekci) - Biofilm Flokulace -reverzibilní schopnost kvasinek shlukovat se, tvořit větší celky (vločky, floky); odpověď na stres -flokulace je významná vlastnost využívaná např. při produkci piva (snižuje náklady na filtraci piva) • Smukalla a kol., 2008, Cell Verstrepen, 2006, Mol. Microbiol -ovlivněno složením média, genetickou výbavou kmene (skupina FLO genů), teplotou, stavbou a morfologií buňky … - Flo1p váže manany na povrchu buněk stejného druhu (S.c.) => agregace - NewFlo váže manosu i glukosu => glukosa v mediu inhibuje agregaci – teprve po přeměně cukrů na etanol se važe na buněčnou stěnu ostatních buněk a dochází k vločkování Yeast surface display - hybrid Aga2 (aglutininy nebo Flo1 …) s testovaným proteinem - exprese eukaryotních proteinů v kvasince (podobné mechanismy … posttranslační modifikace) – knihovny lidských cDNA (i protilátek z pacientů) - využití i pro biotechnologie – vychytávání těžkých kovů (dekontaminace) Pepper et al, CCHTS (2008) aglutinin - His-His-His-His-His-His (chelatuje Ni, Cu, Co kovy) -GTS1 transkripční faktor spouštějící aglutinaci pod CUP1 promotorem (další přednášky) - biosorbce & sedimentace Kuroda et al, Appl Microbiol Biotechnol (2002) YSD - testy antigen/protilátka Boder et al, Arch Bioch Biphys (2012) - nabohacení i slabších interakcí množením se nabohatí - zopakovat sorting Kvasinkové kolonie spolu „komunikují“ pomocí amoniaku – inhibuje růst sousední kolonie (kolonie S. cerevisiae produkují amoniak po 10 dnech růstu) Pálková et al., Nature 390 (1997) kolonie přesměrovává růst sousední kolonie – nekompetují o živiny - Aktivní inhibice růstu sousední kolonie nikoli (pasivní) důsledek spotřebování živiny Komunikace kolonií Čáp et al., Mol Cell, 2012 -větší buňky (4mm) -malé mitochondrie a vakuoly -více lipidových váčků - - rozdíly jsou patrné i na expresní úrovni proteinů -menší buňky (3mm) -velké mitochondrie i vakuoly (aktivnější respirace a více ROS) - • Čáp et al., Mol Cell, 2012 rozdíly jsou patrné i na expresní úrovni proteinů Differenciace S.cerevisiae v kolonii Čáp et al., Mol Cell, 2012 PIIS1097276512002663 U (upper) buňky - aktivní glutaminem-indukovanou TOR dráhu, sníženou respiraci (málo mitochondrii), AMK-sensing systém (Gcn4) a vyšší „turnover“ AMK (souvisí s produkcí amoniaku), produkují amoniak pro komunikaci kolonii - využívají živiny uvolněné z L buněk (autofagie) - jsou odolnější vůči stresu – déle přežijí - schopné proliferovat (po 10 dnech) L (lower) buňky – podléhají více stresu, hladoví (přestože jsou blíže mediu), aktivují degradační mechanismy (zásobují U buňky) Differenciace S.cerevisiae v kolonii Čáp et al., Mol Cell, 2012 PIIS1097276512002663 U (upper) buňky - aktivní glutaminem indukovanou TOR dráhu, AMK-sensing systém (Gcn4), sníženou respiraci - využívají živiny uvolněné z L buněk - jsou odolnější vůči stresu - schopné proliferovat (po 10 dnech) L (lower) buňky – podléhají více stresu, hladoví (přestože jsou blíže mediu), aktivují degradační mechanismy (zásobují U buňky) Killer toxiny •- Některé kmeny S.cerevisiae produkují tzv. killer toxiny (proteiny a glykoproteiny sekretované do prostředí), které jsou letální pro citlivé kvasinky i bakterie; ekologická výhoda (výhoda pro vinaře – nepřerostou je cizorodé kmeny) -Poprvé pozorováno v roce 1963 (Makower a Bevan) kvasinky zabíjí podkladový kmen (K1=laboratorní, K2 a K3=vinařské kvasinky) -Kvasinky ze stejné skupiny se navzájem nezabíjí (různé skupiny ano) -Geny jsou kódovány na dsRNA obalené ve „virus-like particles“ (VLP, připomínají savčí dsRNA viry) – kódují obalové, replikační (ale potřebují buňku k replikaci …), transkripční sekvence a toxin -Samotné VLP nejsou infekční ani toxické (lze je přenést konjugací buněk nebo fůzí protoplastů) -Toxin je sekretován a váže se na buněčné stěny (b-1,6-glukany) - způsobuje perforace/póry v cytoplasmatické membráně – ztráta iontů, potenciálu … buňka hyne - -Kluyveromyces lactis, Pichia membranifaciens – lineární dsDNA (v cytoplasmě, pGK11), bez kapsidy, toxin se váže na chitin (chitinásová aktivita) -Hansenula mrakii … - geny na chromosomech, toxin inhibuje syntézu b-1,3-glukanu (v místě růstu pupenu) - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -Kontaminace vinných kultur kmenem Brettanomyces bruxellensis může být potlačena P.m. -Význam při ochraně průmyslových kmenů (proti kontaminaci – odolné vůči toxinu a zabijí kontaminanty) -v léčbě (některé S.c. killer kmeny zabíjí kmeny C.a., C. podzolicus zabíjí C.n.) Santos et al., 2009, Microbiology Souhrn 2. přednášky •Kvasinky patří mezi houby (asco- a basidiomycety) •Podmínky růstu – determinují morfologii/buněčný program •Morfologie buněk a kolonií •Killer toxiny