Souhrn 3. přednášky •Diagnostické metody •Analytické metody • • yeast Osnova 4. přednášky •Genetické metody –Plasmidy –Integrace –Teplotně-sensitivní mutanty –Tetrádová analýza –Syntetická letalita, suprese • • • Výhody kvasinkového modelu •Rychle se množící EUKARYOTNÍ mikroorganismy (90 min/dělení, 25-30°C) •Vytváří kolonie na plotnách - mikrobiologické metody (otiskování ploten, kapkovací test • =>toxiny v plotnách – HU, MMS …) •Stabilní haploidní i diploidní formy •Haploidní buňky lze křížit na diploidní (heterozygotní mutanty) •Diploidní buňky lze sporulovat a využít pro genetickou analýzu (tetrádová analýza) •Lze transformovat DNA (plasmidy i linearní) •Centromerické a multicopy plasmidy •Vysoká frekvence homologní rekombinace (lineární DNA) •Lze připravovat deleční a mutantní kmeny •Vydrží v >15% glycerolu na -70°C „indefinitely“ • •Techniky barvení (např. aktinový cytoskelet = phaloidin, buněčná stěna = calcofluor ... + GFP in vivo) •Techniky synchronizace buněk • •S.c. má kompaktní genom – knihovny s genomovou DNA (ne cDNA) •Kompletně osekvenovaný genom (genomové aplikace) •EuroFan projekt – delece všech S.c. genů (+GFP, +2-hybrid) •Mikročipy - expresní profily za různých podmínek • •Řada životních dějů má analogii v procesech v savčích buňkách • (lidské geny testovány v kvasinkách - nemoci, metabolismus, •regulační mechanismy) 80J_3 chrIII Chromosom III (nejmenší) CEN, ARS, TEL, Ty1-5 obsahuje MAT lokus Nomenklatura pro S.c.: YCRXXw: Y=yeast C= 3. chromosom R= pravé raménko XX=pořadové číslo w/c=Watson/Crick LEU2 – gen Leu2p - protein leu2D – delece leu2-1 – mutance (identifikační číslo alely) LEU2::HIS3 – inzerce HIS3 genu v lokusu LEU2 Forsburg: NRG, 2001 Baudat a Nicolas, PNAS, 1997 Laboratorní kvasinkové kmeny S. pombe – „501“ Genotype: h- ura4-D18 leu1-32 ade6-704 S. Cerevisiae – „S288C“ – 1. osekvenovaný kmen Genotype: MATα SUC2 gal2 mal mel flo1 flo8-1 hap1 Notes: Strain used in the systematic sequencing project, the sequence stored in SGD. S288C does not form pseudohyphae. In addition, since it has a mutated copy of HAP1, it is not a good strain for mitochondrial studies. S288C strains are gal2- and they do not use galactose anaerobically. References: Mortimer and Johnston (1986) Genetics 113:35-43. Sources: ATCC:204508 „W303“ – nejčastěji používaný laboratorní kmen Genotype: MATa/MATα leu2-3,112 trp1-1 can1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11,15 Notes: W303 also contains a bud4 mutation that causes haploids to bud with a mixture of axial and bipolar budding patterns. In addition, the original W303 strain contains the rad5-535 allele. References: W303 constructed by Rodney Rothstein Sources: Biosystems:YSC1058 Dvojhybridní systém: Allele Reverts? Notes Molecular descriptiona Reference ade2-101 yes ochre mutation, red colonies G to T transversion at nucleotide 190, changing amino acid 64 from a Glu to a STOP Gai and Voytas, 2005 his3-200 no Cold sensitive; high frequency of petite formation, especially during transformation. 1 kb deletion, (-205 to 835) Struhl 1985; Fasullo and Davis 1988 leu2-3,112 no double mutant GTT-to-GCT missense change at codon 69, G insertion at nucleotide 249, G insertion at nucleotide 792, GAC-to-AAC missense change at codon 300. Hinnen et al. 1978; Gaber and Culbertson 1982; trp1-1 yes amber mutation GAG-to-TAG amber (STOP) nonsense change at codon 83 McDonald, et al. 1997 ura3-52 no - Ty1 insertion Rose and Winston 1984 Selekce Forsburg: NRG, 2001 - geneticin (G418) – podobný kanamycinu (mistranslace) - nourseothricin (NAT) – inhibitor ribosomalní proteosyntézy = miskodování (Streptomyces noursei), rezistence pomocí nat1 genu (N-acetyltransferasa – monoacetyluje NAT) - hygromycin B – inhibuje translokaci v průběhu translace (aminoglykosid z Streptomyces hygroscopicus), rezistence kódována hph genem z Klebsiella pneumoniae - phleomycin – interkaluje se do DNA a způsobuje DSB (zlomy, glycopeptid z Streptomyces verticulus), rezistence kódována ble genem z S. hindustanus Shuttle vektory •vychází z 2mm plasmidů nebo centromer (S.c.; 2mm přítomné také v Zygosaccharomyces bailii, Z. rouxii a Kluyveromyces drosophilarum) •Kvasinková část – marker (URA3, NAT …), CEN-ARS (1 kopie) nebo 2mm (~50 kopii na haploidní buňku) začátek replikace •Bakteriální část – Kan resistence, replikace •Promotor, tag, MCS –Kondicionální mutanty (fenotyp-funkce) –Nadprodukce (suprese mutací nebo toxicita) MET1 CUP1 MFA1 Methionin repressed Indukovány mědí MATa specifický (haploid specifický) YAC (yeast artificial chromosome) » •Bakteriální část – Amp resistence, počátek replikace • •Kvasinková část – marker, CEN-ARS, TEL • •50-500kbp insert např. lidská genová banka pro HuGO 80000 klonů YAC (270kbp) • •Klonování, množení, uchování dlouhých fragmentů DNA • •Výzkum savčích telomer a centromer • •Pomocí transfekce, lipofekce nebo elektroporace lze dostat YAC i do savčích buněk – náhodně se integrují do genomu - výzkum nesestřihnutých genů (dlouhé regulační úseky) Transformační protokol •Exponenciální kultura •Opláchnout vodou a TE/LiAc roztokem •Rozsuspendovat v TE/LiAc roztoku a přidat DNA (plasmidová/cirkulární i lineární DNA) •Přidat TE/LiAc/PEG4000 roztok •30 minut na 30°C a poté teplotní šok při 42°C (15min) •Stočit a pelet rozsuspendovat v TE roztoku •Rozetřít na selektivní plotnu Yeast surface display aglutinin Kuroda et al, Appl Microbiol Biotechnol (2002) - využití i pro biotechnologie – vychytávání těžkých kovů (dekontaminace) - 6xHis-Aga2 (vychytání Cu) integrován v genomu - CUP1-GTS1 (indukce aglutinace) na plasmidu Integrativní plasmidy - integrativní plasmid pro P. pastoris (GS1115, genotype: his4 ) - exprese z AOX1 promotoru v P.pastoris - nemají CEN ani 2mm části Integrace I. - integrativní plasmid pro P.pastoris (GS1115, genotype: his4 ) - exprese z AOX1 promotoru - - integrace do AOX1 lokusu Integrace II. - integrace do his4 lokusu Integrace III. u Pichia pastoris dochází u 1-10% transformantů k vícenásobné integraci – vyšší exprese Pomocí jiného markeru lze integrovat další kazetu - integrace do AOX1 lokusu •Využití inhibitoru FOA pro „odléčení“ URA3 markeru (FOA je přeměňována Ura3p dekarboxylázou na toxický 5-fluorouracil => URA3+ buňky nerostou, zatímco ura3- buňky jsou resistentní) •Buňky se stávají ura-, takže URA3 marker lze využít několikrát • Disrupce/delece genu - Studium funkce genu – fenotyp (1. delece, 2. mutace) - nezbytný/esenciální gen => buňky potřebují gen např. na plasmidu (plasmid shuffling) - životaschopné – mutace lze přímo integrovat do genomu - mutantní kmeny se testují na citlivost k různým „toxinům“ – dále je lze křížit s funkčně podobnými geny-mutantami a hledat jejich funkční vztahy (synthetic lethal x epistatic x suprese) 1. krok 2. krok neesenciální gen specifická mutace Delece genu - PCR •pro rekombinaci stačí pouze krátká homologie (50-100nt pro S.c.) •oligonukleotidy ~ 70nt dlouhé postačí (při 2 krokové PCR se kromě dlouhé homologie vnesou ještě specifické sekvence pro pozdější manipulace …) kanMX kanMX kanMX 1.PCR (barcode) 2.PCR (homologie) Kvasinkový ORF - systematicky provedeno na >6000 genech v rámci projektu EuroFan - kmeny lze získat z archivu EUROSCARF http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/index.html MX6 kazety - nourseothricin (NAT) – inhibitor ribosomalní proteosyntézy = miskodování (Streptomyces noursei), rezistence pomocí nat1 genu (N-acetyltransferasa – monoacetyluje NAT) - hygromycin B – inhibuje translokaci v průběhu translace (aminoglykosid z Streptomyces hygroscopicus), rezistence kódována hph genem z Klebsiella pneumoniae - phleomycin – interkaluje se do DNA a způsobuje DSB (zlomy, glycopeptid z Streptomyces verticulus), rezistence kódována ble genem z S. hindustanus) Společná struktura kazety – možnost záměny kazet (pro genetické studie – křížení) Hentges et al.: Yeast, 2005 Goldstein et al.: Yeast, 1999 Delece genu pomocí transposonů Defekt buněčné stěny MacDonald et al.: Nature, 1999 esenciální Citlivé … Cre rekombinasa Postup lze použít několikrát se stále stejným markerem Nevýhoda pro genetické studie (marker nekosegreguje s mutací) Guldener et al, NAR (1996) Příprava monomerů pro výrobu plastů – využití Candida tropicalis Lu et al., JACS (2010) •Candida tropicalis je schopna využít mastné kyseliny jako zdroj uhlíku (acetyl-CoA) •mutantní kmen (DPOX4, DPOX5) není schopen b-oxidace a přeměňuje je oxidací na di-karboxylové kyseliny (Picataggio et al, Biotechnology, 1992) •další mutagenezí (pomocí flp rekombinasy – viz genetika) odstranili geny dalších oxidás (4 alkohol oxidásy) a dehydrogenás (6 alkohol dehydrogenás) aby eliminovali w-oxidaci •nový kmen je schopen produkovat •w-hydroxymastné kyseliny, které •lze použít pro výrobu bio-polymerů •(plastů podobných polyetylenům, •bio-odbouratelné na bio-palivo) •další modifikace kmene •(integrace genů pro lipásy) •by umožnilo přímé odbourávání •odpadních olejů … EuroFan projekt - testy fenotypu Buněčná stěna (stabilizující) Oprava DNA Mikrotubuly (stabilizující) ts cs - Systematicky provedeno na >6000 genech v rámci projektu EuroFan - Funkční kategorie genů – anotace v databázích (genová ontologie) Mikrotubuly (destabilizující) Bun. stěna (destabilizující) ~ 6000 heterozygotních delečních kmenů ~ 5000 homozygotních delečních kmenů (+ ~ 1000 esenciálních genů) (neesenciální – růst za specifických podmínek nebo redundantní procesy) - Testováno ~400 malých molekul a stresových podmínek (-aa ...) - Celkem provedeno ~ 6milionů testů - multidrug resistance (MDR) pokud byl gen potřebný pro resistenci vůči >20% z testovaných látek - Podobné profily svědčí o funkční podobnosti Science 320 (2008), p.362 Geny/Proteiny peroxisomu • Matsuyama et al.: Nature Biotech, 2006 Určení lokalizace > Plasmid shuffling Pokud je YFG1 esenciální musí být v deleční mutantě přítomna extra divoká kopie genu např. na plasmidu Na dalším plasmidu může být vnesena mutovaná verze yfg1 – její efekt se projeví až po odstranění plasmidu s divokou kopií genu (pomocí FOA) Podobně lze použít ade2, ade3 systém s YFG1 wt genem na plasmidu s ADE3 (kolonie jsou červené díky ade2 mutaci) – po ztrátě plasmidu jsou sektory kolonii bílé (bez Ade3p enzymu je metabolická dráha blokována dříve než vzniká červený metabolit) ts mutanty - ts mutanty jsou výhodné pro studium funkce genu – mutanty jsou normální na permisivní (25°C) teplotě, ale nemohou dokončit buněčný proces vyžadující aktivní protein za restriktivní teploty (37°c) - ts mutanty = většinou nestabilní proteiny, které se při zvýšené teplotě denaturují/ztrácí aktivitu a jsou degradovány Dohmen et al.: Science, 1994 - ubiquitinace „označkuje“proteiny pro proteasom (degradaci) ts alela DHFR je degradována (nestabilní protein – strukturní mutace) - fůze DHFR (ts alely) s heterologním proteinem => celý protein je na 37°C degradován - je možno využít pro přípravu ts mutantních kvasinek (fůze s CDC28 – kvasinky arestují v G1 fázi) Životní cyklus S. cerevisiae 800px-Yeast_lifecycle - Deleci či mutaci lze provést v haploidní či diploidní buňce - - v haploidní buňce hrozí suprese defektu proto je lépe používat diploidní buňky (druhá kopie zůstává nezměněná) - - lze připravit dvojitého mutanta křížením haploidních mutant a poté sporulací diploida - pouzdro spory je třeba rozrušit a pomocí mikromanipulátoru získat jednotlivé haploidní buňky (lze provést i tzv. random sporulation) - u S.pombe jsou diploidní buňky nestálé a okamžitě sporulují (pouzdro se rozpadá samo) Více o BC a párování příště Tetrádová analýza genetické vztahy křížení dvou mutant 800px-Yeast_lifecycle Tetrádová analýza genetické vztahy křížení dvou mutant 800px-Yeast_lifecycle YPD Selektivní médium (SD-ura ... testy) Segregace 2:2 Mendlovy zákony … Dvojité mutanty – funkční příbuznost haploid x haploid => diploid – stejný fenotyp - identický gen - bez fenotypu – díky wt alele (různé geny) sporulace => haploid – stejný fenotyp – epistatický (funkčně příbuzné geny) - aditivní až letální (paralelní dráha, redundance, rozpad komplexu) A b C D e F A B E A b c D E F Mutageneze pomocí hydroxylaminu … hledání (screening) letálního mutanta – mutageneze kmene s vypínatelným plasmidem (promotor nebo FOA – viz plasmid shuffling) Epistatický Letální D C F Proteinový komplex Pomocí těchto genetických metod byly analyzovány metabolické dráhy … proteinové komplexy … Supresory Supresory potlačují původní fenotyp – mutace téhož genu „napraví“ původní mutaci - mutace sousedního (protein) zesílí oslabenou interakci - nadprodukce proteinu z paralelní dráhy - nadprodukce proteinu z téže dráhy A b C D E A b C D E F F A E D C F F B E Proteinový komplex Forsburg, NRG, 2001 Supresory Roguev et al, Science, 2008 High-throughput křížení Srovnání funkčních modulů (proteinových komplexů) u S.c. a S.p. Souhrn 4. přednášky •Genetické metody –Plasmidy (kvasinkové elementy) –Integrace (plasmidy, PCR, kazety) –Teplotně-sensitivní mutanty (esenciálních genů) –Tetrádová analýza –Syntetická letalita, epistase, suprese • • • Pomocí těchto genetických metod byly analyzovány metabolické dráhy, proteinové komplexy, evoluce biologických systémů … připravovány nové kmeny pro biotechnologie … řešeny otázky týkající se zdraví člověka