Souhrn předchozí přednášky
• Genetické metody
– mutageneze/“screen“
– komplementace
– identifikace
• Buněčný cyklus
– Průběh a regulace BC
– Synchronizace buněk
– Mechanismy regulace párování
– Homothalické kmeny
Cvičení: 11.12., A7 (2.17) - pláště, psací a kreslící potřeby
Mechanismy opravy poškozené DNA
Osnova přednášky
• Regulace transkripce
– Gal4 transkripční faktor
• hybridní systémy
• aplikace
– modifikované kvasinkové hybridní systémy
• Kvasinkový chromatin
• Aneuploidie a rakovina …
• Evoluce kvasinek
Regulace transkripce v haploidních buňkách
(konstitutivní)
a1, a2 + a1, a2 - transkripční faktory, které ovlivňují transkripci 3 skupin genů
a-spec.= MFA1,2 (a-feromon), STE2 (a-receptor), STE6, 14 (úprava a sekrece feromonu)
a-spec.= MFa1,2 (a-feromon), STE3 (a-receptor), STE13, KEX2 (proteasy)
haploid spec.= STE4,18 (podjednotky G-proteinu), RME1 (inhibitor meiosy)
aSG ON
aSG OFF
haploid SG ON
MAT lokus Typ buňky Geny kontrolované MAT lokusem
a haploida1, a2
a haploida1, a2 aSG OFF
aSG ON
haploid SG ON
a2
a1
diploida1, a2
a1, a2
aSG OFF
aSG OFF
haploid SG OFF
a2
a1
a2a1
a haploida1, a2 aSG OFF
aSG ON
haploid SG ON
a2
a1
Struktura promotorů
Kvasinkové promotory se liší od bakteriálních a vyšších eukaryot (kvasinky
netranskribují z takových promotorů – kvasinkové plasmidy …)
-Většina míst pro iniciaci transkripce obsahuje TC(G/A)A a PuPuPyPuPu
(specifické pro kvasinky)
- TATA box (TATAT/AAT/A) je 60-120bp od iniciačního místa (podobné Pribnowovu
boxu u bakterii)
- UAS (upstream activating sequences) a URS (upstream repressing sequences)
- DAS (downstream activating sequences – přímo v sekvenci genu)
Represor
na URS
Aktivátor
na UAS
konstitutivní
- Pouze GAL5 gen je konstitutivně exprimován (potřebný pro metabolismus glukózy)
- všechny ostatní jsou indukovány růstem na galaktóze a reprimovány glukozou
- GAL1, GAL7 a GAL10 geny jsou v klastru na chromosomu 2
- GAL4 gen kóduje transkripční faktor (aktivátor), který se váže na UAS těchto genů
Regulace metabolické dráhy galaktózy
gal mutanty
Různé kvasinky využívají různe cukry (viz přednáška o určování kvasinek)
- GAL1, GAL7 a GAL10 geny jsou v klastru na chromosomu 2
- GAL4 gen kóduje transkripční faktor (aktivátor), který se váže na UAS těchto genů
- Gal80p se váže na Gal4p a reprimuje/inhibuje transkripci
- Gal3p přemění galaktozu na induktor (váže se na Gal80p a blokuje vazbu na Gal4p)
- GAL1 promotor je rychle indukovaný a velmi silný – 1000x se zvýší mRNA (až 1%)
- používá se pro overexprese/nadprodukce proteinů
- nesmí být přítomna glukosa !
Uetz and Finley, 2005
Regulace
transkripce
GAL genů
Ren et al., Science, 2000
microarray po galaktose
Transkripční
aktivátor Gal4p
Transkripční
komplex
CO Biotech (1995) p. 59
Vznik 1-hybridních systémů
- Takto funguje např. i FASAY (Functional Analysis of Separated Alleles in Yeast)
pro testování mutantních p53 (transkripční faktor)
Různé transkripční faktory mají podobné domény a lze je kombinovat …
Lze hledat DNA-vazebné proteiny pro danou UAS sekvenci (AD-hybridní knihovny)
prof. Šmardová, Oncology Reports (2008) p. 773
mut p53 (duplikace 30bp)
kvasinka opravila
Ade2 reporter genUAS
transkripce
p53
wt
Ade2 reporter genUAS
p53
mut
- stanovení aberací p53 v klinickém materiálu - imunoanalýza, FISH, sekvenace
TP53
- určení funkčního statutu - stanovení transaktivačích schopností p53 metodou
FASAY (functional analysis of separated alleles in yeast) - stanovení
transaktivačních vlastností p53 prostřednictvím speciálně upraveného
kvasinkového kmene Saccharomyces cerevisiae yIG397
Analýza funkčních vlastností p53
luciferáza
D-luciferin + O2 oxyluciferin + světlo
Toxikologické aplikace
RECETOX/CETOCEON
(Dr. Čupr/prof. Holoubek)
Bartos et al, Env Tox, 2006
2-hybridní systém
His3
His3
His3
MaV203 kmen navíc obsahuje URA3 reporter gen – lze tedy selektovat na
uracilovou auxotrofii + reversní systém tj. mutanty disruptující interakce (na FOA)
plasmid
(TRP1)
plasmid
(LEU2)
Nature (2000) p. 623
Y
X
DBD
AD
Mat a buňky
8x12 jamek
(96 na misku)
Všechny ORF
Mat a buňky
Y
X
Reporter genGAL1 UAS
transkripceDBD
AD
Kvasinkový „INTERACTOME“
Protein
„networks“
RNA sestřih
• „high-throughput“ screen - interaktom
S. cerevisiae >30 000 interakcí (~6000
proteinů)
• podobný „high-throughput“ screen pro
lidské proteiny …
Network/síť naznačuje funkční vztahy
Tucker et al, TiCB, 2001
Reversní systém (Y2H)
- při použití URA3 reportéru lze použít toxickou 5-fluoro-orotátovou
kyselinu (5-FOA) k negativní selekci tj. interakce povede k záhubě
kvasinek, zatímco mutanty neschopné interakce na FOA plotnách
porostou (mutanty nebo syntetické látky)
TIBTECH (1999) p. 374
Huang a Schreiber, PNAS, 1997
FK506 inhibuje vazbu proteinu FKBP12 na TGFb-receptor
(životaschopnost na FOA plotnách)
Inhibitory
proteinových
interakcí
A
B
A-B
A
B
A-B
Split-hybrid systém
PNAS (1996) p. 13896
represor
bez represoru
Klasický dvojhybridní systém
Trojhybridní systém
– heterotrimerní proteinové komplexy
- posttranslační modifikace
Trojhybridní systém
- proteinový inhibitor interakce
Trojhybridní systém
– RNA interakce
- ligand/receptor
Analýza vazby protein-RNA (Y3H)
PNAS (1996) p. 8496
FEBS letters (2004) p. 7
Vazba ligand-receptor (Y3H)
FK506
PNAS (1996) p. 12817
dexamethasone
glucocorticoid receptor - FKBP12
Dihydrofolát reduktása/methotrexát
Aktivní DHFR je vytvořena
propojením dvou separovaných
částí enzymu – odbourává pro
kvasinky toxický methotrexát
Science (2008) p. 1465
CytoTrap 2-hybridní systém
Kvasinkový cdc25-2 ts mutant - hSOS (guanine exchange factor) aktivuje RAS
pokud je ukotven na membránu v jeho blízkosti
- jeden partner je myristylován a ukotven na membránu a druhý (interakční) partner
je fuzován k hSOS
Cell growthCur Biol (1998) p. 1121
Saccharomyces cerevisiae (vs S.p.)
- haploidní genom - 12Mbp, 16 chromosomů (chrI=0.22 – chrXII=1.6Mbp)
- délka chromosomu XII se u různých S.c. liší dle počtu (až 200) kopii rDNA v
repetici (9kbp), 262 tRNA, 40 snRNA,
- Krátké centromery a ARS (100bp)
- Geny (cca 6500) reprezentují 75% celkové sekvence (kompaktní)
- Redundantní (2000 genů duplikováno) – cca30% genomu vzniklo duplikacemi
- <5% genů (220) obsahuje introny (0.5% genomu),
- 3% Ty1-5 transposony (46% u člověka)
- Kondenzovaný/tichý heterochromatin: centromery, telomery a HMR/HML
Základní prvky kvasinkového genomu
Chromosom III
CEN=centromera
ARS=autosomal
replicating sequence
TEL=telomery
tRNA
Ty transposony
MAT a HML/HMR lokusy
Heterochromatin:
centromera
telomery
HMR a HML
(MAT je aktivní
určuje haplotyp)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:5213-5218.
Pozorování DNA/chromosomů u kvasinek
• Chromosomy jsou u kvasinek malé a těžko pozorovatelné – barvení DNA na
fixovaných preparátech pomocí DAPI (4 ,6-diamidino-2-phenylindole)
• Použití fůzních proteinů-GFP (green fluorescence protein) pro studium
dynamiky chromatinu (H2A, kinetochora-centromera)
• TetR-GFP represor se váže na TetO sekvence (operon) zaintegrované v
přesně definovaném lokusu
• ChIP (chromatin immune precipitation) – specifické sekvence, ChIP-seq nebo
„ChIP on CHIP“
Saccharomyces cerevisiae
Schizosaccharomyces pombe
Pozadí = mtDNA
- zahájení tvorby pupene a duplikace SPB – začátek S fáze tj. replikace
- rozchod jaderných plaků na opačné póly – přechod z S do G2 fáze
- jádro se protahuje – začátek M fáze (u kvasinek se jaderná membrána nerozpadá)
- na začátku anafáze dochází k oddělení sesterských chromatid a jejich segregaci
SPB-GFP barvení
DNA v průběhu buněčného cyklu S.cerevisiae
MT-cytoplasmatické
-jaderné
Marco et al, Cell, 2013
Orientace chromosomů v mitotickém jádře
FISH – fluorescence in situ hybridization (1992)
Tadei a Gasser, Genetics, 2012
rDNA
(repetice)
3D organizace chromosomů v S.c.
3C – chromosome conformation capture
Duan et al, Nature, 2010
Duan a spol, Nature, 2010
Chromosom XII
rDNA je mimo jádro – v jadérku
Všechny centromery jsou blízko sebe