Souhrn 4. přednášky •Genetické metody –Plasmidy (kvasinkové elementy) –Integrace (plasmidy, PCR, kazety) –Teplotně-sensitivní mutanty (esenciálních genů) –Tetrádová analýza –Syntetická letalita, epistase, suprese • • • Pomocí těchto genetických metod byly analyzovány metabolické dráhy, proteinové komplexy, evoluce biologických systémů … připravovány nové kmeny pro biotechnologie … řešeny otázky týkající se zdraví člověka sec mutanty Osnova 5. přednášky •Genetické metody –mutageneze/“screen“ –komplementace –identifikace •Buněčný cyklus –Průběh a regulace BC –Synchronizace buněk –mechanismy regulace párování –Homothalické kmeny • • • • Mutace genu - studium funkce genu – fenotyp (1. delece, 2. mutace) - - mutace přímo v genomu - mutantní kmeny se testují na citlivost k různým „toxinům“ – dále je lze křížit s funkčně podobnými geny-mutantami a hledat jejich funkční vztahy (synthetic lethal x epistatic x suprese) Buněčná stěna (stabilizující) Oprava DNA Mikrotubuly (stabilizující) ts cs Mikrotubuly (destabilizující) Bun. stěna (destabilizující) EuroFan projekt •Studium metabolických drah (URA, GAL …) •… flokulace, aglutinace (FLO, AGA …) •… sekrece, endocytózy, morfogeneze (SEC, END … ORB) •… mechanismu párování (STE …) •… vlivu záření na buňky … rad mutanty (např. RAD21, RAD50, RAD51) •… buněčného cyklu (CDC …) • • 220px-Exercise_Desert_Rock_I_%28Buster-Jangle_Dog%29_002 1mM HU.tif ředící řada WT Mut1 Mut2 rad51 mut g-záření (budova A3) sec mutanty Křížení – ověření - jedna mutace, meioticky defekt - rozdělení do komplementačních skupin (allelická kompl.) Kontrola závislosti na plasmidu na FOA plotnách Ověření pravosti (mutant+delece) X supresor na plasmidu Izolace mutant Počet mutací dnes - NGS sec, cdc, rad … PCR genom sekvenace Verde, Mata, Nurse, JCB, 1995 - mutagenese S. pombe – hledání ts mutant (55 000 kolonii) s defektní morfologií – našli 64 kmenů (3 druhy defektu: 51 kulatých=orb, 8 tip elongation aberrant=tea, 5 banana=ban) - z 51 orb mutant křížených s WT segregovalo 43 v poměru 2:2 tj. jeden gen (8 sterilních), „linkage analysis“ mezi mutantami ukázala 12 orb genů (skupin – Tab.I) ... aktinový cytoskelet (polarizovaný růstu) Nobelova cena za výzkum buněčného cyklu v roce 2001 - - Leland Hartwell začal studovat buněčný cyklus v 60.letech na S. cerevisiae. Podařilo se mu izolovat kvasinky, které měly mutovaný gen kontrolující buněčný cyklus (BC). V následujících letech identifikoval podobným způsobem více než 100 genů kontrolujících buněčný cyklus (např. CDC28). Také sledoval citlivost kvasinek na poškození DNA radiací. Zjistil, že BC je při poškození DNA zastaven – aby získal čas na opravu DNA Paul Nurse studoval buněčný cyklus na S. pombe. V 70. letech objevil gen cdc2, který je zodpovědný za regulaci většiny fází BC. V roce 1987 izoloval homologní lidský gen a nazval jej CDK1 (cyclin dependent kinase). Tim Hunt na začátku 80. let objevil první cyklin – cykliny jsou proteiny, které jsou syntetizovány a odbourávány (ubikvitinace) během určité části buněčného cyklu. Cykliny se váží na CDK a regulují jejich aktivitu. Buněčný cyklus S. pombe - nestálé diploidní buňky vstupují do meiosy hned po konjugaci (ade6-M210xade6-M216) - pro konjugaci je kritická G1 fáze jako u S. cerevisiae S.pombe má rovnocenné dělení - vznikají buňky stejné velikosti – hned vstupují do S fáze (jsou dostatečně velké) – pro vstup do mitozy musí být dvojnásobná velikost (kontrola v G2 fázi => nejdelší je G2 fáze) Buněčný cyklus S. cerevisiae -zahájení tvorby pupene a duplikace SPB – začátek S fáze -rozchod jaderných plaků na opačné póly – přechod z S do G2 fáze -jádro se protahuje – začátek M fáze (mitózy) - mikrotubuly -oddělení pupene – cytokineze – přechod z M do G1 -Oddělená dceřinná buňka je menší než mateřská – nerovnocenné dělení– pro další dělení musí dosáhnout určité velikosti => dlouhá G1 fáze Curr Opin Gen Dev 5 (1995) •Generovali teplotně-citlivé mutanty, z kterých vybírali kmeny zastavující v určité fázi buněčného cyklu (cdc = „cell division cycle“ mutanty) •Výběr dle morfologických (diagnostických) znaků charakteristických pro určitou fázi buněčného cyklu Mikrotubuly (nocodazol) Klíčovým mezníkem BC u S. cerevisiae je START, kdy se rozhoduje o přechodu z G1 do S fáze: - pro další dělení musí buňka v G1 fázi dosáhnout určité velikosti - při nedostatku živin arestuje v G1 nebo posléze přechází do stacionární fáze (vyčerpání živin) - nedostatek dusíku – růst pseudohyf - při nedostatku N a C (diploidní buňky) zastavují v G1 a zahajují sporulaci - haploidní buňky v přítomnosti partnera zastavují v G1 fázi a konjugují Shlukování - párování - morfologie kolonii Granek and Magwene, PLoS Genet (2010) Klíčovým mezníkem BC u S. cerevisiae je START, kdy se rozhoduje o přechodu z G1 do S fáze: - STARTovní interval lze rozdělit na úsek A a B - v úseku A se rozhoduje o přechodu do stacionární fáze (mutanty zastavené v této fázi nemohou konjugovat) - v úseku A hrají roli CDC25 a CDC35 (komponenty RAS dráhy - živiny) - v úseku B se rozhoduje o konjugaci či sporulaci (zastavení pomocí alfa-faktoru, nemůže být zvolena alternativa přechodu do stacionární fáze) -pro úsek B (a další „checkpoints“) je klíčový CDC28 (tj. CDK1) a příslušné cykliny A B CDC28 a cykliny u S. cerevisiae Interakce fosforylované Cdc28p s cyklinem vzniká aktivní komplex: - v G1 fázi Cln1p a Cln2p (CLN3 mRNA je konstantní) - pro vstup do S fáze jsou nutné Clb5p a Clb6p (transkripce stimulovaná CLN) - zahájení mitózy se účastní Clb3p a Clb4p - mitózu ukončují Clb1p a Clb2p a jejich degradace Nasmyth, Trends in Gen, 1998 • sce04111 Buněčný cyklus S. cerevisiae - detail - další CDC - fosforylace - ubiquitylace Checkpoints slouží buňce ke kontrole úplnosti či správnosti průběhu určité části buněčného cyklu či procesu – např. buňka nemůže nechat neopravené dvouřetězcové zlomy DNA nebo jiná poškození DNA (podle fáze buněčného cyklu opravuje různými mechanismy) Kolodner et al, Science (2002) - Více v dalších přednáškách Synchronizace S. cerevisiae buněk 800px-Yeast_lifecycle - v úseku A jsou buňky „nedorostlé“ – elutriace (centrifugace dle velikosti buněk) – tzv. G0 synchronizace - v úseku B se rozhoduje o konjugaci - za přítomnosti alfa-faktoru (krátký syntetický peptid) dochází k zastavení buněčného cyklu – G1 synchronizace - HU inhibuje syntézu nukleotidů potřebných pro replikaci – synchronizace v S fázi - nocodazol blokuje polymeraci tubulinu – schází mikrotubuly pro mitózu – G2 synchronizace - ts mutanty různých CDC genů – různé fáze buněčného cyklu G1-A G1-B G1 Párování S. cerevisiae Diploid Fůze jader konjugace Chant, Curr Opin in Cell Biol, 1996 Vybudování buněčné stěny přemosťující „shmoo“ výběžky Funkce jednotlivých proteinů v průběhu párování/matingu Ren et al., Science, 2000 KAR1 Signální dráha – a faktor Wang et al., Nature, 2004 Cdc28 Zastavení buněčného cyklu Aktivace transkripce Morfologické změny (aktin) • Ren et al., Science, 2000 ChIP on CHIP - Ste12p transkripční faktor (indukované geny) Regulace transkripce v haploidních buňkách (konstitutivní) a1, a2 + a1, a2 - transkripční faktory, které ovlivňují transkripci 3 skupin genů a-spec.= MFA1,2 (a-feromon), STE2 (a-receptor), STE6, 14 (úprava a sekrece feromonu) a-spec.= MFa1,2 (a-feromon), STE3 (a-receptor), STE13, KEX2 (proteasy) haploid spec.= STE4,18 (podjednotky G-proteinu), RME1 (inhibitor meiosy) aSG ON aSG OFF haploid SG ON MAT lokus Typ buňky Geny kontrolované MAT lokusem a haploid a1, a2 a haploid a1, a2 aSG OFF aSG ON haploid SG ON a2 a1 diploid a1, a2 a1, a2 aSG OFF aSG OFF haploid SG OFF a2 a1 a2 a1 chrIII Chromosom III obsahuje: - MAT lokus - MAT a (HMR) kazeta - MAT a (HML) kazeta - HML a HMR jsou tiché alely (heterochromatin) - Co a1, a2 + a1, a2 kódují? (transkripční faktory) HO endonukleasa – výměna kazet v MAT lokusu (rozeznává specifické sekvence) Heterothalické – stabilní Homothalické – přepínají párovací typ Chromosom III Přepínaní párovacího typu HML HMR MAT CEN Široký šikmo dolů a Široký šikmo nahoru a Široký šikmo dolů a Široký šikmo nahoru a Široký šikmo dolů a Široký šikmo nahoru a a1, a2 a1, a2 a1 a1 Chromosom III HO-endonukleasa Genová konverse HO endonukleasa rozeznává a štípe specifické sekvence Používá se pro vygenerování DSB a studium mechanismů opravy poškozené DNA umlčená kopie umlčená kopie Přepínání párovacího typu DNA z MAT lokusu je HO endonukleasou vystřižena a na její místo se překopíruje sekvence z kazety opačného páru - HO endonukleasa je exprimována pouze v mateřské buňce v G1 fázi (dceřinná si uchová původní typ) Current Opinion in Cell Biol 8 (1996) homothalické