Oprava poškodenia DNA kvasinky S. cerevisiae Peter Kolesár 20.11.2014 Ligáza Polymeráza Endonukleáza Exonukleáza Helikáza Rekombináza Rad51 Srs2 Rad27 Exo1 Cdc9 δ UV RTG Replikačná chyba Radikál O MMS Psoralén Poškodenie DNA •~ milión lézií DNA v bunke denne •Zdroje poškodenia: • 1, endogénne – chyby pri replikácii DNA • - bukový metabolizmus (kyslíkové radikály) • 2, exogénne – UV, röntgenové a gamma žiarenie (ionizujúce žiarenie) • • • • • - mutagénne chemikálie • - vírusy Typy DNA poškodení •oxidácia báz (8-oxoG, ...) •alkylácia báz (metylácia – 7-metylG, 1-metylA,...) •pyrimidínové diméry (T-T, C-C) - spôsobené UV •hydrolýza báz (deaminácia, depurinácia, depyrimidinácia) •nesprávne priradenie báz – mismatch (chyba pri replikácii DNA) •zlomy v DNA – jednovláknové / dvojvláknové (spôsobuje ionizujúce žiarenie, chemikálie) •- crosslinky v DNA (kovalentná väzba medzi dvoma vláknami DNA) • Prečo študovať DNA-opravné mechanizmy? •Rakovina - bunky majú mutácie v DNA opravných génoch → vznik množstva ďalších mutácií (v onkogénoch, tumor supresorových génoch,... ) •Kvôli narušeným DNA opravným mechanizmom v rakovinových bunkách sú tieto viac citlivé k DNA-poškodzujúcim faktorom ako zdravé bunky –Liečba: rádioterapia (ionizujúce žiarenie), chemoterapia (alkylačné činidlá, dvojvláknové zlomy, DNA crosslinky,...), špecifické inhibítory Prečo študovať DNA-opravné mechanizmy? •Rakovina - bunky majú mutácie v DNA opravných génoch → vznik množstva ďalších mutácií (v onkogénoch, tumor supresorových génoch,... ) •Kvôli narušeným DNA opravným mechanizmom v rakovinových bunkách sú tieto viac citlivé k DNA-poškodzujúcim faktorom ako zdravé bunky –Liečba: rádioterapia (ionizujúce žiarenie), chemoterapia (alkylačné činidlá, dvojvláknové zlomy, DNA crosslinky,...), špecifické inhibítory zdravá bunka rakovinová bunka + inhibítor DNA-opravný mechanizmus Prečo študovať DNA-opravné mechanizmy? •Rakovina - bunky majú mutácie v DNA opravných génoch → vznik množstva ďalších mutácií (v onkogénoch, tumor supresorových génoch,... ) •Kvôli narušeným DNA opravným mechanizmom v rakovinových bunkách sú tieto viac citlivé k DNA-poškodzujúcim faktorom ako zdravé bunky –Liečba: rádioterapia (ionizujúce žiarenie), chemoterapia (alkylačné činidlá, dvojvláknové zlomy, DNA crosslinky,...), špecifické inhibítory zdravá bunka rakovinová bunka + inhibítor bunka prežije bunka zomrie DNA-opravný mechanizmus Ako študovať DNA-opravné mechanizmy? •Ako bunka opraví DNA poškodenie P, spôsobené faktorom Fň? • 1.Ktoré proteíny / gény sa podieľajú na oprave daného poškodenia? 2.Aké je poradie proteínov / génov v opravnom procese? 3.Akú majú funkciu jednotlivé proteíny / gény pri oprave? Ako študovať DNA-opravné mechanizmy? •Ako bunka opraví DNA poškodenie P, spôsobené faktorom Fň? • 1.Ktoré proteíny / gény sa podieľajú na oprave daného poškodenia? 2. •Mutácie / delécie génov potrebných pre opravu P vedú k citlivosti buniek k Fň 1.Získať mutácie (náhodná mutagenéza / delečné knižnice) 2.Vystaviť mutantné bunky pôsobeniu Fň 3.Zistiť ktoré mutanty majú zvýšenú úmrtnosť 4. Ako študovať DNA-opravné mechanizmy? •Ako bunka opraví DNA poškodenie P, spôsobené faktorom Fň? • 1.Ktoré proteíny / gény sa podieľajú na oprave daného poškodenia? 2.Aké je poradie proteínov / génov v opravnom procese? gén A gén B gén C Ako študovať DNA-opravné mechanizmy? •Ako bunka opraví DNA poškodenie P, spôsobené faktorom Fň? • 1.Ktoré proteíny / gény sa podieľajú na oprave daného poškodenia? 2.Aké je poradie proteínov / génov v opravnom procese? •Genetická analýza: gén A gén B gén C gén A gén B gén C Médium + Fň Ako študovať DNA-opravné mechanizmy? •Ako bunka opraví DNA poškodenie P, spôsobené faktorom Fň? • 1.Ktoré proteíny / gény sa podieľajú na oprave daného poškodenia? 2.Aké je poradie proteínov / génov v opravnom procese? •Genetická analýza: gén A gén B gén C gén A gén B gén C gén A gén B gén C gén A gén B gén C Médium + Fň Ako študovať DNA-opravné mechanizmy? •Ako bunka opraví DNA poškodenie P, spôsobené faktorom Fň? • 1.Ktoré proteíny / gény sa podieľajú na oprave daného poškodenia? 2.Aké je poradie proteínov / génov v opravnom procese? •Genetická analýza: gén A gén B gén C gén A gén B gén C gén A gén B gén C gén A gén B gén C Médium + Fň gén A gén B gén C Metódy štúdia DNA opravných mechanizmov •Genetická analýza mutantov • a ich vzťahov –Analýza citlivosti mutantov na látky – spôsobujúce špecifické poškodenie DNA – –Eseje využívajúce úpravu DNA Barzel & Kupiec, Nat. Rev. Gen., 2008 Schiestl et al., Genetics, 1990 Metódy štúdia DNA opravných mechanizmov •Fluorescenčná mikroskopia • – analýza (ko)lokalizácie • DNA opravných proteínov v bunke, • ich časovej následnosti Lisby et al., Cell, 2004 Metódy štúdia DNA opravných mechanizmov •Funkcia proteínov - in vitro metódy 1.Expresia a purifikácia proteínov –Analýza biochemickej aktivity •Väzba na DNA •Nukleázová esej •Helikázová esej •Polymerázová esej –Rekonštrukcia opravných mechanizmov –Elektrónová mikroskopia • • Kolesar, unpublished Krejci et al., Nature, 2003 Reakcia bunky na poškodenie DNA Nguyen & Zhang, Genes & Dev. 2011 ENZÝMY OPRAVUJÚCE DNA •Glykozylázy –Štiepia N-glykozidickú väzbu - odstraňujú poškodené bázy ENZÝMY OPRAVUJÚCE DNA •Glykozylázy –Štiepia N-glykozidickú väzbu - odstraňujú poškodené bázy •Nukleázy – exo / endo –Štiepia fosfodiesterové väzby medzi nukleotidmi DNA. ENZÝMY OPRAVUJÚCE DNA •Glykozylázy –Štiepia N-glykozidickú väzbu - odstraňujú poškodené bázy •Nukleázy – exo / endo –Štiepia fosfodiesterové väzby medzi nukleotidmi DNA. •Helikázy –Odďelujú dve komplementárne vlákna DNA. ENZÝMY OPRAVUJÚCE DNA •Glykozylázy –Štiepia N-glykozidickú väzbu - odstraňujú poškodené bázy •Nukleázy – exo / endo –Štiepia fosfodiesterové väzby medzi nukleotidmi DNA. •Helikázy –Odďelujú dve komplementárne vlákna DNA. •Polymerázy –DNA-dependentné nucleotidyltransferázy - Syntetizujú reťazec DNA z nukleotidov. • ENZÝMY OPRAVUJÚCE DNA •Glykozylázy –Štiepia N-glykozidickú väzbu - odstraňujú poškodené bázy •Nukleázy – exo / endo –Štiepia fosfodiesterové väzby medzi nukleotidmi DNA. •Helikázy –Odďelujú dve komplementárne vlákna DNA. •Polymerázy –DNA-dependentné nucleotidyltransferázy - Syntetizujú reťazec DNA z nukleotidov. •Ligázy –Katalyzujú tvorbu fosfodiesterových väzieb – spájajú dokopy dve vlákna DNA. Spôsob opravy DNA DNA OPRAVNÉ DRÁHY •Priame zvrátenie •Oprava jednoreťazcových poškodení – BER, NER, MMR •Oprava dvojreťazcových zlomov – HR, NHEJ •Translézna DNA syntéza Priame zvrátenie (direct reversal) •Fotoreaktivácia: • pyrimidínové diméry zvráti fotolyáza (energia zo svetla) Priame zvrátenie (direct reversal) •Fotoreaktivácia: • pyrimidínové diméry zvráti fotolyáza (energia zo svetla) •Metyláciu guanínu zvráti metyl-guanín metyl transferáza (MGMT) [USEMAP] Oprava jednoreťazcových poškodení •Templát – komplementárny reťazec •Postup – vyštiepenie poškodených nukleotidov → výmena za nukleotidy komplementárne k nepoškodenému DNA vláknu • •Bázová excízna oprava (BER) •Nukleotidová excízna oprava (NER) •Oprava nesprávne zaradených báz (MMR) Bázová excízna oprava Base excision repair (BER) 1.Poškodená báza je rozpoznaná a odstránená DNA glykozylázami. Opravuje menšie poškodenia jednej bázy (oxidácia, alkylácia, deaminácia). Upravené z wikipedie Bázová excízna oprava Base excision repair (BER) 1.Poškodená báza je rozpoznaná a odstránená DNA glykozylázami. 2.Abázické miesto je rozoznané AP endonukleázou (Apn1, Apn2), ktorá rozštiepi fosfodiesterickú väzbu – vznikne jednovláknový zlom. Opravuje menšie poškodenia jednej bázy (oxidácia, alkylácia, deaminácia). Upravené z wikipedie Bázová excízna oprava Base excision repair (BER) 1.Poškodená báza je rozpoznaná a odstránená DNA glykozylázami. 2.Abázické miesto je rozoznané AP endonukleázou (Apn1, Apn2), ktorá rozštiepi fosfodiesterickú väzbu – vznikne jednovláknový zlom. 3.Chýbajúca časť je znovu nasyntetizovaná DNA polymerázou (pol δ a pol ε). Opravuje menšie poškodenia jednej bázy (oxidácia, alkylácia, deaminácia). Upravené z wikipedie Bázová excízna oprava Base excision repair (BER) 1.Poškodená báza je rozpoznaná a odstránená DNA glykozylázami. 2.Abázické miesto je rozoznané AP endonukleázou (Apn1, Apn2), ktorá rozštiepi fosfodiesterickú väzbu – vznikne jednovláknový zlom. 3.Chýbajúca časť je znovu nasyntetizovaná DNA polymerázou (pol δ a pol ε). 4.Prípadný 5´ previs DNA je odstránený flap endonukleázou Rad27. Opravuje menšie poškodenia jednej bázy (oxidácia, alkylácia, deaminácia). Upravené z wikipedie Bázová excízna oprava Base excision repair (BER) 1.Poškodená báza je rozpoznaná a odstránená DNA glykozylázami. 2.Abázické miesto je rozoznané AP endonukleázou (Apn1, Apn2), ktorá rozštiepi fosfodiesterickú väzbu – vznikne jednovláknový zlom. 3.Chýbajúca časť je znovu nasyntetizovaná DNA polymerázou (pol δ a pol ε). 4.Prípadný 5´ previs DNA je odstránený flap endonukleázou Rad27. 5.Nasyntetizovaná DNA je s pôvodnou spojená DNA ligázou. Opravuje menšie poškodenia jednej bázy (oxidácia, alkylácia, deaminácia). Upravené z wikipedie Nukleotidová excízna oprava Nucleotide excision repair (NER) Upravené z Tatum & Li, 2011 Opravuje väčšie jednoreťazcové poškodenia (pyrimidínové diméry, 6,4 fotoprodukty, crosslinky) A, globálna genomická (GG-NER) B, Transkripčne-spriahnutá (TC-NER). Nukleotidová excízna oprava Nucleotide excision repair (NER) Upravené z Tatum & Li, 2011 Opravuje väčšie jednoreťazcové poškodenia (pyrimidínové diméry, 6,4 fotoprodukty, crosslinky) A, globálna genomická (GG-NER) B, Transkripčne-spriahnutá (TC-NER). 1.Rozpoznanie poškodenia GG ≠ TC Nukleotidová excízna oprava Nucleotide excision repair (NER) Upravené z Tatum & Li, 2011 Opravuje väčšie jednoreťazcové poškodenia (pyrimidínové diméry, 6,4 fotoprodukty, crosslinky) A, globálna genomická (GG-NER) B, Transkripčne-spriahnutá (TC-NER). 1.Rozpoznanie poškodenia GG ≠ TC 2.TFIIH rozpletie DNA (helikáza). 3.Rad2 (XPG) štiepi DNA na 3´ konci poškodenia, 5´ koniec rozštiepi Rad1-Rad10 (XPF-ERCC1) komplex (endonukleázy). → Dvojité štiepenie uvoĺní krátky jednovláknový úsek (25-30 nt) DNA na ktorom sa poškodenie nachádza. Nukleotidová excízna oprava Nucleotide excision repair (NER) Upravené z Tatum & Li, 2011 Opravuje väčšie jednoreťazcové poškodenia (pyrimidínové diméry, 6,4 fotoprodukty, crosslinky) A, globálna genomická (GG-NER) B, Transkripčne-spriahnutá (TC-NER). 1.Rozpoznanie poškodenia GG ≠ TC 2.TFIIH rozpletie DNA (helikáza). 3.Rad2 (XPG) štiepi DNA na 3´ konci poškodenia, 5´ koniec rozštiepi Rad1-Rad10 (XPF-ERCC1) komplex (endonukleázy). → Dvojité štiepenie uvoĺní krátky jednovláknový úsek (25-30 nt) DNA na ktorom sa poškodenie nachádza. 4.DNA polymeráza (δ alebo ε) dosyntetizuje chýbajúcu sekvenciu. Nukleotidová excízna oprava Nucleotide excision repair (NER) Upravené z Tatum & Li, 2011 Opravuje väčšie jednoreťazcové poškodenia (pyrimidínové diméry, 6,4 fotoprodukty, crosslinky) A, globálna genomická (GG-NER) B, Transkripčne-spriahnutá (TC-NER). 1.Rozpoznanie poškodenia GG ≠ TC 2.TFIIH rozpletie DNA (helikáza). 3.Rad2 (XPG) štiepi DNA na 3´ konci poškodenia, 5´ koniec rozštiepi Rad1-Rad10 (XPF-ERCC1) komplex (endonukleázy). → Dvojité štiepenie uvoĺní krátky jednovláknový úsek (25-30 nt) DNA na ktorom sa poškodenie nachádza. 4.DNA polymeráza (δ alebo ε) dosyntetizuje chýbajúcu sekvenciu. 5.DNA ligáza Cdc9 (Ligase-I) spojí DNA. Oprava chybného zaradenia báz Mismatch repair (MMR) Upravené z Martin & Scharff, Nat. Rev. Imm., 2002 Opravuje nesprávne zaradené bázy pri chybách DNA replikácie a rekombinácie. •Rozoznáva pôvodné a novo nasyntetyzované vlákno DNA a špecificky opravuje chyby v dcérskom vlákne. • Oprava chybného zaradenia báz Mismatch repair (MMR) Upravené z Martin & Scharff, Nat. Rev. Imm., 2002 Opravuje nesprávne zaradené bázy pri chybách DNA replikácie a rekombinácie. •Rozoznáva pôvodné a novo nasyntetyzované vlákno DNA a špecificky opravuje chyby v dcérskom vlákne. • 1.MutS homológy (Msh2/Msh3, Msh2/Msh6) rozoznávajú nesprávne zaradené bázy a ohýbajú DNA v mieste poškodenia. Oprava chybného zaradenia báz Mismatch repair (MMR) Upravené z Martin & Scharff, Nat. Rev. Imm., 2002 Opravuje nesprávne zaradené bázy pri chybách DNA replikácie a rekombinácie. •Rozoznáva pôvodné a novo nasyntetyzované vlákno DNA a špecificky opravuje chyby v dcérskom vlákne. • 1.MutS homológy (Msh2/Msh3, Msh2/Msh6) rozoznávajú nesprávne zaradené bázy a ohýbajú DNA v mieste poškodenia. 2.MutL homológy (Mlh1/Pms2) sa viažu na MutS h. a štiepia dcérske vlákno (endonukleáza). 3.DNA helikáza rozpletie vlákna. Oprava chybného zaradenia báz Mismatch repair (MMR) Upravené z Martin & Scharff, Nat. Rev. Imm., 2002 Opravuje nesprávne zaradené bázy pri chybách DNA replikácie a rekombinácie. •Rozoznáva pôvodné a novo nasyntetyzované vlákno DNA a špecificky opravuje chyby v dcérskom vlákne. • 1.MutS homológy (Msh2/Msh3, Msh2/Msh6) rozoznávajú nesprávne zaradené bázy a ohýbajú DNA v mieste poškodenia. 2.MutL homológy (Mlh1/Pms2) sa viažu na MutS h. a štiepia dcérske vlákno (endonukleáza). 3.DNA helikáza rozpletie vlákna. 4.Exonukleáza (Exo1, ... ?) rozštiepi dcérske vlákno. Oprava chybného zaradenia báz Mismatch repair (MMR) Upravené z Martin & Scharff, Nat. Rev. Imm., 2002 Opravuje nesprávne zaradené bázy pri chybách DNA replikácie a rekombinácie. •Rozoznáva pôvodné a novo nasyntetyzované vlákno DNA a špecificky opravuje chyby v dcérskom vlákne. • 1.MutS homológy (Msh2/Msh3, Msh2/Msh6) rozoznávajú nesprávne zaradené bázy a ohýbajú DNA v mieste poškodenia. 2.MutL homológy (Mlh1/Pms2) sa viažu na MutS h. a štiepia dcérske vlákno (endonukleáza). 3.DNA helikáza rozpletie vlákna. 4.Exonukleáza (Exo1, ... ?) rozštiepi dcérske vlákno. 5.Vyštiepená DNA je znovu nasyntetizovaná DNA polymerázou a pripojená DNA ligázou. Oprava dvojreťazcových zlomov •Dvojreťazcové zlomy DNA sú veľmi závažným druhom poškodenia - jediný DSB môže viesť k smrti bunky alebo preusporiadaniu genómu. •Základné DSB-opravné dráhy 1.Homologická rekombinácia (HR) –Väčšinou nevedie k chybám a na opravu používa homologickú sekvenciu ako templát. –Je dominantná v S a G2 fáze (sesterská chromatída), u diploidov (homologický chromozóm). 2.Nehomologické spájanie koncov (NHEJ) –Priamo spája zlomené konce dokopy, často vedie k strate genetickej informácie. –Dôležitá hlavne v G1 fáze u haploidov. Nehomologické spájanie koncov Non-homologous end joining (NHEJ) Upravené z Altmannová et al., Biomolecules, 2012 1.Väzba MRX (Mre11-Rad50-Xrs2) komplexu, Ku heterodiméru (Yku70-Yku80) na zlomené konce DNA 2.Privolanie DNA ligázy IV (Dnl4) a jej pomocných proteínov Lif1 a Nej1. 3.Hľadanie komplementarity medzi prevismi dvoch koncov DNA. 4.Úprava koncov - syntéza DNA (Pol4 DNA polymeráza) 5.Religácia koncov 6. •pri oprave nekompatibilných koncov väčšinou dochádza k deléciám alebo inzerciám. Homologická rekombinácia (Homologous recombination - HR) Upravené z Altmannová et al., Biomolecules, 2012 1.MRX sa viaže na zlomené konce DNA. Homologická rekombinácia (Homologous recombination - HR) Upravené z Altmannová et al., Biomolecules, 2012 1.MRX sa viaže na zlomené konce DNA. 2.Nukleolytická degradácii 5’ reťazcov. •DSBR (double strand break repair) – tvorba double Holliday Junction - rozrušený Sgs1-Top3-Rmi alebo rozštiepený endonukleázami (Mus81-Mms4, Slx1-Slx4, Rad1-Rad10, Yen1). Homologická rekombinácia (Homologous recombination - HR) Upravené z Altmannová et al., Biomolecules, 2012 1.MRX sa viaže na zlomené konce DNA. 2.Nukleolytická degradácii 5’ reťazcov. 3.Väzba RPA na 3’ jednovláknové konce •DSBR (double strand break repair) – tvorba double Holliday Junction - rozrušený Sgs1-Top3-Rmi alebo rozštiepený endonukleázami (Mus81-Mms4, Slx1-Slx4, Rad1-Rad10, Yen1). Homologická rekombinácia (Homologous recombination - HR) Upravené z Altmannová et al., Biomolecules, 2012 1.MRX sa viaže na zlomené konce DNA. 2.Nukleolytická degradácii 5’ reťazcov. 3.Väzba RPA na 3’ jednovláknové konce 4.Rad52 nakladá Rad51 rekombinázu na ssDNA (Srs2 helikáza odstraňuje Rad51). •DSBR (double strand break repair) – tvorba double Holliday Junction - rozrušený Sgs1-Top3-Rmi alebo rozštiepený endonukleázami (Mus81-Mms4, Slx1-Slx4, Rad1-Rad10, Yen1). Homologická rekombinácia (Homologous recombination - HR) Upravené z Altmannová et al., Biomolecules, 2012 1.MRX sa viaže na zlomené konce DNA. 2.Nukleolytická degradácii 5’ reťazcov. 3.Väzba RPA na 3’ jednovláknové konce 4.Rad52 nakladá Rad51 rekombinázu na ssDNA (Srs2 helikáza odstraňuje Rad51). 5.Rad51-filament hľadá homologickú DNA (Rad54). 6.Tvorba D-loopu 7.Predĺženie 3´ konca filamentu (DNA polymeráza δ) •SDSA (synthesis dependent strand annealing)- novo nasyntetizované 3´ vlákno je vytlačené z D-loopu (Srs2 a Mph1 helikázy) a nasadne naspäť na druhý koniec dvojvláknového zlomu (Rad52). Nasleduje syntéza DNA (Pol δ) a ligácia. •DSBR (double strand break repair) – tvorba double Holliday Junction - rozrušený Sgs1-Top3-Rmi alebo rozštiepený endonukleázami (Mus81-Mms4, Slx1-Slx4, Rad1-Rad10, Yen1). Homologická rekombinácia (Homologous recombination - HR) 1.MRX sa viaže na zlomené konce DNA. 2.Nukleolytická degradácii 5’ reťazcov. 3.Väzba RPA na 3’ jednovláknové konce 4.Rad52 nakladá Rad51 rekombinázu na ssDNA (Srs2 helikáza odstraňuje Rad51). 5.Rad51-filament hľadá homologickú DNA (Rad54). 6.Tvorba D-loopu 7.Predĺženie 3´ konca filamentu (DNA polymeráza δ) •SDSA (synthesis dependent strand annealing)- novo nasyntetizované 3´ vlákno je vytlačené z D-loopu (Mph1 a Srs2 helikázy) a nasadne naspäť na druhý koniec dvojvláknového zlomu (Rad52). Nasleduje syntéza DNA (Pol δ) a ligácia. •DSBR (double strand break repair) – tvorba double Holliday Junction - rozrušený Sgs1-Top3-Rmi alebo rozštiepený endonukleázami (Mus81-Mms4, Slx1-Slx4, Rad1-Rad10, Yen1). Homologická rekombinácia (Homologous recombination - HR) 1.MRX sa viaže na zlomené konce DNA. 2.Nukleolytická degradácii 5’ reťazcov. 3.Väzba RPA na 3’ jednovláknové konce 4.Rad52 nakladá Rad51 rekombinázu na ssDNA (Srs2 helikáza odstraňuje Rad51). 5.Rad51-filament hľadá homologickú DNA (Rad54). 6.Tvorba D-loopu 7.Predĺženie 3´ konca filamentu (DNA polymeráza δ) •SDSA (synthesis dependent strand annealing)- novo nasyntetizované 3´ vlákno je vytlačené z D-loopu (Mph1 a Srs2 helikázy) a nasadne naspäť na druhý koniec dvojvláknového zlomu (Rad52). Nasleduje syntéza DNA (Pol δ) a ligácia. •DSBR (double strand break repair) – tvorba double Holliday Junction - rozrušený Sgs1-Top3-Rmi alebo rozštiepený endonukleázami (Mus81-Mms4, Slx1-Slx4, Rad1-Rad10, Yen1). Upravené z Altmannová et al., Biomolecules, 2012 Prelínanie opravných dráh - SSA •Single-strand annealing (SSA) prebieha ak dôjde k zlomu v mieste dlhších repetícií DNA •Na základe komplementarity dochádza k väzbe medzi dvoma reťazcami obsahujúcimi susedné repetície •SSA vždy vedie k delécii DNA sekvencie ohraničenej repetíciami •Ako prebieha oprava? Prelínanie opravných dráh - SSA Prelínanie opravných dráh - SSA Upravené z Altmannová et al., Biomolecules, 2012 •Single-strand annealing (SSA) prebieha ak dôjde k zlomu v mieste dlhších repetícií DNA (rDNA) • 1.Resekcia 5’ vlákna na koncoch zlomenej DNA ako u HR. 2.Priame nasadnutie jednovláknových 3’ reťazcov, (Rad52 a Rad59) 3.Nehomologické sekvencie na koncoch sú odstránené Rad1-Rad10 endonukleázou - NER. Štiepenie je stimulované MMR proteínmi Msh2-Msh3. 4.Syntéza DNA a ligácia. 5. •SSA vždy vedie k delécii DNA sekvencie ohraničenej repetíciou - je mutagénna. Translézna DNA syntéza Translesion synthesis (TLS) David Kowalski •Proces umožňujúci toleranciu poškodenej DNA. •Postupujúca replikačná vydlica narazí na neopraviteľné poškodenie DNA → v syntéze treba pokračovať lebo: 1.Dlhodobé zablokovanie replikačnej vidlice vedie k smrti bunky. 2.Replikácia poškodenej DNA vytvorí sesterskú chromatídu ktorá môže byť využitá ako templát pre opravu HR. 3. •Štandardné DNA polymerázy (δ, ε) sú nahradené transléznymi polymerázami, ktoré vedia vložiť bázy aj oproti poškodeným nukleotidom (pyrimidínové diméry, abázické miesto, oxidovaná, deaminovaná báza). •Niektoré TLS polymerázy zaraďujú správne bázy oproti špecifickým poškodeniam (Pol η), iné často zaraďujú nesprávne bázy (ξ, Rev1).