Kvasinky a biotechnologie Jana Kopecká 223187@mail.muni.cz Tor-Magnut Enan From Beer to Molecular Biology TTiv S'.T.'olutinn tif liutuvtrial F ACE] VERLAG HANSÍľAKl Ä Ch-c n—c o—L Principle! of Fermentaticn Technology äact-'iiJ b ililiur é. *HiT*KEfl ■nd S J HALL FOOD MICROBIOLOGY Mir otechnologie „klasická" x rekombinantní http://distillers.tastylime.net/library/lntroductiontoyeast/lntroduction_to_Yeast.htm Úvod Odhad: 670 000 druhů kvasinek 1500 známých druhů cca 30 druhu kontaminace výroby nápojů cca 20 druhu je průmyslově využíváno Rekombinantní biotechnologie • sekvenace S. cerevisiae v roce 1996 S. pastorianus v roce 2009 • snadná manipulace - podobné s bakteriemi (izolace mutantů, rychlost růstu, přítomnost plazmidu, ...) • kultivace ve fermentoru • S. cerevisiae, „R pastoris", Yarrowia Lipolytica, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, ... Kvasinkové expresní systémy • vhodná posttranslační modifikace proteinů eukaryotního původu, ale trochu jiné struktury N-glykanů —► glykozylace • možné připojení sekretorních signálů • podíl sekretovaného proteinu z celkového množství proteinů syntetizovaných buňkou u S. cerevisiae 1%, „P. pastoris" až 10% • S. cerevisiae - eutropin (Lg Chemical), Hepatitis B vakcína (Glaxosmithkline), hirudin (Aventis), insulin (Novo-Nordisk) Kultivace „P. pastoris" Komagataella pastoris • silný promotor pro alkoholoxidázu AOX - snadná indukce a regulace • vnesení genu holomogní rekombinací (stabilnější než pomocí plazmidu) • postranslační modifikace (odstranění signálních peptidů, glykozylace, tvorba disulfidových můstků) • pro expresi velkých proteinů (>50 kD) Kultivace „P. pastoris" • 3-stupňový proces: produkce biomasy (represe genové exprese) - glycerol adaptační fáze - glycerol produkční fáze - glycerol+metanol • nutná optimalizace!!! • sekretované i intracelulární proteiny • velké denzity při kultivaci • komerčně dostupný kit „P. pastoris Expression Kit" (Invitrogen) Klasické biotechnologie • výroba piva • výroba vína • výroba pečiva • výroba lihovin • SCP = single cell protein (krmná biomasa) • využití převážně S. cerevisiae Různé typy piv = různé slad kvasnice kvašení doba zrání ttp://www.pivovary-lobkowicz.cz/nase-nabidka/ Plzeňský typ - Budvar Jak se vaří pivo u nás? www.budejovickybudvar.cz Český ležák 9345 Fáze přípravy piva příprava mladina hlavní kvašení dokvášení »1; <'<4 "3 1 p %^4/; r« http://www.pivovarcernahora.cz/pivovar-a-okoli/jak-varime-nase-pivo/ Pivovarské kvasinky • kulturní kvasinky používané k produkci spodně či svrchně kvasených piv • čistá kultura - vyrovnaný tvar (kulatý, oválný), stabilní vlastnosti • technologicky odlišné druhy: S. pastorianus (spodní) a S. cerevisiae (svrchní) — hybridní, polyploidní (tri- či tetraploidní), často i aneuploidní mikroorganizmy • génom: S. cerevisiae S288c: 12 Mb, 16 chromozomů (1996) S. pastorianus W34/70: 25 Mb, 36 chromozomů, 2 subgenomy typu SC a SB, mt-genom typu SB (2009) Pivovarské kvasinky Pro každý typ piva jsou vhodné jiné kvasinky (ležák, pšeničné pivo, IPA, ale, lambic, atd.) úkírgärige Untergärige C&ergange Cbergarige Untergärige Cbergarige Weißbferhgfe Bructihčfe Kôlschhefe AWAítbierhefe Srsufcbefe Brernereíhefe (http://www.blq-weihenstephan.de/) Hlavní kvasení dle typu piva — spodní kvasení 6-12°C — svrchní kvasení 17-25°C zhruba 7 dní (spodní) (bílé kroužky, hnědé kroužky, flokulace a sedimentace kvasnic) 3 dny (svrchní) ! !jiný charakter piva pokud tank „leží" či „stojí" Hlavní kvasení - spilka Hlavní kvasení - CK tanky Hlavní kvasení - flokulace • reverzibilní schopnost kvasinek shlukovat se, tvořit větší celky (vločky, floky) • !! na konci hlavního kvašení!! • usnadňuje filtraci piva • vliv složení média, genetické výbavy kmene (asi 33 genů), teploty, stavby a morfologie buňky... etanol teplota živiny 1 faktory ovlivňující aktivitu FLO genů genotyp Vurčitého i f kmene ^a kone. míchání iontová síla faktory ovlivňující interakce buňka-buňka a aktivaci flokulinů (Verstrepen et al., 2003, upraveno) FLO geny geny FL01, FLO5, FL09, FLO 10, FLO 11, Lg-FLO kódují zymolektin gen FLO8 je transkripční aktivátor umístění blízko telomer nestabilní geny Lektinová hypotéza - flokulace • interakce lektinového typu (polysacharid - protein) • specifická vazba zymolektinu na povrchu buňky na manózové zbytky v buněčné stěně sousední buňky • ionty Ca2+ j sou přímo zapoj eny v uhlovodíkových vazbách • (dříve se mělo za to, že udržují správnou konformaci zymolektinové vazebné sítě) (Miki et al. 1982, upraveno) Flokulační fenotyp Flol - manóza senzitivní — laboratorní kmeny NewFlo - manózo/glukózo senzitivní — pivovarské kmeny — širší specifita zymolektinu — stacionární fáze růstu (Brauer et al. 2006, DOI 10.1534) Zrání piva a dokvášení • dle Stupňovitosti a typU piva!!!!! (Weißbier, IFA, Ale, Porter, ležák,...) • 3 a více týdnů za nízkých teplot (0,5-4°C) • sycení piva, dotváření chuti • CK tanky nebo ležácké tanky • autolýza kvasinek j e nežádoucí http://www.zamberk.cz/Svatkydreva/2009/ Dokvášení Dotváření chuti ležácký sud, CK tank (svisle, vodorovně) • diacetyl (typický malý obsah pro česká piva) • sycení piva C02 • pšeničná piva (4-vinyl guaiacol „hřebíček", izoamylaetát „banán", vanilin, atd.) Ethyl acetate O Phenyl ethyl acetate 0 A Ethyl caproale Isoamyl acetate 0 A Isobutyl acetate 0 A Ethyl caprylate 0^ v pivu bylo objeveno kolem 1000 různých látek, většina je senzoricky aktivní • silný charakter: říz (oxid uhličitý - vzniká kvašením) hořkost (ze chmele nebo chmelových produktů) alkoholová (alkohol - vzniká kvašením) • střední charakter: ovocná-esterová, diacetylová, po vyšších alkoholech, sladká, karamelová, DMS (dimethylsulfid), kyselá, oxidační, mastné kyseliny atd. • slabý charakter: velká škála látek; některé z nich mohou být ze střední skupiny, pokud se projevují slabě Propagace kvasnic Slaní Pre culture Pure culture Xk-lassťs Storage üü Sterile JVfclas ses Sterilization Sewage Clarification Dry* S eed Yeast Nutrients Seed Yeast Mother yeast Commercial Se paction Yeast Cream Cooling Staage Filtration Extrusion Waste |v ater Waste Water I Prying Fresh Yeast m * AHY & iVBY Paletiser Packaging www.jackzthebrewer.com Propagace kvasnic Vícenásobné použití kvasnic • kvasinky lze po hlavním kvašení tzv. sebrat a použít znovu (ne do nekonečna) + nové • kontrola kvasinek-viabilita • vliv technologických stresů (teplota, promývání, stupňovitost mladiny, atd.) • rozdíl u typů piv na požadavky !!! Kontrola kvasinek Spodní x svrchní pivovarské kvasin 5. pastorianus (spodní) — hybridní původ — hlavní kvasení při nižších teplotách (9-12°C) cca 7 dní https://microbewiki.kenyon.edu S. cerevisioe (svrchní) — hlavní kvasení při vyšších teplotách (18-22°C) cca 3 dny — tvorba ovocných příchutí v pivu http ://www. u wyo. ed u Model utváření hybridních druhů S. pastorianus a S. bayanus (Libkind etal., 2011) ale-type S. cerevisiae <8> S. eubayanus přírodní prostředí pivovarské prostředí i funkční SCti i nefunkční SULI „raný" ,.moderní" 50:50 hybrid <2> JMÍ&yJt^^U, ztráta lieterozygotniho charakteru ínová kopie v; ei II. 1-1 pravé rameno chromozomu vil), ajjgujsJojíJje a přestavby c hrom 01 oni fl buněk a uvolněni velkých fragmentů DNA ! kontaminantv pi ^"^^........-.......- transformace S- tiäyMKOtž *u hem 5. Nezávislá hybridizace S. uvarvm Odhadem více než 10 % kmenů klasifikovaných ve sbírkách jako 5. cerevisiae může být přirozeným hybridem mezi 5. cerevisiae a více či méně příbuznými druhy (Nguyen etal., 2011) Kontaminace v pivovaru • bakterie (aerobní i anaerobní) • kvasinky, které nejsou využívány úmyslně a nejsou plně pod kontrolou - non-Saccharomyces: Brettanomyces, Candida, Debaryomyces, Dekkera, Hanseniaspora, Pichia, Rhodotorula, ... omezená schopnost růstu a množení za anaerobních podmínek a zkvašování cukrů - Saccharomyces (wild yeast) - těžké odlišení produkce nežádoucích aromatických látek (fenolické), amylolytické vlastnosti - „killer kmeny" Saccharomyces - toxin; usmrcení původního kulturního kmene - RD mutanty Saccharomyces - změny, ztráty ěi delece mtDNA Klasifikace kvasinek z pivovarského prostředí Bottom fermenting brewers yeast cwisbergensfs) Top fermenting brewers yeast (Sacchamtityces cerevisiae) Strongly fermenting species Weakly fermenting species Respiratory yeasts Several strains Several strains Wild strains and variťlieK cif Sacchurotnyces cerevisiae, Sacchammyces exiguus tireiferwwyces sp,Candida intermedia, Candida kefyr, Candtda sate, Hasoaada atiomala. Kluyvemmyces taarxianus. Ktiieckera jp., Sactfiarnmycvdes ludwigii Debaryomyces hanseniir Rhodoionda sp., film forming yeasts Candida sp., ilíinsenuia sp., Pichia sp. Rozlišení kvasinek (kultury na membránových filtrech) M em brane-fí ltra tion wort agar Growth on lysine-agar or copper sulphate-agar 2 or 5 days at 28°C Growth on crystal violet agar or LWYM 2 or 5 days at 28°C Growth on WA 2 days at 37ŮC Anaerobic growth in end-fermented beer 3-4 days at 2S°C Foreign yeasts not belonging to Saccharomvces Foreign Sacchairmiyces yeasts Top fermenting culture yeasts, Foreign Saccharomvces yeasts. Foreign yeasts not belonging to Saccharomvces Superannuating yeasts (Saccharomvces c diasta(icui) Mikrobiologická „čistota" Hutzler et al. 2012, EBC Symposium Vinařské kvasinky • „čisté kvašení" kulturními kvasinkami — S. cerevisiae a S. bayanus • , ,spontánní kvašení4' — kvasinky z povrchu bobulí: Kloeckera, Hanseniaspora, Saccharomyces, Metchnikowa, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Rhodotula, Cryptococcus, Brettanomyces, Debaryomyces, Pichia, Candida... — nízká fermentační aktivita, ale na začátku kvašení dominují — tolerance jiných mikroorganizmů — Saccharomyces - schopnost dominovat Vinařské kvasinky - Saccharomyces • tolerance k S02 • kvašení do 25 °C po dobu 7-14 dnů • autolýza kvasinek přispívá k buketu vína • tolerance k alkoholu (11-14%) • nízká koncentrace zbytkových cukrů (2-5 g/l) • produkce žádoucích esterů • nízká produkce těkavých kyselin Vinařské kvasinky - Saccharomyces • nejčastěji diploidní, homozygotní a homotalické • chromozómové polymorfizmy (rekombinace Ty retrotranspozonů či subtelomerických oblastí) • geny PAU: adaptace na stresové podmínky při výrobě vína, jsou regulovány anaerobními podmínkami • jiný počet kopií genu než u laboratorních kmenů (převážně geny důležité pro kvašení: membránové transportéry, metabolizmus etanolu, geny pro rezistence, atd.) Vinařské kvasinky non-Saccharomyces převážné aerobní: Píchla spp., Debaryomyces spp., Rhodotorula spp., Candida s p p., Cryptococcus a I bid us • s nízkou fermentační aktivitou (citronkovitý tvar buňky): Hanseniaspora uvarum (Kloeckera apiculata), Hanseniaspora guilliermondii (Kloeckera apis), Hanseniaspora occidentalis (Kloeckera javanica) • s fermentativním metabolizmem: Kluyveromyces marxianus (Candida kefyr), Torulaspora delbrueckii (Candida col lieu losa), Metschnikowia pulcherrima (Candida pulcherrlma), Zygosaccharomyces balili vliv na aroma vína: terpenoidy, estery (160 esterů detekovaných ve vine), vyšší alkoholy (n-propanol, isobutanol, isoamyl alkohol, aktivní amyl alkohol;), glycerol, acetaldehyd, kyselina octová a jantarová, íš-glukozidásová aktivita (uvolnění těkavých složek z netěkavych prekurzorů), terpenoly (citronelol, nerol a geraniol) (Jolly et. al. FEMS Yeast Res, 2014) Vinařské kvasinky non-Saccharomyces Saccharomyces Sklizeň/Mošt Alkoholové kvasní Jablečno-mléčné kvašeni Zrání ČAS BĚHEM TVORBY VÍNA Fermentace vína Pekařské kvasin stálost technologických vlastností aerobní metabolizmus aglutinace a autolyza je nežádoucí (trvanlivost) cílem je zisk co nej větší biomasy (rychlé množení, bez alkoholového kvašení) Lihovarské kvaši melasové zápary vysoká tolerance k alkoholu (až 11%) a teplotě vysoká rychlost kvašení 24-48 hod o srno tolerance (využití koncentrovanějších melas) nežádoucí je aglutinace a sedimentace SCP (Single Cell protein) • S. cerevisiae - pro potravinářské účely sušení biomasy při vyšších teplotách —► přísada do polévek, omáček, masných výrobků, ... • pro krmivářské účely se využívá Saccharomyces ojediněle (většinou ke zkrmení nekvalitního droždí) • využití i rodu Candida - produkce min. 50% bílkovin v sušině, menší nároky na výživu a tolerance medií s vyšším obsahem solí Candida utilis, C. tropicalis, C. pseudotropicalis, C. robusta, C. scottii, C. ingens, C. crusei, C. mogii, C. boidinii atd. • výjimečně i ostatní kvasinko vité mikroorganizmy jako Yarrowia lipolytica, Hansenula anomala, Hansenula polymorfa, Hansenula capsulata, "Pichia pastoris " • SCP (bakterie, kvasinky) obsahuje 70-80% hm. čistých bílkovin SCP • melasa - v současné době jen ve výjimečných případech • lihovarské výpalky, sulfitové výluhy (po výrobě celulózy) nebo hydrolyzáty dřeva • „citrolouhy" (po výrobě kyseliny citrónové) • syrovátka a další "odpady" z potravinářské výroby, případně zemědělství • n-alkany • etanol, metanol - mohou být připraveny velmi čisté a získané SCP je nej vyšší kvality • mikrobní biomasa se vyznačuje vysokým obsahem nukleových kyselin (především RNA) v korelaci s obsahem bílkovin a pohybuje se v rozmezí 8-15% sušiny. Max. denní dávka pro člověka je 2 g nukleových kyselin, což odpovídá asi 20 g mikrobiální biomasy Výroba potravinářské biomasy-SCP S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae melasa + kukuřičný extrakt (odpad při výrobě kukuřičného škrobu) + anorganické látky Kultivace bez tvorby etanolu, jen produkce biomasy Kvasničné mléko — zahuštění na "^odparkách ~~ ^rozprašovací sušárna suché, neaktivní droždí odstředění na kontinuálních deskových centrifugách (přídavek do omáček, polévek, masných výrobků) kalolis droždí Kde získat informace? • Saccharomyces Genome Database — www.veastgenome.org ^ ^ SGD Gene Ontology Consortium — www, geneontolo g v. org — genomové sekvence, ale i funkční informace o genech ve spojení s jejich aminokyselinovou sekvencí odborné knihy a články Kde získat kvasinkv? - ''I'm'* ví* NCTC National Collection of Type Culures (UK) NCIMB NCIB National Collection of Industrial Bacteria (UK) DSAAZ DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen,(Nemecko) CBS Centraalbureau voor Schimmecultures (Holandsko) CCM Česká sbírka mikroorganizmů (Brno) RIBM Výzkumný ústav pivovarský a sladařský (Praha) CCDM Sbírka mlékařských mikroorganizmů NC YC National Collection of Yeast Cultures (UK) TUM Hefezentrum, Technische Universität München (Nemecko) Czech Collection of M i c r o or g a ni sm s nebo např. Pivní obchod OGAR Brno mim tuji TfC-Ni ;che UN A MÜNCHEN Forschungszentrum Weihenstephan für Brau- und Lebensmittelqualität Identifikace a rozlišení technologických kvasinek • často velice problematické!!! • produkční kmen x kontaminace • tolerance k teplotám (30 x 37°C) • mikroskopie, charakter růstu kolonií (pigment, selekční média) • využití cukrů • produkce nejrůznějších látek (diacetyl, pentadion, atd.) Identifikace a rozlišení technologických kvasinek • provozní laboratoř analýzu DNA a PCR nedělá —> spolupráce s výzkumnými ústavy, univerzitami • PCR a RFLP metody - ITS region, HIS4 gen, ... • RFLP mtDNA • karyotypizace Multiplex PCR pro v současné době platné druhy rodu Saccharomyces dmhově Specifické prímery (Muiretal.,2011,FEMSYeastRes:552-563) M - marker 1 - S. cerevisiaeT 2 - S. bay anus1 3 - S. arboricola? 4 - S. mikatae7 5 - S. kudriavzeviF 6 - S. paradoxus7 1 - S. pastorianusT 8 - negativní kontrola S. eubayanUST (primery dle Pengelly a Wheals, 2013, FEMS Yeast Res:156-161) Real time PCR (Hutzler, 2010) systém pro rozlišení spodních a svrchních pivovarských kvasinek LRE1; UG 300, OG; OG-Wein) (UG identifikace spodních pivovarských kvasinek na základě úseku mtDNA tok 1 nm i m - .ib 1 t* ■«yr BBS 19» n i i b » LU li H li IB 20 H 20 Jí H U H it JB «1 U S, pastoríanus {UGJ W 34/70, W66/70 -[HUF H» hal row ' b - iflUťľMuui ít] !rr tí n n ■ d n m ti w » s. cerewróe (OG) W 68, W 210 mjuu UH nm ■j SMt 1 41111 m * J _ _ -■ r-r -n r- 99 ta m m « es j [i 31 1 n j* ne a 42 :ojxi L mot I i iirv E lHII»iI!i(llEh»It(l