C9320 Metody biochemického výzkumu
Nukleární Magnetická Rezonance
Organizace cvičení
Sraz 8:00 v koridoru před budovou A4. Teoretická příprava v NMR seminární místnosti Praktické cvičení u spektrometru
vyučující:
Pavel Srb
Biomolekulární NMR spektroskopie budova A4, dveře 2.26
tel. +420 54949 2674 email: srb@ncbr.muni.cz
Pracovní úkol
1. Stanovení hmotnostní koncentrace alkoholů ve vzorku
2. Semikvantativní analýza 2D 1H-15N spektra proteinu
3. Určení oligomerního stavu proteinu z relaxace jader 15N
1   Teoretický úvod
Pomocí jaderné magnetické rezonance - NMR1 - pozorujeme magnetické momenty jader atomů, které souvisí s jejich celkovým momentem hybnosti nazývaným jaderný spin. Zatímco spinová kvantová čísla jednotlivých protonů a neutronů jsou právě rovna jedné polovině, jádra mohou být složena z několika takových částic: skládání spinu všech nukleonů a jejich orbitálních momentů se projeví jako celkový spin jádra s kvantovým číslem l, které nabývá nezáporných celočíselných násobků jedné poloviny. V organických látkách se nejčastěji měří takové izotopy, jež mají jednopolovinový spin: sem patří zejména vodík 1H, uhlík 13C, dusík 15N či fosfor 31P.
Průmět vektoru spinu I do zvolené osy nemůže nabývat libovolných hodnot: pro částici s celkovým spinovým kvantovým číslem l - čili I2 — h2l(l + 1) - je povoleno pouze 21 + 1 různých projekcí, potažmo magnetických kvantových čísel
Všechny tyto směry vektoru spinu jsou za nepřítomnosti elektromagnetického pole rovnocenné a odpovídají stejné energetické hladině. Vložíme-li však takovou částici do magnetického pole, odstraníme degeneraci stavů příslušících různým číslům m a jejich energie se rozštěpí na 21 + 1 úrovní. NMR se zabývá přechody mezi těmito stavy atomových jader, které doprovází absorpce či vyzáření fotonu v radiofrekvenčním pásmu.
1.1    Pozorování různých jader: rezonanční frekvence
Rozdíl mezi těmito energiemi pro dvě sousední čísla m (která se liší o 1) činí (viz. 1)
Frekvence fotonu, který může vyvolat přechod mezi sousedními energetickými hladinami jádra, neboli rezonanční frekvence je proto
zkratka anglického spojení nuclear magnetic resonance
(1)
AE = hrjB.
(2)
1
-1—
O 11.74
magnetické pole Bq [T]
Obrázek 1: Zeemanovo štěpení hladin pro spinové číslo m — ^
Jádro	Spin I	7/2tt [IO'T^s"1]	v [MHz]	Přirozený výskyt izotopu [%]
	1/2	26,75	500,0	99,985
2H	1	4,11	76,8	0,015
13C	1/2	6,73	125,8	1,108
14N	1	1,93	36,1	99,63
15N	1/2	-2,71	50,6	0,37
31p	1/2	10,84	202,6	100,0
Tabulka 1: Spiny a gyromagnetické poměry vybraných izotopů a příslušné rezonanční frekvence v magnetickém poli 11, 7 T
Součinitel této úměrnosti 7 se nazývá gyromagnetický poměr a liší se pro různá jádra; jeho velikosti pro NMR aktivní jádra významná v biochemickém výzkumu jsou uvedena v tabulce 1.
Z uvedeného je zřejmé, že pomocí NMR je možné pozorovat různá jádra ve zkoumané molekule. Technicky je třeba pouze zajistit aby excitace i detekce NMR signálu byla prováděna na příslušné frekvenci (viz. čtvrtý sloupec Tabulky 1)
1.2   Popis jednoduchého experimentu NMR. Signál volné precese
Při popisu NMR experimentu je klíčové zavést makroskopickou magnetizaci M jako vektorovou sumu všech jaderných magnetických momentů obsažených ve vzorku (typicky 500 /il kapaliny). Magnetizace je v nulovém vnějším magnetickém poli nulová. Po vložení vzorku do magnetického pole dojde k ustanovení rovnovážného stavu, který je tvořen mírnou převahou magnetických momentů s magnetickým spinovým číslem m — | (nižší energetická hladina) nad spiny s m — — \ (vyšší energetická hladina). Rozdíl v populacích těchto dvou hladin odpovídá Boltzmannovu rozdělení N_i/Ni — exp— « 0.999914 tj. na jeden milion spinu jich jen asi 86 přebývá navíc na nižší energetické hladině.
Máme tedy vzorek vložený do homogenního magnetického pole B0 ve směru osy z. Aplikací dalšího radiofrekvenčního magnetického pole s indukcí Bi rotující v rovině kolmé na osu z s kruhovou rychlostí uj\ je možné měnit orientaci vektoru jaderné magnetizace vzorku. Magnetizace M bude konat jednak precesi kolem směru Bi, dvak precesi kolem osy z způsobenou odklonem magnetizace od rovnovážného směru.
Uhel sklopení magnetizace M od osy z je přímo úměrný délce trvání pulsu t a na jeho amplitudě B\\
a — jBit. (4)
Volbou času t získáme pulsy, které stočí magnetizaci do roviny kolmé na osu z (jr/2- nebo 90°-pulzy ) či změní její orientaci "hlavou dolů"- (ir- nebo 180°-pulsy).
Základní měřící technikou pulsní spektroskopie NMR je sledování signálu volné precese2. Jedním 90°-pulsem je magnetizace sklopena do roviny xy kde následně preceduje kolem směru pole Bq (ležícího v ose z). Precesním pohybem magnetických momentů se na detekční cívce indukuje napětí, které představuje již zmiňovaný signál volné precese (viz. Obr. 2).
Ze zaznamenaného průběhu napětí, tedy časové nahrávky souboru frekvencí, na kterých pozorovaná jádra precedují, lze poté pomocí Fourierovy transformace získat spektrum těchto frekvencí. Spektrum nese kvantitativní informaci o tom kolik spinu (které ve vektorové sumě tvoří magnetizaci M) na dané frekvenci preceduje. Analýzou informací obsažených ve spektru se zabývá oddíl 1.4.
2/ree induction decay, bývá označován zkratkou FID
2
Obrázek 2: Schéma jednoimpulsového experimentu NMR
1.3 Návrat k tepelné rovnováze: Relaxace
Pro další pochopení mechanismů vedoucích k obnovení tepelné rovnováhy je užitečné zavést podélnou M|| a příčnou M±_ magnetizaci. Složky magnetizace mají následující vlastnosti:
• M|| odpovídá magnetizaci ve směru magnetického pole Bo, tedy v ose z
• M±_ odpovídá magnetizaci v rovině kolmé na směr magnetického pole Bo (rovina xy)
• v tepelné rovnováze je M\\ maximální, M±_ je nulová
• experimentálně pozorujeme pouze M±_
Vrať me se k obrázku 2. Pozorovaný pokles intenzity signálu souvisí s tím, že příčná magnetizace Mj_, která byla maximální po skončení pulsu, nabude své rovnovážné (tj. nulové) hodnoty. Tento relaxační proces je možné charakterizovat časovou konstantou T2, tzv. příčnou relaxační dobou.
Důležité je, že zatímco Mj_ už nabyla své rovnovážné hodnoty, M|| zatím nikoliv. Proces relaxace M|| do tepelné rovnováhy je obecně pomalejší a je charakterizován časovou konstantou Ti, tzv. podélnou relaxační dobou. V praxi často užíváme převrácené hodnoty relaxačních dob - relaxační rychlosti (Ri — T^1, kde i e {1, 2} ).
Informace o procesech vedoucích k obnovení tepelné rovnováhy ve spinovém systému mají pro NMR přinejmenším dvojí význam. Kvalitativní znalost rychlostí těchto procesů pro danou studovanou molekulu (popř. směs molekul) je nutná pro správné technické provedení příslušných experimentů. Pečlivé kvantitativní studium relaxace daného jádra (souboru jader daného typu -např. uhlíku 13C ve skupině CH3-, nebo dusíku 15N ve skupině -NH- ) pak poskytuje informaci o rotačním pohybu molekuly jako celku ( tzv. globální reorientace molekuly). V biochemii je významnou aplikací studium relaxace jader 15N v páteři proteinové molekuly, které kromě globální reorientace poskytuje informaci o lokální pohyblivosti, kterážto je často důležitá pro pochopení funkce příslušného proteinu.
1.4 Interpretace NMR spektra 1.4.1    Chemický posuv
Spektroskopie NMR využívá skutečnosti, že rezonanční frekvence je citlivá na velikost magnetického pole v místě jádra. Ta je totiž ovlivněna jeho blízkým okolím, elektrony v molekulách přispívají k hodnotě magnetické indukce na jádře, mohou tedy zvyšovat či snižovat její velikost oproti vnějšímu magnetickému poli Bq. I jádra stejných izotopů na různých pozicích v molekule tak často rezonují na frekvencích, které se od sebe mírně liší (typicky o stovky až tisíce Hz).
3
Tento jev se nazývá chemický posuv. Z praktických důvodů se u spekter na vodorovné ose vynáší tento frekvenční rozdíl v relativních jednotkách ppm3.
(5)
Frekvence vq přísluší rezonanci standardu, kterým pro vzorky rozpustné ve vodě obvykle bývá DSS - 3-(Trimethylsilyl)propan-l-sulfonová kyselina. Frekvenční osa se z historických důvodů zpravidla zobrazuje tak, že posun ô roste zprava doleva.
Chemické posuny ve spektrech 1H (mluvíme také o protonových spektrech) v kapalinách leží přibližně v rozmezí 0 — 15 ppm. Signály jednotlivých zbytků (CH3-, -CH2-,-OH, -NH-) se vyskytují v typických rozmezích, což analýzu spekter usnadňuje.
K rozlišení signálů dvou nebo několika jader s velice podobným chemickým posuvem je třeba dbát na to, aby pole Bo v prostoru vzorku dosahovalo co nejlepší homogenity a časové stability; současné spektrometry umožňují relativní přesnosti řádu min. 10-9. 4
1.4.2   Původ štěpení signálů: Skalární interakce
Na spiny jader nepůsobí jen vnější magnetické pole Bo a pole indukované elektrony v obalech (způsobující chemický posun), nýbrž také magnetické pole vytvořené jinými jádry v okolí. Toto pole je nezávislé na vnějším poli Bo a jeho velikost se proto udává přímo v jednotkách frekvence (Hz). ^
Přímé působení jaderných dipólových momentů přes prostor je velice silnou interakcí, která se ve spektrech kapalných vzorků přímo neprojevuje, protože její vliv je vystředován k nule díky rychlé reorientaci molekul v roztoku. Tato interakce však i v kapalinách poskytuje silný tzv. relaxační mechanismus umožňující návrat excitovaného systému k termodynamické rovnováze.
Nepřímo spolu jaderné spiny mohou interagovat skrze vazebné elektrony.Interakci lze tedy pozorovat pouze mezi jádry spojenými chemickými vazbami. Tato tzv. skalární nebo J-interakce se s rostoucím počtem vazeb mezi jádry zeslabuje a obvykle ji nepozorujeme přes více než 3 vazby.
Evidentním projevem J-interakce ve spektru je štěpení spektrálních čar: každé jádro se spinem 1/2 v dosahu J-interakce zapříčiní rozdělení na dvě čáry (dublet). Konkrétněji, pokud se v sousedství skupiny CH3 nachází např. skupina CH2 pak signál methylové skupiny bude štěpen na triplet. Vysvětlení je následující: methyl " vidí" všechny možnosti stavů spinu ve skupině svého souseda - tedy skupiny CH2, viz Tabulka 2. Počet možností odpovídá poměru intenzit
počet možností	uspořádání spinu
1	t t
2	i t
1	i i
Tabulka 2: Štěpení signálu skupiny CH3 v sousedství skupinyCFÍ2
jednotlivých signálů v multipletu. Obdobnou analýzou je možné dospět k závěru, že signál skupiny CH2 sousedství skupiny CH3 (bez dalších interakcí) bude kvartet s intenzitami v poměru 1:3:3:1.
3z anglického parts per million, tedy 10 6
4tj. při nosné frekvencích ve stovkách MHz bychom měli být schopni rozlišit rozdíl <1 Hz
2   Návod k pracovním úkolům
2.1    Stanovení objemové koncentrace alkoholů ve vzorku
Analýzou počtu, štěpení a plochy signálů přítomných v ID 1H spektru vzorku alkoholu určete počet a molární koncentraci jednotlivých druhů alkoholů přítomných ve zkoumaném vzorku.
Získané číselné hodnoty molárních koncentrací přepočtěte na koncentrace hmotnostní. Diskutujte zdravotní (ne)závadnost zkoumaného vzorku.
2.1.1 Postup
1. importujte textový soubor s 1H NMR spektrem do tabulkového editoru.
2. nakreslete graf sloupce intensity. Jako typ grafu zvolte XY bodový s rovnými spojnicemi (tedy bez jednotlivých bodů)
3. ve spektru nalezněte oblasti signálů příslušných skupin a tyto signály zintegrujte (tj. pomocí funkce suma spočtěte součty příslušných buněk)
4. při analýze integrálních intenzit nezapomeňte, že poměry intenzit ze stejné molekuly musí odpovídat počtu jader 1H v jednotlivých skupinách, tedy: je-li integrální intenzita EtOH (CH3) — 3, pak pro EtOH (CH2) musí být 2, jelikož skupiny příslušné obsahují 3 resp. 2 jádra 1H.
5. údaje o skupině EtOH (CH2) už pak dále nepotřebujeme, protože oba tyto signály pocházejí ze stejné molekuly ethanolu a jejich OH skupina je tudíž společná.
6. doplňte Tabulku 3.
7. dále spočtěte příspěvky jednotlivých molekul od integrální intenzity skupiny OH. Uvažte vzájemný poměr intenzit skupin obsahujících stejně vodíkových atomů (EtOH (CH3) a MeOH (CH3)) a také fakt, že molekula vody obsahuje dvě skupiny OH.
8. doplňte Tabulku 4.
skupina	hrubá   int. intenzita	normalizovaná int. intenzita
EtOH (CH3)		3
MeOH (CH3)		
EtOH (CH2)		
OH		
celkem		
Tabulka 3: Zjištění integrálních intenzit signálů z 1H NMR spektra vzorku slivovice. Do druhého sloupce tabulky vepište hodnoty zjištěné sumací příslušných buněk. Do třetího sloupce přepočítejte intenzity tak, aby intenzita ch3 skupiny ethanolu byla rovna 3 (předvyplněná hodnota).
molekula	příspěvek	molární	hmotnostní
	do intenzity skupiny OH	c[%]	c[%]
EtOH (CH3)	1		
MeOH (CH3)			
H20			
celkem			
Tabulka 4: Výpočet koncentrací ethanolu a methanolu ve vzorku slivovice. V této normalizaci pak odpovídá příspěvek ethanolu k intenzitě signálu OH roven 1 (předvyplněná hodnota).
5
2.2 Semikvantitativní analýza 2D 1H—15N spektra proteinu
V dvoudimenzionálním 1H-15N korelovaném spektru molekuly proteinu pozorujeme signály takových jader vodíku 1H, která mají za nejbližšího souseda jádro 15N. Takovéto spinové systémy se v uniformě 15N značených proteinech vyskytují zejména v páteři molekuly a dále pak v postranních řetězcích některých aminokyselin (tryptophan, asparagin, glutamin, arginin).
Využijte následujících empirických pozorování k tomu abyste k zadanému 2D 1H-15N korelovaném spektru přiřadili tu nejpravděpodobnější ze zadaných primárních sekvencí peptidu:
1. signály NH skupiny postranního řetězce tryptophanu mají zvláště vysoký chemický posun v obou spektrálních dimenzích
2. signály NH2 skupin asparaginu a glutaminu se vyskytují v pravé horní části spektra a jsou zdvojené (pozorujeme dvojici signálů se stejným chemickým posuvem v 15N dimenzi). Každá dvojice odpovídá jedné skupině NH2.
3. jako pomocné kritérium lze použít signály jader 15N glycinu, které se často vyskytují v horní části spektra (malý chemický posun v 15N dimenzi).
2.3 Určení oligomerního stavu proteinu z relaxace jader 15N
Proložením zadaných experimentálních dat exponenciální závislostí
1(f) = Aexp(-Rií), (6) kde íe{l,2}ai je amplituda signálu, určete relaxační rychlosti R\ a i?2- Využitím vztahu
experiment 1 n -^2      — /—\
° 4tti/n V Rl
kde je rezonanční frekvence jader 15N v Hz (v magnetickém poli o intenzitě 11.74 T je vj^ rovno 50.7 MHz), určete odhad globálního korelačního času T™Periment; který popisuje isotropní globální reorientaci molekuly. Ze zadané molekulové hmotnosti a využitím
Tmonomer(ns) _ Q.6MW(kDa) (8)
získejte odhad globálního korelačního času odpovídajícího monomerní jednotce proteinu. Vztah 8 poskytuje hodnotu tq přímo v nanosekundách (ns). Diskutujte oligomerní stav molekuly ve
experiment mc
tc a tc
světle získaných odhadů globálních korelačních časů T®xPeriment o ^monomer
3 Odkazy
1. http://www.protein-nmr.org.uk/solution-nmr/spectrum-descriptions/lh-15n-hsqc/
2. http://technology.sbkb.org/portal/page/199/
3. http://www.nmr2.buffalo.edu/nesg.wiki/NMR_determined_Rotational_correlation_ time
6
A   Dodatek k řešení úloh
A.l Gnuplot
A. 1.1    Základní informace
Instalační balíky pro windows i linux, stejně jako manuál a příklady použití jsou k nalezení na adrese gnuplot.info.
A.1.2   Práce s GNUplotem
Doporučeným způsobem použití GNUlotu je tzv. dávkový mód, kdy v nějakém oblíbeném textovém editoru vytvoříme skript s příkazy, které chceme provést, a tento pak zavoláme buď z GNUplotu příkazem load "název souboru", nebo z příkazové řádky pomocí gnuplot nazev_souboru. V interaktivním režimu naopak můžeme spouštět příkazy rovnou.
A.1.3     Nejdůležitější příkazy:
1. plot plot sin(:r)
plot "data.dat" using 1:3 with lineš lw 2 title "brand new curve"
2. set se používá k nastavení všemožných vlastností objektů např.: set out "vystup.ps"
set xlabel "délka [m]"
3. help se hodí velmi často, například help set prozradí jaké všechny parametry lze nastavit.
4. fit provede proložení dat zadanou funkcí kterou je třeba předtím definovat, stejně jako počáteční hodnoty fitovaných parametrů
fit f(x)  "soubor.dat" u 1:3 via parl,par2
A.1.4   Příklady skriptů
1. vykreslení dat ze souboru s výstupem do souboru postscript (ps) set terminal postscript eps color enhanced
set output "vystupni_obrazek.ps" set xrange [zleva:doprava] set yrange [zdola:nahoru] set xtics 5 out set mxtics set grid
set ylabel "popisek osy y"
plot "soubor.sdaty"u 1:2 w 1 lw 2 lc rgb "red"title "název křivky"
2. fit funkcí zadaného tvaru
set terminal postscript eps color enhanced
set output "vystupni_obrazek.ps"   f(x)= a*exp((x-b)**2/c)
a=100; b=5; c=115;
fit f(x) "data.dat"using 1:3 via a,b,c plot "data.dat"u 1:3 w points ps 5 "a*exp((x-b**2)/c)"title "fit funkci f"
A.1.5    GNUplot skript k řešení úlohy 2.3
A=0.5; R=0.001;
f(x)=A*exp(-x*R);
fit f (x) "datovy_soubor.DAT" u 1:2 every ::4 via A,R plot "datový_soubor .DAT"u 1:2 every ::4 , A*exp(-x*R)
Tento skript provede proložení dat ze souboru datový .soubor. DAT monoexponenciálně klesající funkcí f (x) =A*exp (-x*R). Soubor se skriptem otevřete v editoru Notepad (nebo v nějakém podobném editoru ASCII souborů) a proveďte následující změny:
• nahraďte  datovy_soubor.DAT v obou jeho výskytech ve skriptu aktuálním názvem souboru
• pro litování relaxační rychlosti Ri zvolte první a druhý sloupec (u 1:2), pro R.2 pak první a třetí (u 1:3)
Takto upravený skript zavolejte potom z příkazové řádky GNUplotu příkazem load "jmeno_skriptu.pripona".
Pozor, nezapomeňte se přepnout do adresáře, ve kterém se nachází skript i datový soubor — ve Windows pomocí záložky ChDir ( Linuxu si spusťte GNUplot přímo z příslušného adresáře).
Po doběhnutí skriptu se v hlavním okně GNUplotu (popř. v souboru fit .log) lze dočíst nafitované hodnoty relaxační rychlosti i?i,2, které pak použijeme dále dle návodu k úloze 2.3.
7