(Strukturní) biologie – exp. techniky
1 nm 1 µm 1 mm
buňkyorganely
biomolekuly Protein. „stroje“
NMR, RTG
kryoEM elektronová mikroskopie
AFM konvenční mikroskopie
Oblasti rozlišení metod a velikostní škály objektů
NMR, RTG
Studium 3D struktur: sonda + vzorek
Sonda:
• (viditelné světlo ?)
• RTG záření
• vlny/částice: elektrony
• radiofrekvenční vlny
Vzorek:
• (bio)molekuly v roztoku - NMR
• (bio)molekuly zmražené v ledu -kryoEM
• (bio)molekuly uspořádané v krystalu - RTG
Studium 3D struktur proteinů
Z roztoků
PDB NMR
2001 : 2 a ¼ tisíce
2008 : 7 a ½ tisíce
2013 : 8 a ½ tisíce
Krystaly
RTG difrakční techniky
Přes 12 tisíc
44 a ½ tisíce
Přes 72 tisíc
Odhad: většina struktur přinejmenším globulárních proteinů
(proteinů s dobře určenou terciární strukturou = výsledky CD)
bude určována difrakcí RTG záření i v budoucnu.
Studium 3D struktur: RTG+NMR
RTG
RTG
Difrakční
obraz
Krystal: shodně
orientované molekuly
NMR
RF
RF
Resonance
H0
V roztoku
RTG krystalografie - postup
(0.) Příprava rekombinantního
proteinu, čištění, zahušťování…
1. Krystalizace
2. Difrakční experiment
3. Fázový problém, příprava
modelu
4. Zpřesňování modelu
Krystaly
Krystal – periodicky uspořádaná látka
Opakování motivu:
• posun
• rotace
Krystal (bio)polymeru
• oblast polymeru
• oblast rozpouštědla
Čistota + stabilita vzorku
Krystalizace proteinů
• Difůzní techniky
• Fázový graf
Krystalizace proteinů
Problém:
Jak „rychle“ vypěstovat
„použitelný“ krystal?
• Empirie – sady roztoků
• Souběžné experimenty
• Malé (nanolitrové) objemy
=> nasazeni robotiky