•Proteiny – struktura a funkce –Proteiny – primární, sekundární a terciární struktury –Skládání proteinů •Protein-proteinové interakce –Typy PPI –Vliv PTM na PPI •Funkční proteomika •Proteinové interakce – domény, typy vazeb, interaktom •komplexom Souhrn přednášky - interaktom Souhrn - protein-proteinové interakce •proteiny jsou troj-rozměrné - mají různé tvary a více domén => mají mnoho vazebných míst na povrchu => komplexy a “sítě“ •části proteinů/domény interagují s doménami partnerů –domény mají určitou strukturu, která do značné míry determinuje tvar jejího povrchu, ale … –charakter (hydrofobicitu, polaritu, náboj) povrchu určují postraní řetězce aminokyselin směřujících do solventu, takže … –interakce proteinu je determinována povrchem, který musí mít tvar i charakter komplementární s interakčním partnerem (typy interakcí: …) + polá hydrofob rní ní - Protein-proteinové interakce •stabilní (velké plochy, většinou součástí komplexů) •přechodné/slabé (součást dynamických procesů – předávání signálů, modifikace) •posttranslační modifikace mohou změnit vazebné vlastnosti povrchu (fosforylace, ubiquitinace, SUMO) •souhrn proteinových interakcí = interaktom •(modularita díky interakcím domén – různé kombinace domén • - různé „(re-)wiring“ komplexů) > Bader et al, FEBS Lett, 2008 Inhibice interakcí (virovými proteiny, mutacemi) vs. nové interakce Srovnání interaktomů => konzerv. interakcí (=> evoluce komplexů => evoluce organismů ) Interaktom x komplexom Wang et al., Nature, 2004 transkripce MAPk net_image_e_KM1JswPh7sCX_dw a g b k kk kkkk kkk scaf TF TF k - proteiny jsou si blízko vs difuze - koordinované předávání signálů, substrátů … - moduly místo jednoho proteinu Jaké jsou výhody komplexů? –Proč skládat komplexy z menších podjednotek? –skládání funkčního komplexu na specifickém místě (toxin je transportován jako rozpustný monomer a poté se skládá => stává se toxickým až mimo původní buňku) 220px-Sucrose_porin_1a0s bakteriální toxin porin v mitochondrii –Proč skládat komplexy z menších podjednotek? –skládání funkčního komplexu na specifickém místě (toxin je transportován jako rozpustný monomer a poté se skládá => stává se toxickým až mimo původní buňku) –skládání i rozpad komplexů je snadněji kontrolovatelné, reversibilní (protože podjednotky asociují skrze množství relativně slabých interakcí - nízká energie) 220px-Sucrose_porin_1a0s bakteriální toxin porin v mitochondrii –Proč skládat komplexy z menších podjednotek? –skládání funkčního komplexu na specifickém místě (toxin je transportován jako rozpustný monomer a poté se skládá => stává se toxickým až mimo původní buňku) –skládání i rozpad komplexů je snadněji kontrolovatelné, reversibilní (protože podjednotky asociují skrze množství relativně slabých interakcí - nízká energie) –velký komplex (homo-oligomer) může být kódován relativně krátkou genetickou informací 220px-Sucrose_porin_1a0s bakteriální toxin porin v mitochondrii –Proč skládat komplexy z menších podjednotek? –skládání funkčního komplexu na specifickém místě (toxin je transportován jako rozpustný monomer a poté se skládá => stává se toxickým až mimo původní buňku) –skládání i rozpad komplexů je snadněji kontrolovatelné, reversibilní (protože podjednotky asociují skrze množství relativně slabých interakcí - nízká energie) –velký komplex (homo-oligomer) může být kódován relativně krátkou genetickou informací –menší pravděpodobnost defektní makromolekuly (menší gen => méně mutací + dá se relativně snadno vyhnout chybám – odstraní/degraduje se pouze jedna poškozená menší podjednotka => méně energie než pro nápravu celé struktury) 220px-Sucrose_porin_1a0s bakteriální toxin porin v mitochondrii –Proč skládat komplexy z menších podjednotek? –skládání funkčního komplexu na specifickém místě (toxin je transportován jako rozpustný monomer a poté se skládá => stává se toxickým až mimo původní buňku) –skládání i rozpad komplexů jsou snadněji kontrolovatelné, reversibilní (protože podjednotky asociují skrze množství relativně slabých interakcí - nízká energie) –velký komplex (homo-oligomer) může být kódován relativně krátkou genetickou informací –menší pravděpodobnost defektní makromolekuly (menší gen => méně mutací + dá se relativně snadno vyhnout chybám – odstraní/degraduje se pouze jedna poškozená menší podjednotka => méně energie než pro nápravu celé struktury) –komplexy mohou být dynamičtější (flexibilnější) –– evoluční výhoda modulů –(nový komplex vzniká –záměnou podjednotek) 220px-Sucrose_porin_1a0s bakteriální toxin porin v mitochondrii Gavin et al., Nature, 2006 Izolace komplexů z kvasinky Saccharomyces cerevisiae 2 PCNA – moduly PCNA je „jádrem“ pro mnoho „attachments“ tj. s mnoha funkčními moduly -Loading -Sliding -Termination -Buněčný cyklus -TLS a oprava DNA -Chromatinizace … - - Clamp loader – RFC-PCNA Kelch et al, BMC Biol, 2012 150-SlidingClamps_3u5z_open Clamp sliding – PCNA-Pold click me Po skončení syntézy „lagging strand“ metylovaný Fen1 (flap endonucleasa) odštěpí RNA primer (demetylace a fosforylace disocuje Fen1) Poté PCNA asociuje s Lig1 (ligásou), která spojí cukrfosfátovou kostru PCNA-Fen1 -> PCNA-Lig1 Zheng a Shen, J Mol Cell Biol, 2011 Gao a spol, Mol Cell, 2012 Model for post-translational modifications that mediate the interaction between FEN1 and PCNA, and thus regulate the dynamic actions of FEN1 in processing of Okazaki fragment maturation. The Pol δ/PCNA complex drives the gap filling and formation of the flap structure in Okazaki fragment mutation. Methylated FEN1 is recruited to the replication fork by interacting with PCNA, replacing Pol δ. Methylation of FEN1 ensures its interaction with and stimulation by PCNA to remove the flap structure. After DNA flap cleavage, FEN1 undergoes de-methylation and subsequent phosphorylation, leading to FEN1 dissociation from the DNA nick. DNA Lig I is then recruited by interaction with PCNA and seals the nicks between the two Okazaki fragments. PCNA asociuje s CAF1 (chromatin assamby factor) a pomáhá znovunavázání histonů (nukleosomů) a vzniku chromatinu Dohke et al, Genes to Cells, 2008 Ransom et al, Cell, 2010 Figure 3. PCNA – regulace buněčného cyklu Analýza PPI PCNA naznačila mechanismus … p21 je upregulován nádorovým supresorem p53 Maga et al, FASEB J, 2004 Figure3E Freudenthal et al, NSMB, 2010 Pokud je DNA poškozená, pold se zastaví a je třeba poškození nejdříve opravit – jednou z možností je „zastoupení“ jinou polymerásou, která poškozené místo „toleruje“ a překopíruje (translesion synthesis) – přepíná se ubiquitylací PCNA (na „zadní straně“) - TLS polymerasy (h, i, k) obsahují PIP a UBM motivy pro interakce s Ubi-PCNA Bergink & Jentsch, Nature, 2009 Sale et al, JCS, 2012 Oprava DNA: PCNA-ptm TLS polymerasy (h, i, k) obsahují UBM (správně přečtou chybu a zařadí správnou bázi) Srs2 (antirekombinása) obsahuje SIM (nedovolí rekombinaci v průběhu replikace) Template switch The PCNA switchboard in S. cerevisiae: regulation of competition between bypass pathways. The DNA sliding clamp PCNA is a trimer, but for clarity only one subunit is shown as being modified. In practice, the PCNA trimer could have three different modifications simultaneously, either the same modification on all three subunits or any combination. PCNA can be modified at K164 with either ubiquitin, which is added by Rad6 and Rad18, or by SUMO, which is added by Ubc9 (the SUMO E2) and Siz1 (a SUMO E3 ligase) (Ulrich, 2009). Monoubiquitin facilitates the recruitment of the TLS polymerases to PCNA through interaction with the ubiquitin-binding domains found in Rev1 and Rad30 (polη) and hence promotes TLS (Bienko et al., 2005). Alternatively extension of the monoubiquitin with a K63-linked chain promotes template switching by a poorly understood mechanism (Hoege et al., 2002). SUMOylation of PCNA at K164 in S. cerevisiae, recruits the antirecombinogenic helicase Srs2 that displaces Rad51 from single-stranded DNA and prevents the initiation of classical recombination (Papouli et al., 2005; Pfander et al., 2005). SCJ, sister chromatid junction. Replikace DNA (video): DNA helikasa “denaturuje” dvoušroubovici (modrá) – připojen je „clamp loader“ (šedá tlapka) - 2 raménka drží DNA polymerásy (fialové) spojené s PCNA („sliding clamp“, zelená). „Leading strand“ je syntetizován kontinuálně zatímco „lagging strand“ musí být primásou (žluto-zelená) odstartován (RNA primer = žlutý – Okazakiho fragmenty). PCNA zvyšuje procesivitu DNA polymerás Kelch et al, BMC Biol, 2012 Liljas a spol. Pouze některé části byly vykrystalizovány (zbylé části doplněny dle EM) Jak funguje ATPasová pumpa? PDB: 1C17:A Image pumpa obsahuje arginin, který předává proton/vodík aspartátu Rastogi & Girvin, Nature, 1999 pumpa obsahuje arginin, který předává proton/vodík aspartátu (ve vodném prostředí by byl negativně nabitý, ale v prostředí lipidické membrány nikoli). Dochází k neutralizaci náboje – otočka. Liljas, Structural Biology (kniha) pumpa obsahuje arginin, který předává proton/vodík aspartátu (ve vodném prostředí by byl negativně nabitý, ale v prostředí lipidické membrány nikoli). Dochází k neutralizaci náboje – otočka. ATPsynthase „ATP syntasa je jedním z divů molekulárního světa“. Je to dvojitý molekulární motor – „nanostroj“ – vyrábějící většinu ATP (energie). Molekula měsíce v prosinci 2005 Rastogi & Girvin, Nature, 1999 F0 je protonový rotor (uložen v membráně) poháněný tokem vodíkových iontů (z dýchacího řetězce) přes membránu. Tento rotor je spojen s druhým F1 chemickým motorem poháněným ATP (nebo vyrábějícím ATP). Oba rotory jsou spojeny statorem. ATP syntasa – ukázka kompletní struktury – ve skutečnosti se točí „modré“ části a modulují „červený“ generátor Molekula měsíce v prosinci 2005 Rastogi & Girvin, Nature, 1999 PDB: 2WPD F1-rasmol Při otočce osa tlačí na F1 motor (3 různé konformace) – levý panel = konformace vhodná pro vazbu ADP - pravý panel = ATP molekula byla vytlačena Liljas, Structural Biology (kniha) in vitro průkaz otáčení rotoru Alberts MBoC, 2002 + Mitochondrie od BioVisions Shrnutí •Proteiny interagují silně (stabilní komplexy) nebo slabě (přechodné/dynamické komplexy) • •Stabilní komplexy (ATPasová pumpa) –Podjednotky jsou často koexprimovány (koexprese je vzájemně stabilizuje, lepší rozpustnost) –stabilní komplexy disociují proteolyticky –pokles hladiny jednoho proteinu má za následek pokles hladiny ostatních podjednotek •Dynamické komplexy (PCNA) –Interakce podjednotek dynamických komplexů jsou modulovány např. posttranslačními modifikacemi CG030 – Struktura a funkce proteinových komplexů (v jarním semestru) Doc. Jan Paleček gen -> protein -> interakce -> komplex -> superkomplex … (molekulární stroj) -> kompartment -> buňka … genom -> proteom -> interaktom -> komplexom -> … fenom (funkce v buňce -> funkční znak v mnohobuněčných organismech) ~800 komplexů v S.c. Bertero et al, Cell, 2010 Kvíz – zapište komplexy či „molekulární stroje“, které jste zahlédli během videoprojekce Molecular machinery of life: http://www.youtube.com/watch?v=ztXiU3c3poM ATPase Nuclear pore ATPasová pumpa Jaderný pór Ribosom Cytoskelet proteosyntéza ribosom (mRNA, tRNA) transport váčku po cytoskeletu (mikrotubuly, kinesin/dynein) Nukleosomy Replikace replikace (helikása, primása, DNA polymerása, PCNA) nukleosomy Anafaze Průběh mitózy (mikrotubuly, chromosomy) C9041 – Struktura a funkce eukaryotických chromosomů Prof. Jiří Fajkus CG030 – Struktura a funkce proteinových komplexů Doc. Jan Paleček O kterých komplexech se dozvíte v přednášce … •Více o komplexech – metody analýzy … •DNA-proteinové komplexy –enhanceosom –nukleosom –… •Proteasom, ubikvitinace … •Evoluce komplexů … CG030 – Struktura a funkce proteinových komplexů Doc. Jan Paleček