Rychlá cytologická metoda – studium fází mitózy Roztlakové preparáty Materiál: kořenové špičky rostlin Definice meristému • v raném vývoji embrya se dělí všechny buňky • později je dělení buněk omezeno pouze na malé oblasti, ve kterých si buňky zachovávají embryogenní charakter a schopnost dělení (apikální meristémy = primární meristémy – kořene, prýtu) jejich činností vznikají nové buňky, které po diferenciaci vytvářejí rostlinné tělo • sekundární meristémy – kambium a felogén – axilární meristémy Charakteristika meristematických buněk • malé, izodiametrické buňky • tenká primární buněčná stěna • velké jádro (jádro-plazmový poměr) • velká hustota protoplastu – malé vakuoly Buněčný cyklus mujweb.cz/Veda/biologie/b.%20cyklus.htm. I (interfáze): doba, kdy se buňka připravuje na dělení, tj. G1, S a G2 fáze G0 fáze: buňka se nedělí, je součástí pletiva G1 fáze (z ang. gap = mezera): na buňce není pozorovatelné co se v ní děje, probíhá syntéza RNA a bílkovin S (syntetická) fáze: syntéza DNA G2 fáze: syntéza bílkovin pro vznik a dělení jádra (histony a mikrotubuly) M fáze (mitóza): nepřímé dělení jádra C fáze (cytokineze): dělení celé buňky Regulace buněčného cyklu = základní proces utváření architektury rostlin Plant Cell, Vol. 14, 11, 2002, www.plantcell.org Podélný řez apexem stonku Coleus příklad stavby a lokalizace apikálního meristému prýtu a axilárního meristému Apikální meristém kořene u lnu (Linum sp.) vlastní meristém klidové centrum (QC) kořenová čepička kolumela = sloupek, střední část kořenové čepičky Buňky apikálního meristému kořene hrachu setého (Pisum sativum) Barviva pro barvení v rychlých cytologických metodách • přírodní karmín - červec nopálový (acetokarmín) orcein - lišejníky (Lecanora, Roccella) (laktopropionový orcein) hematoxylin - dřevo kampešky (Haematoxylon campechianum) syntetická nigrosin krystalvioleť Feulgenova nukleární reakce (s leukobazickým fuchsinem) Karmín kyselina karmínová Dactylopius coccus Cochineal, Natural Red 4, C.I. 75470 Orcein archil, orchil, lacmus, litmus a C.I. Natural Red 28, (E121) červené v kyselém pH, modré v alkalickém pH Mitotické jedy • halogenové deriváty aromatických uhlovodíků (pdichlór benzén, α-bróm naftalén, 8-hydroxychinolin) • alkaloidy (kolchicin, vincristin) • herbicidy (oryzalin) Rostlinné alkaloidy a herbicidy • kolchicin • vincristin • oryzalin Obecný postup předpůsobení • fixace Carnoy, Farmer • macerace • roztlačení • barvení acetokarmín, laktopropionový orcein • projasnění levulózový sirup, glycerol HCl fixačně-macerační směs Fixačně-macerační směs Dostál J. (VÚOK Průhonice) • 1 díl 96% etanolu • 1 díl normálního butanolu • 1 díl ledové kyseliny octové • 1 díl konc. HCl (35 – 36%) • 4 díly destilované vody Pracovní postup Materiál: kořeny Allium cepa L. bez předpůsobení – fáze buněčného cyklu ● odběr naklíčených kořenů ● fixace a macerace v činidle ● izolace kořenové špičky ● barvení laktopropionovým orceinem ● rámování lakem na nehty předpůsobení v hydroxychinolinu – narušení cytoskeletu ● inkubace kořenů v v 0,02 M roztoku hydroxychinolinu ● odběr naklíčených kořenů ● fixace a macerace v činidle ● izolace kořenové špičky ● barvení laktopropionovým orceinem ● rámování lakem na nehty roztlakový preparát Allium cepa Laktopropionový orcein Olympus BX-51 procházející světlo Olympus BX-51 DIC