Bi4170: Optické kontrastní a zobrazovací metody 2. Pozorování v zástinu Fázový kontrast podzim 2015 https://encrypted-tbn2.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcTkasO44KpeYJpLmec60WsusR5XxtRSnzo8FmKLJmiqx3Y HLUJfEg Nízký nebo téměř žádný kontrast u biologických objektů •Biologické objekty je obvykle obtížné pozorovat ve světelném mikroskopu kvůli nízkému nebo téměř žádnému kontrastu. •Komponenty buňky a pletiva jsou většinou průhledné a bezbarvé, protože neobsahují látky (pigment) pohlcující světlo a vytvářející oblasti s různou světelnou intenzitou - kontrast. Využití rozdílů v indexu lomu Barvení objektů Kombinace Metody zesilující kontrast obrazu http://www.olympusmicro.com/primer/images/darkfield/radiolarians.jpg http://www.olympusmicro.com/primer/images/darkfield/radiolarians.jpg •Přivření kondenzorové clony nebo snížení kondenzoru (vede sice ke zvýšení kontrastu, zároveň se ale snižuje rozlišení a ostrost obrazu) •Mikroskopování v temném poli („darkfield microscopy“) (Používá se pro zviditelnění nebarvených průhledných vzorků, které mají index lomu podobný jako okolní médium) •Polarizační mikroskopie (umožňuje zviditelnit struktury, jejichž stavební materiál se vyznačuje dvojlomem) •Fázový kontrast •Fluorescenční mikroskopie •Diferenciální interferenční kontrast (DIC, Nomarského DIC) •Konfokální mikroskopie • • • Zdroj obrazku: http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/darkfield.html Podtrhnuté metody lze ukázat a vyzkoušet Bright field Nomarski DIC Phase contrast Ultrasonically trapped cells imaged with different contrast modes: Bright field (a), phase contrast (b), dark field (c), digital image processing of the bright field (d), differential interference contrast (e) and dual-color fluorescence (f). The cells in (a)–(d) are COS-7 cells, and in (e)–(f) a human B cell. • http://pubs.rsc.org/en/content/articlehtml/2012/lc/c2lc40757d http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/basics/images/contrastfigure1.jpg http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/basics/contrast.html Darkfield: Temné pole •výhodou darkfield je, že vidíte detaily, které nejsou normálně vidět, protože se od nich odráží světlo •do držáku filtrů na kondenzoru se umístí neprůhledná clona http://www.microscopyu.com - Výhodou darkfield je že vidíte detaily, které nejsou normalne videt, protože se od nich odrazi svetlo. -snadno lze tohoto osvetleni dosahnout tim, ze se do drzaku filtru na kondenzor umisti neprůhledná clona. (Nejdůležitější je mít to dost velké, aby se zastavilo veškeré světlo jdouci přímo do objektivu) dark-field· illumination (därk′fēld′) the illumination of the field of a microscope by directing a beam of light from the side so that the specimen is seen against a dark background osvětlení pole mikroskopu tak, že se nařídí paprsek světla ze strany tak, aby byl vzorek světla vidět na tmavém pozadí Pouze světlo, které se odráží objekty ve vzorku pak dosáhne objektivu. Silnější objektivy jsou mnohem obtížnější, protože jejich NA je často příliš vysoká. NA vašeho kondenzoru by měl být vždy vyšší než NA objektivu. Pokud stop patch-8, 10, 12 a 15 mm jsou vyrobeny - nemůžete nic pokazit. Pro objektivy okolem 10x - střední velikosti ukazují to nejlepší obraz. Je to velmi snadné, aby se osvětlení temné pole sami. Co musíte udělat, je umístit neprůhledný překážku do kondenzátoru. Snadný způsob, jak je snížit kousek černého papíru a položil ho na filtr v filterholder. Si můžete dát zastavit na kus plechu jasné acetátu. Můžete dokonce zkusit nakreslit zastavit na tom s černou barvou. Nejdůležitější je mít to dost velké, aby zastavit veškeré světlo jde přímo do cíle. Pouze světlo, které se odráží objekty ve vzorku dosáhne cíle pak. Silnější cíle jsou mnohem obtížnější, protože jejich NA je často příliš vysoká. NA vašeho kondenzátor by měl být vždy vyšší než NA cíle. Pokud se zastaví patch-8, 10, 12 a 15 mm jsou vyrobeny nemůžete pokazit, opravdu. Pro cíle v okolí x10 střední velikosti ukázat to nejlepší. Máte-li rádi, aby se patchstop co nejpřesněji: Nejlepší způsob, jak je nastavit jako normální (ve světlém), vyjměte okuláru a uzavírají / otevírají přídavným duhovky, dokud není * jen * viditelné. Pak buď ohýbání krku více než dvojnásobek, nebo opatrně vyjměte chladič, změřte průměr clony, jak je nyní nastaven. Posuvným měřítkem je užitečné zde. Tento průměr je, že za opravu zastávky. Velmi často, aby se na bezpečné straně to je nejlepší přidá asi 10% této částky, zabrání se tím úniku, zvláště pokud nemáte prostředky centrování zastávka v držáku filtru. Máte-li kondenzátor fázového kontrastu, která je největším annuli fázového kontrastu často dělají vynikající patch zastávky pro temné pole! --- Angl.: It is very easy to make darkfield illumination yourself. What you have to do is place an opaque round stop in the condensor. An easy way is to cut a piece of black paper and put it on a filter in your filterholder. You can put the stop on a piece of clear acetate sheet. You can even try to draw the stop on it with black paint. The most important thing is to have it big enough to stop all light going directly into the objective. Only the light that is reflected by the objects in the sample reaches the objective then. Stronger objectives are more difficult because their NA is often too high. The NA of your condensor should always be higher then the NA of the objective. If patch-stops of 8, 10, 12 and 15mm are made you can't go wrong really. For objectives of around x10 the middle sizes prove best. If you like to make the patchstop as precise as possible: The best way is to set up as normal (brightfield), remove the eyepiece and close/open the substage iris until it is *just* visible. Then, either bending your neck over double, or carefully removing the condenser, measure the diameter of the iris diaphragm as it is now set. A pair of calipers is useful here. This diameter is that for the patch stop. Very often, to be on the safe side it is best to add about 10% to this figure, this avoids leakage, especially if you have no means of centering the stop in the filter holder. If you have a phase contrast condensor, the largest phase contrast annuli often make excellent patch stops for darkfield! Darkfield microscopy - Pozorování v zástinu •Jednoduchá technika pro zobrazení průhledných vzorků, které nejsou barveny •Lepší/ jasnější viditelnost •Lze použít na stereo mikroskopech nebo i na biologických mikroskopech s vysokým rozlišením •Vhodné pro pozorování drobných objektů: prvoci, houbové spory, pylová zrna, bakterie, rostlinná pletiva http://haki.hu.cz/local/fotogalery/eko/6.jpg http://haki.hu.cz/local/fotogalery/eko/5.jpg Zdroj obr.: haki.hu.cz Podstata mikroskopie v temném poli neboli zástinu spočívá v tom, že do roviny objektu vstupují z kondenzoru pouze okrajové, velmi šikmé světelné paprsky, zatímco středové paprsky jsou pohlceny a při zobrazení se neuplatní. Objekt je tedy osvětlen jen ze stran, paprsky se od něj odrážejí a lámou. Do objektivu vstupují jen paprsky odražené od povrchu objektu a ten proto září v temném poli. Pro mikroskopii v temném poli se používají kondenzory opatřené centrální clonou. Účinnější jsou však speciální zrcadlové kondenzory, které mají lépe korigovanou otvorovou vadu a poskytují kvalitnější temné pole, např. preparační výměnný kondenzor (C. Zeiss Jena) s číselnou aperturou 0,8. Tento kondenzor umožňuje vysunutím centrální clony přeměnit rychle osvětlení z temného pole na světlé. Při použití objektivů vysokých číselných apertur, především objektivů imerzních, se pro tmavé pole užívají imerzní kardioidní kondenzory, jejichž čelní čočka se spojuje se spodní stranou preparátu imerzním olejem. Tyto kondenzory mají vnitřní číselnou aperturu 1,05. Číselná apertura objektivu musí být vždy menší než apertura použitého kondenzoru, jinak dochází ke vzniku osvětlení ve světlém poli. Proto jsou pro temné pole zvlášť vhodné objektivy opatřené irisovou clonou, umožňující snížit jejich aperturu tak, aby pole bylo optimálně temné. Předpokladem kvalitního zobrazení v temném poli je přesné nastavení osvětlení podle Koehlerova principu a silný tok světla, neboť jeho podstatná část není systémem k zobrazení využita. Při chybném nastavení jsou části předmětu (preparátu) osvětleny jednostranně. Pro mikrofotografii v temném poli se užívá citlivější, měkčeji pracující film, který umožňuje kratší dobu expozice a zmírňuje nadměrný kontrast obrazu. Metoda se používá pro pozorování drobných objektů a jejich povrchových struktur, např. prvoků, houbových spor, pylových zrn, bakterií, ale i rostlinných pletiv aj. Srovnání zástinu, invertovaného obrazu a světlého pole • http://www.microbehunter.com/wp/wp-content/uploads/2009/darkfield2.jpg Invertovaný obraz Parapharyngodon echinatus Parapharyngodon echinatus Bez názvu-2.jpg Bez názvu-1.jpg •http://media.wiley.com/mrw_images/cp/cpmc/articles/mc02a01/image_n/nmc02a0109.jpg Figure spirochéty lymeské boreliózy, Borrelia burgdorferi objektiv 20× a revolverový kondenzor s dark-field clonou http://www.darkfieldliveblood.com/uploads/6/0/5/1/6051367/2278486.jpg?1310441218 •http://www.darkfieldliveblood.com/uploads/6/0/5/1/6051367/2278486.jpg?1310441218 krev Princip Figure •Do středu zdroje světla je umístěna neprůhledná kruhová překážka. •Světlo se dostává ke vzorku ze strany a tím zvyšuje kontrast. •Přímá cesta světla je blokována, pouze šikmé světelné paprsky mohou dosáhnout vzorku •Kontrastní obraz je vytvořen rozptýlenými paprsky, které prošly čočkou •Výsledný obraz se zdá být téměř podsvícený. Zdroj obr.: http://www.currentprotocols.com/WileyCDA/CPUnit/refId-mc02a01.html Tvorba temného pole pomocí: •A) multifukčního kondenzoru vybaveným dark-field clonou •B) kardioidního kondenzoru (cardioid condenser) • Figure Prevzato z: http://www.currentprotocols.com/WileyCDA/CPUnit/refId-mc02a01.html Kardioidní kondenzor má konkávní a konvexní zrcadlo •http://www.olympusmicro.com/primer/java/darkfield/abbe/index.html Darkfield ring http://wodumedia.com/wp-content/uploads/23-Bladderwort-bladder-Utricularia-gibber-photographed-with -the-darkfield-method-and-magnified-40x-by-Jose-R.-Almodovar-at-the-Microscopy-Center-Biology-Depar tment-650x487.jpg Obr. clony: http://www.microbehunter.com/wp/wp-content/uploads/2009/darkfield1.jpg Obr. organismu: (Utricularia gibber) http://wodumedia.com/wp-content/uploads/23-Bladderwort-bladder-Utricularia-gibber-photographed-with -the-darkfield-method-and-magnified-40x-by-Jose-R.-Almodovar-at-the-Microscopy-Center-Biology-Depar tment-650x487.jpg „domácí“ dark field •Mikroskopie temného pole lze snadno dosáhnout umístěním mince mezi zdroj světla a kondenzor. • http://microscopetalk.files.wordpress.com/2010/06/home_made_dark_field.jpg Nastavení: Aby mince pracovala správně, musíte vycentrovat minci tak, že světlo přichází zpoza jejích okrajů rovnoměrně ze všech stran. Pohybem kondenzoru nahoru a dolů se upraví obraz tak, aby vzorek nebyl ani ve tmě ani ve světle. Vzorek by měl být vidět tak, aby příliš nezářil. Zdroj obrázku a postupu na výrobu: http://microscopetalk.wordpress.com/tips/home-made-dark-field-microscopy/ „domácí“ dark field •Neprůhledný terč lze vyrobit také z černého papíru, kartonu, plastu (nebo použít malé mince) •Nalepený na sklo nebo plexisklo jej umístit do nosiče clon pod kondenzorem. Velikost neprůhledného terče je pro každý objektiv jiná •(postup výroby clony je na www.olympusmicro.com/primer/techniques/darkfield.html) • „Domácí“ dark field do zvětšení 100x •Vzorek umístit tak, aby nebyl zespoda ozařován žádným světlem •Vypnout všechna zabudovaná světla •Zamířit světlo o vysoké intenzitě shora nebo ze strany http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/microscopy/lowmagdf.gif http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/microscopy/highmagdf.gif z pitvacího mikroskopu ze složeného mikroskopu Zdroj: http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/microscopy/dfield.html •Focení v Dark Field: •Klasické nastavení fotokamery je navrženo na normální světelné podmínky. Bohužel ty jsou příliš světlé na fotografování temného pole. •Doporučení: snížit na automatu kompenzaci expozice na -2. „domácí“ dark field Obr. bez použití kompenzace expozice. Pozadí se jeví příliš světlé. http://microscopetalk.files.wordpress.com/2010/06/daphnia_molt_6.jpg?w=300&h=225 http://microscopetalk.files.wordpress.com/2010/06/daphnia_molt_0.jpg?w=300&h=225 https://encrypted-tbn1.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcQmpPheh3gfVwUDI9y7GWzyWoayu8fSrsI-WtndHc-Krrw aoMhg Zdroj obrázku a postupu focení: http://microscopetalk.wordpress.com/tips/home-made-dark-field-microscopy/ •http://www.pmbio.icbm.de/mikrobiologischer-garten/pics/hefe_darkfield.jpg Kvasnice http://www.pmbio.icbm.de/mikrobiologischer-garten/pics/hefe_darkfield.jpg http://www.scienceprojectlab.com/image-files/csp_001_polichetae.jpg •http://www.scienceprojectlab.com/image-files/csp_001_polichetae.jpg Mořský mnohoštětinatec, 40x •http://i.dailymail.co.uk/i/pix/2012/04/10/article-2127311-12866E8D000005DC-501_964x568.jpg plankton Fight night: The method used to capture the creatures is called 'dark field microscopy', which leaves the background pitch black •http://www.clemson.edu/cafls/jhif/flowchart/files/darkfield.jpg Motýlí sosák 20x http://www.clemson.edu/cafls/jhif/flowchart/files/darkfieldhigh.jpg •http://4.bp.blogspot.com/_Ne3bhx2j74s/S4LmgY_a4kI/AAAAAAAACCE/phf4GfiADo0/s400/difflugia3IMGP2191_ edited-1.jpg Difflugia (rozlitka) Amoebozoa - měňavkovci » kmen Tubulinea - lalokonozí » řád Arcellinida - krytenky •http://blogs.answersingenesis.org/blogs/creation-museum/files/2011/12/december5.jpg Copepoda (klanonožci) - larva http://4.bp.blogspot.com/_Ne3bhx2j74s/S4LmgY_a4kI/AAAAAAAACCE/phf4GfiADo0/s400/difflugia3IMGP2191_e dited-1.jpg http://blogs.answersingenesis.org/blogs/creation-museum/files/2011/12/december5.jpg •profimedia.cz https://encrypted-tbn1.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcSinkRKa-MldUhVg93Ns9B2jonKMAo64POxLapUgEz0wIi H3egEPg https://encrypted-tbn1.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcReHGcaL8q5L21mqFCb7Nc3eeVv4mtxLeVmVnDDeGkkCyZ T-v2c https://encrypted-tbn3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcSKuRvMz3rVNonEccxr8gW5QTx3lkesPs4i4Dhx17o_afC qhZwZ https://encrypted-tbn3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcQMMfGdQ1XEC2j8mgOAnkYAoP6Pn1Y1Xr6CgbQGWhsRpwO vOkRY https://encrypted-tbn2.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcSyM-N4m6nSu_4fVOk2BbqV-fNBLgCng63y5BRKEaCvnzQ 0HsEl6w https://encrypted-tbn0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcQZPBHGsbwh-mlO55VeEYuDm4eoWhK7W_vJKejHHHAQbc1 zxtMEog https://encrypted-tbn2.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcQhu0BITH_9Y8tddpHoIxZKEVev7LayX-KVWEeNqtN6hUd qycbS https://encrypted-tbn0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcQi0ZnAI6nnjM_G2bOELOQxSOso2P5bm3a8hR8WK-1Sgjb k3S0BAQ https://encrypted-tbn3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcRSejG1lGSTr0p6DSGmnyp52-4RZp4IrvghXX0nms0dfJK HJPhW https://encrypted-tbn0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcQxEMaoQ9_Q_mDrhSv8wVTiIW0G8f5v54Wi9t6xgebZE1- 7K3iD https://encrypted-tbn1.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcRefF04QVLYzJV62nsYLspba_PbFGE94OVu940IqUhlhST K1pX4Mg Temné pole se hodí na dokumentaci mnoha objektů http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/phasecontrast/images/phasepaths.jpg Fázový kontrast •Frits Zernike (1888 – 1966) •nizozemský fyzik; 1935 •1953 Nobelova cena za fyziku za vypracování metody fázového kontrastu a za konstrukci fázově kontrastního mikroskopu. http://filavaria.punt.nl/upload/zernike.jpg http://www.philateca.com/thumbs/stamp_8202.jpg http://cdn.c.photoshelter.com/img-get/I0000bhxKFk2CiZ8/s/750/750/Radial-and-Pennate-Diatoms-phase-c ontrast.jpg http://cdn.c.photoshelter.com/img-get/I0000bhxKFk2CiZ8/s/750/750/Radial-and-Pennate-Diatoms-phase-c ontrast.jpg • 1948 – 1955 obdobím největšího rozkvětu aplikací fázově – kontrastní mikroskopie Podstatou je převedení rozdílů v posunu fáze světla procházejícího různými části objektu, které nevidíme, na rozdíly v intenzitě světla, kterou můžeme pozorovat. Zdroj znamka: http://filavaria.punt.nl/upload/zernike.jpg Zdroj schema: http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/phasecontrast/images/phasepaths.jpg Proč fázový kontrast? • • mají určitý kontrast a větší nebo menší měrou absorbují světlo • vzhledem ke svému okolí nejeví změnu absorpce světla, od svého okolí se liší jen malou změnou indexu lomu • posunují pouze fázi světelné vlny; lidské oko není citlivé na změnu fáze vlnění Použitý zdroj: http://kfrserver.natur.cuni.cz/studium/prednasky/mikro/ppt/4_mikroskop2.pdf http://www.sci.muni.cz/kfar/html/fazovy_kontrast.pdf : Většina mikroskopů v biologii umožňuje pozorování pouze takových objektů, které mají určitý kontrast a větší nebo menší měrou absorbují světlo. Tyto objekty vlastně mění amplitudu procházejícího vlnění a jsou tedy nazývány objekty amplitudové. V přírodě však existuje mnoho objektů, které vzhledem ke svému okolí nejeví změnu absorpce světla, protože se od svého okolí liší jen malou změnou indexu lomu. Takovéto objekty jsou označovány jako objekty fázové, protože posunují pouze fázi světelné vlny. V běžném mikroskopu v procházejícím světle nejsou takové objekty dobře pozorovatelné, protože lidské oko není citlivé na změnu fáze vlnění. Fázové objekty můžeme tedy pozorovat buď tak, že je s použitím různých metod obarvíme – a převedeme tak na objekty amplitudové, což ale vyžaduje usmrcení buněk (a je možný vznik artefaktů) nebo pro pozorování živých buněk použijeme zařízení pro fázový kontrast Fáze vlny je bezrozměrná veličina, která určuje vztah charakteristické veličiny vlny (například výchylky, akustického tlaku nebo magnetické indukce) k danému místu a času a ke stavu charakteristické veličiny vlny v časovém a prostorovém počátku. Pozorování fázových objektů •obarvíme je – tj. převedeme na objekty amplitudové (vyžaduje usmrcení buněk a je možný vznik artefaktů) •pro pozorování živých buněk použijeme zařízení pro fázový kontrast (transformaci fázové změny na změnu amplitudy) • http://www.microeguide.com/images/Phase%20Contrast0.jpg v ohniskové rovině kondenzoru se nachází prstencovitá clona a v ohniskové rovině objektivu fázová deska s fázovým prstencem. Video z: http://www.youtube.com/watch?v=8FqdWScrzo8 Obr vpravo: http://www.microeguide.com/images/Phase%20Contrast0.jpg Princip fázového kontrastu •přeměna fázové změny vlnění (vzniklé po průchodu fázovým objektem) na změny intenzity světla • • • A) v ohniskové rovině kondenzoru se nachází prstencovitá clona C) v ohniskové rovině objektivu se nachází fázová deska s fázovým prstencem vymezuje dutý kužel světla dopadající na objekt B) Dvě optické dráhy: 1) osvětlující objekt a beze změny procházející preparátem v místě bez objektu (na obrázku žlutá barva) 2) procházející objektem, jehož dráha a fáze je ovlivněna právě průchodem objektem posune fázi světla, které prošlo beze změny preparátem v místě bez objektu (osvětlení pozadí objektu) o ¼ vlnové délky D) následuje interference paprsků těchto dvou optických drah ve střední obrazové rovině http://kfrserver.natur.cuni.cz/studium/prednasky/mikro/mscope/DIC/fk.htm Oddělení přímého a difrakčního vlnění •nejvýraznější fázový kontrast vzniká, pokud je fázový rozdíl obou vlnění roven ¼ vlnové délky Princip fázového kontrastu •Obraz otvoru prstencovité clony kondenzorové se tvoří po přechodu světla přes kondenzor a objektiv na fázovém prstenci fázové desky • •Fázový prstenec musí pokrývat zcela obraz štěrbiny. •K přesnému nastavení se používá centračních šroubů, kterými posunujeme destičku s prstencovitou clonou (my osobně teď neděláme): Seřízení – splynutí obrazu clonky s fázovou destičkou •http://www.olympusmicro.com/primer/java/phasecontrast/phasemicroscope/index.html http://microscopeinternational.com/image/data/Miscellaneous_Images/phase_configuration.jpg http://www.microscopyu.com/articles/phasecontrast/images/phaseconfigurationfigure8.jpg Obr pouzity z http://www.microscopyu.com/articles/phasecontrast/images/phaseconfigurationfigure8.jpg (levý), http://microscopeinternational.com/image/data/Miscellaneous_Images/phase_configuration.jpg (pravý) •Vložené prstence jsou obvykle příslušné k objektivu. •Pro fázový kontrast označeny: Ph1, Ph-2 atd., tyto údaje jsou též na fázových objektivech. • http://www.microscopyu.com/articles/phasecontrast/images/phasemicroscopyfigure5.jpg https://encrypted-tbn3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcSVx68BGprwjeuXw4RjK7aZvXiz4NY4pwl1GmvBt1_UBSv PYFwl http://www.microscopyu.com/articles/phasecontrast/images/phaseconfigurationfigure4.jpg Puvod obrazku zleva: http://www.microscopyu.com/articles/phasecontrast/images/phasemicroscopyfigure5.jpg https://encrypted-tbn3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcSVx68BGprwjeuXw4RjK7aZvXiz4NY4pwl1GmvBt1_UBSv PYFwl http://www.microscopyu.com/articles/phasecontrast/images/phaseconfigurationfigure4.jpg • http://www.microscopyu.com/articles/phasecontrast/images/phaseconfigurationfigure2.jpg http://www.microscopyu.com/articles/phasecontrast/images/phaseconfigurationfigure3.jpg Prstencová clona http://www.microscopyu.com/articles/phasecontrast/phaseconfiguration.html http://www.photomacrography.net/forum/userpix/435_Llyra_100x_PC_NH_1.jpg •Kolem objektu vzniká halo efekt http://www.nobelprize.org/educational/physics/microscopes/phase/gallery/images/pcmg2.jpg http://www.nobelprize.org/educational/physics/microscopes/phase/gallery/images/pcmg2.jpg http://www.photomacrography.net/forum/userpix/435_Llyra_100x_PC_NH_1.jpg Typy fázového kontrastu •fázový kontrast pozitivní • fázová deska v objektivu posunuje fázi přímého vlnění vzhledem k vlnění difrakčnímu o + 90° (o +1/4Λ) •fázový kontrast negativní fázová deska v objektivu posunuje fázi přímého vlnění vzhledem k vlnění difrakčnímu o -90° (o -1/4Λ). http://www.microscopyu.com/tutorials/java/phasecontrast/positivenegative/index.html http://www.microscopyu.com/articles/phasecontrast/images/phasemicroscopyfigure7.jpg http://www.microscopyu.com/articles/phasecontrast/images/phasemicroscopyfigure8.jpg http://www.microscopyu.com/articles/phasecontrast/phasemicroscopy.html Schema vpravo nahore: http://kfrserver.natur.cuni.cz/studium/prednasky/mikro/ppt/4_mikroskop2.pdf Ukázky fázového kontrastu BU06_LG5_8_dispar_upr Onchocleidus dispar BU06_LG3_2_dispar_kop_upr CZ05_LG6_4_simil_upr Onchocleidus similis CZ05_LG6_4_simil_kop_upr 100x10 100x10 Autor: Dr. E. Řehulková Ukázky fázového kontrastu hlavicka7 hlavicka9 Thylacicleidus serendipitus Thylacicleidus sp. 2 [tylacikleidus] Autor: Dr. E. Řehulková • penis1 penis2 penis3 Thylacicleidus sp. 1 Thylacicleidus sp. 2 Thylacicleidus serendipitus Samci kopulacni organ Autor: Dr. E. Řehulková •Další info: •https://www.youtube.com/watch?v=I4ZQm-CAgL8 http://electron6.phys.utk.edu/optics421/modules/m6/images/phase.jpg https://encrypted-tbn3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcQ20z3ZU0iDsLak6FYRn066GGCVLXU17g20o0fMSb5eOtq OBDe_ [USEMAP] úkoly •Doplňte si protokol •Pozorujte (a zdokumentujte) ve fázovém kontrastu a normálním světlém poli: •Epitelovou buňku vnitřní strany tváře •Epitel cibule •Háčky monogeneí •Kvasinky • • – https://encrypted-tbn1.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcQJpaQZhD7WFd7xsqrvRvMOJxxVhZUGdhhsTe7ES5tBGCb zuzK1KQ http://mikeduckworth.files.wordpress.com/2011/08/microscope-funny.jpg http://www.microscopy-uk.org.uk/mag/imgoct03/cebolla-09.jpg http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/a/a2/Schizosaccharomyces_pombe_division.JPG/240 px-Schizosaccharomyces_pombe_division.JPG http://www.wikiwand.com/en/Schizosaccharomyces_pombe