Cvičení k předmětu Bi5580 Obecná ekotoxikologie
Nutné potřeby, které studenti přinesou s sebou do cvičení:
- Tento návod
- Poznámkový sešit, psací potřeby
- Nůžky
- Pravítko (s milimetrovým rozlišením)
- Přezůvky
Úvodní přípravné otázky: (zdroj informací pro odpovědi - materiály k přednáškám, www.google.com)
- Jaký je význam použitého organismu (= modelový zástupce rostlin)?
- Jaké jsou praktické (ekologické) důsledky eventuálního poškození klíčení rostlin ?
- Co to je IC50 a co to je IC99 ? Proč se používá právě IC50 a ne například IC99 ?
Úloha - Stanovení ekotoxicity v testu klíčení rostlin
Úvod:
Ve skleněných petriho miskách jsou semena hořčice seté umístěna na filtrační papír a exponována 5
mL standardního média s různým ředěním testované látky. Jako negativní kontrola slouží varianta se
semeny exponovanými jen čistým médiem.
Po ukončení experimentu se stanoví počet vyklíčených semen v kontrolách a v jednotlivých ředěních
a u vyklíčených jedinců se vyhodnotí celková délka kořene. Získané výsledky lze využít pro výpočet
hodnot IC50 (koncentrace zabraňující vyklíčení u 50% semen, resp. koncentrace 50% inhibující růst
kořene).
Metodika testu klíčení je standardizována do podoby Guidline OECD (No. 208) a metodického pokynu
MŽP ČR pro hodnocení toxicity odpadů a vodných výluhů (Test inhibice růstu kořene Sinapis alba,
Vyhl. MŽP ČR 338/1997). Ve standardní podobě se provádí 4 dny (96 hodin). Pro účely cvičení může
byla doba expozice modifikována na 72hodin.
Materiál a chemikálie
- semena hořčice bílé Sinapis alba (s atestem testu klíčivosti) – 30 min dopředu ponořené v
destilované vodě
- skleněné petriho misky o průměru 10 cm, pipety 5 a 10 mL, automatické mikropipety, filtrační papír,
vialky pro přípravu ředění testované látky, pinzeta, laboratorní plastiková folie, špičky k pipetám
- zásobní roztok standardního kultivačního média
Tab. 1: Zásobní roztoky solí pro testy na semenech hořčice bílé
Zásobní roztok Chemikálie Koncentrace v
zásobním roztoku[g·l-
1
]
Roztok 1 CaCl2·2H2O 117,6
Roztok 2 MgSO4·7H2O 49,3
Roztok 3 NaHCO3 25,9
Roztok 4 KCl 2,3
Příprava média : napipetovat 5 ml každého roztoku a doplnit do 1 l destilovanou vodou. Případně
upravit pH na 7,6-8.
Postup 1 - příprava EXPOZICE:
1) Petriho misky popište jménem, datem , koncentrací testované látky. Do takto připravených petriho
misek připravte a vložte kruhové výseče z filtračního papíru. Test bude proveden v duplikátech celkem
připravte 8 petriho misek (2x kontrola + 2x 3 ředění vzorku A).
2) Příprava ředění vzorku
- připravte následující koncentrace dodaného testovaného vzorku
(vzorek A): 0.25% v/v, 0.5% v/v, 1% v/v (do 15 mL standardního média napipetujete potřebný
objem testovaného vzorku – 37µL, 75 µL, 150 µL/ 15 mL - změnu celkového objemu zanedbejte)
- ředění proveďte v dodaném standardním médiu (roztok solí a základních živin nutných pro klíčení
rostlin).
3) Připravené expoziční roztoky dávkujte do petriho misek - vždy 5 mL / misku
- u kontrol použijte 5 mL standardního média bez vzorku
- použijte jednu pipetu a postupujte od nejnižší po nejvyšší koncentraci
4) Do každé misky vložte 5 semen hořčice bílé
5) Petriho misky překryjte potravinovou folií (zajistí cirkulaci vzduchu a omezí vypařování) a umístěte
do temna do inkubační místnosti (pokojová teplota)
Postup 2 - vyhodnocení KLÍČENÍ:
1) Po ukončení expozice spočítejte počty nevyklíčených semen na jednotlivých miskách a zapište do
tabulky.
2) U vyklíčených semen vyhodnoťte délku kořene (s přesností na milimetry) a zapište do tabulky;
3) Vypočítejte průměrnou hodnotu u každé varianty a hodnoty vyjádřete jako % kontroly a % inhibice
(vyjádřete jako celá čísla)
4) Vyhodnocení IC50 proveďte pomocí lineární regrese se zahrnutím logaritmu koncentrace (Excel)
5) Schéma protokolu: princip, postup, výsledková tabulka, grafy pro jednotlivé sledované parametry
a závěry
PROTOKOL - Cvičení z Obecné ekotoxikologie
TEST EKOTOXICITY KLÍČENÍ ROSTLIN:
Jména operátorů
Datum založení expozice:
Datum hodnocení:
-> délka expozice (počet dní):
Testovaný vzorek (koncentrace % v/v)
Rostlina
číslo
Kontrola 0,25% 0,5% 1% Pozn.
Celkem semen 10 10 10 10
Počet
nevyklíčených
Délky kořenů - Miska A
1
2
3
4
5
Délky kořenů - Miska B
1
2
3
4
5
Průměr délky
kořenů
% kontroly 100
% inhibice 0
IC50 - klíčení (% v/v)
IC50 - růst kořene (% v/v)
Otázky:
1) Který z hodnocených parametrů je citlivějším ukazatelem toxicity?
2) Jaké množství testované látky způsobí inhibici růstu kořene o 99% ? Je tento výsledek
věrohodný?