Bi5596
Moderní metody v ekotoxikologii
STUDIUM RNASTUDIUM RNA && DNADNA I.I.STUDIUM RNASTUDIUM RNA && DNADNA I.I.
Jak je izolovat a jak s nimi nakládatJak je izolovat a jak s nimi nakládat
RNDr. Iva Sovadinová, Ph.D.
sovadinova@recetox.muni.cz
podzim 2015
CÍLE PŘEDNÁŠKY
Co to jsou NK
Jak je získáme
Jak je poznáme
2
Jak je rozeznáme – DNA vs. RNA
Jak s nimi manipulujeme
Jak je zkoumáme
CÍLE PŘEDNÁŠKY
Co to jsou NK
Jak je získáme
Jak je poznáme
2
Jak je rozeznáme – DNA vs. RNA
Jak s nimi manipulujeme
Jak je zkoumáme
3
Proces přenosu genetické informaceProces přenosu genetické informace ⇒⇒⇒⇒⇒⇒⇒⇒ Centrální dogma molekulární
biologie
www.tulane.edu/~wiser/methods/notes.pdf ,
http://en.wikipedia.org/wiki/Central_dogma_of_molecular_biology#cite_note-crick1970-2
https://www.youtube.com/watch?v=yVQ1or5FYx8
3
Proces přenosu genetické informaceProces přenosu genetické informace ⇒⇒⇒⇒⇒⇒⇒⇒ Centrální dogma molekulární
biologie
www.tulane.edu/~wiser/methods/notes.pdf ,
http://en.wikipedia.org/wiki/Central_dogma_of_molecular_biology#cite_note-crick1970-2
https://www.youtube.com/watch?v=yVQ1or5FYx8
https://www.youtube.com/watch?v=yVQ1or5FYx8
6
NUKLEOVNUKLEOVÉ KYSELINY A JEJICH STRUKTURAÉ KYSELINY A JEJICH STRUKTURA
A FUNKCEA FUNKCE
7
NK:NK: STRUKTURASTRUKTURA
nukleotidové
polymery
⇒⇒⇒⇒ nnukleotidukleotid:
1. dusíkatá báze
2. pentózový cukr
3. fosfátová skupina
CH
O
HC
CH
OH
CH
CH2
O
OH
P OOH
OH
Báze
1
23
4
5
6
Báze
(1.)
Nukleosid
(2.)
Nukleotid
(3.)
Adenin Adenosin AMP
Guanin Guanosin GMP
Cytosin Cytidin CMP
Thymin Thymidin dTMP
Uracil Uridin UMP
www.tulane.edu/~wiser/methods/notes.pdf
8
NK:NK: STRUKTURASTRUKTURA
nukleotidové
polymery
⇒⇒⇒⇒ nnukleotidukleotid:
1. dusíkatá báze
2. pentózový cukr
3. fosfátová skupina
CH
O
HC
CH
OH
CH
CH2
O
OH
P OOH
OH
Báze
1
23
4
5
N-glykosidová
vazba
6
Báze
(1.)
Nukleosid
(2.)
Nukleotid
(3.)
Adenin Adenosin AMP
Guanin Guanosin GMP
Cytosin Cytidin CMP
Thymin Thymidin dTMP
Uracil Uridin UMP
www.tulane.edu/~wiser/methods/notes.pdf
9
NK:NK: STRUKTURASTRUKTURA
nukleotidové
polymery
⇒⇒⇒⇒ nnukleotidukleotid:
1. dusíkatá báze
2. pentózový cukr
3. fosfátová skupina
CH
O
HC
CH
OH
CH
CH2
O
OH
P OOH
OH
Báze
1
23
4
5
N-glykosidová
vazba
6
Báze
(1.)
Nukleosid
(2.)
Nukleotid
(3.)
Adenin Adenosin AMP
Guanin Guanosin GMP
Cytosin Cytidin CMP
Thymin Thymidin dTMP
Uracil Uridin UMP
www.tulane.edu/~wiser/methods/notes.pdf
Fosfodiesterová
vazba
10
DNA:DNA: SStruktura & funkcetruktura & funkce
Fosfodiesterová
vazba
N-glykosidová
7
www.tulane.edu/~wiser/methods/notes.pdf
https://is.muni.cz/do/sci/UEBBiol/DNA-FTBcz/pages/2-19-zkrouceny-
zebrik.html
Záporný náboj
N-glykosidová
vazba
DNA:DNA: SStruktura & funkcetruktura & funkce
Fosfodiesterová
vazba
N-glykosidová
7
www.tulane.edu/~wiser/methods/notes.pdf
https://is.muni.cz/do/sci/UEBBiol/DNA-FTBcz/pages/2-19-zkrouceny-
zebrik.html
Záporný náboj
N-glykosidová
vazba
DNA:DNA: SStruktura & funkcetruktura & funkce
záporně nabitá ⇒ rozpustná ve vodě, naopak v ethanolu
se sráží (bílá barva)
denaturace ⇒ vysoká teplota, nízká iontová síla, silně
zásadité prostředí (obsah CG)
kyselé prostředí ⇒ hydrolýza glykosidových vazeb
stabilní ⇒ poločas rozpadu DNA v kosti - asi 521 letstabilní ⇒ poločas rozpadu DNA v kosti - asi 521 let
(kosterní nález)
http://www.the-scientist.com/?articles.view/articleNo/32799/title/Half-Life-of-DNA-
Revealed/
http://www.astronauti.cz/news/novy-objev-dna-prepisuje-historii-evoluce/
http://news.discovery.com/earth/weather-extreme-events/oldest-dna-bacteria-
discovered.htm
DNA v roztoku při −20° nebo 70-80 °C ⇒ několik měsíc až
let, při 4 °C ⇒ několik týdnů
13
RNA:RNA: SStruktura & funkcetruktura & funkce
© 2009© 2009 Nature EducationNature Education All rights reserved.All rights reserved.
14
RNA:RNA: SStruktura & funkcetruktura & funkce
15
© 2009© 2009 Nature EducationNature Education All rights reserved.All rights reserved.
https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Difference_DNA_RNA-EN.svg
DNA
RNA:RNA: SStruktura & funkcetruktura & funkce
cukr: ribóza, báze: A, U, C, G
záporně nabitá ⇒rozpustná ve vodě,
naopak v ethanolu se sráží (bílá barva)
sekundární a terciární struktury
reaktivnější a flexibilnější, ale takéreaktivnější a flexibilnější, ale také
nestabilnější než DNA ⇒ roztok v pufru
při −20° stabilní pouze několik týdnů
náchylnější k degradaci enzymů ⇔
RNázy těžko degradovatelné
16
RNA:RNA: SStruktura & funkcetruktura & funkce
12
http://highered.mheducation.com/sites/0072507470/student_view0/chapter3/ani
mation__mrna_synthesis__transcription___quiz_1_.html
RNA:RNA: SStruktura & funkcetruktura & funkce
13
https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Ribosome_mRNA_translation_en.svg
TRANSLACE
http://highered.mheducation.com/sites/0072507470/student_view0/cha
pter3/animation__how_translation_works.html
RNA:RNA: SStruktura & funkcetruktura & funkce
13
https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Ribosome_mRNA_translation_en.svg
TRANSLACE
http://highered.mheducation.com/sites/0072507470/student_view0/cha
pter3/animation__how_translation_works.html
NUKLEOVNUKLEOVÉ KYSELINY A JEJICH IZOLACEÉ KYSELINY A JEJICH IZOLACE
20
volba techniky záleží na:
1. výchozím materiálu (typ, množství, kvalita atd.)
2. typu izolované NK
• genomová DNA (chromozomální)
• satelitní DNA
• plasmidová DNA (extrachromozomální)
• fragment DNA v agarózovém gelu
NK:NK: IZOLACEIZOLACE
15
• fragment DNA v agarózovém gelu
• fagová (virová) NK
• RNA
3. požadované čistotě
4. požadovaném množství
5. následné aplikaci
6. časové náročnosti
7. ekonomické náročnosti
Izolace ve zkumavce
Kity
Automatické roboty
16
HüttenhoferHüttenhofer et al. Nature Reviews Geneticset al. Nature Reviews Genetics advance online publication;advance online publication;
published online 18 April 2006 | doi:10.1038/nri1855published online 18 April 2006 | doi:10.1038/nri1855
16
16
HüttenhoferHüttenhofer et al. Nature Reviews Geneticset al. Nature Reviews Genetics advance online publication;advance online publication;
published online 18 April 2006 | doi:10.1038/nri1855published online 18 April 2006 | doi:10.1038/nri1855
16
17
RNA Purifi cation and Analysis: Sample Preparation, Extraction, Chromatography
Douglas T. Gjerde, Lee Hoang, and David Hornby
Copyright © 2009 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim
ISBN: 978-3-527-32116-2
NK:NK: IZOLACEIZOLACE
http://isb-up.cz/data/PDF/MMSR/MMSR_LS_2012_01_DNA-extrakce.pdf
25
NK:NK: IZOLACEIZOLACE
http://isb-up.cz/data/PDF/MMSR/MMSR_LS_2012_01_DNA-extrakce.pdf
26
Vychází z fyzikálně-chemických vlastností NK:
• fosfátové estery jsou silné kyseliny a chovají se jako
anionty při neutrálním pH
• báze jsou jen slabě bazické a bez náboje
• nabitá fosfátová páteř dělá NK spíše hydrofilní vs.
proteiny jsou spíše hydrofóbní
NK:NK: IZOLACEIZOLACE
Principy I.Principy I.
19
proteiny jsou spíše hydrofóbní
• NK se snadno precipitují alkoholem
• vodíkové vazby mezi skupinami –NH2 a –OH jsou
stabilní od pH 4 do pH 9
• NK mají max. absorbance UV světla při 260 nm
Využívá se:
• odlišná rozpustnost
• adsorpční metody
• gradientová centrifugace (hustota)
Metody lze rozdělit na:
NK:NK: IZOLACEIZOLACE
Principy II.Principy II.
20
Metody lze rozdělit na:
• Klasické v roztoku „organické“
• Klasické v roztoku „anorganické“
• Adsorpční na pevnou matrici
NK:NK: IZOLACEIZOLACE
Důležité krokyDůležité kroky
A. úspěšné rozbití vzorku a narušení
buněčných membrán
B. denaturace nukleoproteinového komplexu
C. inaktivace nukleázC. inaktivace nukleáz
D. odstranění všech nežádoucích složek –
proteinů, solí, sacharidů, lipidů, DNA/RNA
E. vyhnutí se kontaminování vyizolované NK
jinou NK během izolace
21
Rozrušení vzorku a buněčných membrán
30
• mechanická lyze – kvasinky, houby, rostliny, živočišné pojivové tkáně
⇒ v třecí misce v tekutém dusíku, skleněné kuličky, tyčové homogenizátory atd.
• enzymatická lyze – spóry, kvasinky
⇒ lysozym, celuláza atd.
• osmotická lyze – např. E. coli, živočišné tkáně: krev, mozek
• ionorgenní detergenty – sodium dodecyl sulfát (SDS), N-laurylsarkosin,
guanidinium hydrochlorid
Rozrušení vzorku a buněčných membrán
• neionogenní detergenty (umožní rozpustit buněčnou membránu při
zachování jaderné membrány; izolace plazmidové DNA) – Triton X100,
NP-40
• organická rozpouštědla
• zásadité látky (NaOH)
• povaření
• chaotropní činidla
31
• mechanická lyze – kvasinky, houby, rostliny, živočišné pojivové tkáně
⇒ v třecí misce v tekutém dusíku, skleněné kuličky, tyčové homogenizátory atd.
• enzymatická lyze – spóry, kvasinky
⇒ lysozym, celuláza atd.
• osmotická lyze – např. E. coli, živočišné tkáně: krev, mozek
• ionorgenní detergenty – sodium dodecyl sulfát (SDS), N-laurylsarkosin,
guanidinium hydrochlorid
Rozrušení vzorku a buněčných membrán
• neionogenní detergenty (umožní rozpustit buněčnou membránu při
zachování jaderné membrány; izolace plazmidové DNA) – Triton X100,
NP-40
• organická rozpouštědla
• zásadité látky (NaOH)
• povaření
• chaotropní činidla
32
ALBERTS, B, D BRAY a A JOHNSON. Základy buněčné biologie. 2. vydání. Espero Publishing, 2005. 740 s. ISBN 80-
902906-2-0.
Denaturace NK
Inkubace s enzymy
33
Denaturace NK
• používá se: SDS, zásady, zahřátí na vysokou teplotu,
chotropní činidla
•••• rozpustí a oddělí NK od ostatního materiálu (např.
proteinů)
•••• inhibuje nukleázy
Inkubace s enzymy
34
Denaturace NK
• používá se: SDS, zásady, zahřátí na vysokou teplotu,
chotropní činidla
•••• rozpustí a oddělí NK od ostatního materiálu (např.
proteinů)
•••• inhibuje nukleázy
Inkubace s enzymy
•••• degradace nechtěných komponent:
- proteázy (např. proteináza K) proteiny
- nukleázy nechtěné NK
- RNáza štěpí RNA, pak nutné přečistit fenol:chloroform
extrakcí a DNA vyzrážet EtOH
35
NK:NK: IZOLACEIZOLACE
Metody „Metody „quickquick--andand--dirtydirty“ pro genomovou DNA“ pro genomovou DNA
inkubace zahřátí lyzovaných buněk na vysokou teplotu
(např. 90°C/ 20 min, v přítomnosti SDS na 65-70°C)
„natrávení“ lyzovaných buněk proteinázou K
36
↓ limitované použití nepřečištěného lyzátu v dalších aplikacích
↓ obsahuje složky inhibující enzymy (např. soli)
↓ DNA není v optimálním pH
↓ nutná úplná inaktivace proteinázy K
↓ omezené skladování – rychlá degradace DNA
Organické látky sráží
proteiny – fenol
Princip: proteiny jsou
hydrofóbní a přecházejí do
NK:NK: IZOLACEIZOLACE
Klasická metoda vKlasická metoda v roztokuroztoku -- „organická„organická extrakceextrakce““
25
organizké fáze, kdežto NK jsou
vysoce nabité a přecházejí do
vodné fáze
fenol ⇒ organické rozpouštědlo
• vysoce čistý pro molekulární techniky, skladuje se
při -20°C
• sytí se Tris pufrem (pH 4: separuje se RNA; pH 7-8:
separuje se DNA) s EDTA (vychytává ionty nutné pro
aktivitu nukleáz – např. Ca2+) a NaCl - skladuje se při 4°C
• oxidace (zežloutnutí) snižuje účinnost izolace
• vysoce nebezpečná látka (hořlavá, korozivní a toxická)
Extrakce NK – převedení NK do vodné fáze
Fenol-chloroformová extrakce
26
• vysoce nebezpečná látka (hořlavá, korozivní a toxická)
výhody:
• jednoduché provedení
• lehce modifikovatelné
• rozmezí objemů: 40 µl až několik ml
aplikace: genomová DNA s vysokou molekulovou hmotností
postup:
• důkladně smíchat vzorek s fenolem
• centrifugace ⇒ NK ve vodné fázi a
a proteiny v organické („fenolové“)
modifikace:
• přídavek chloroformu ⇒ lepší separace fází
• přídavek guanidin thiokyanátu nebo guanidin
hydrochloridu ⇒ denaturace proteinů
• směs fenol:chloroform:isoamyl alkohol
- isoamylalkohol: zvyšuje rozpustnost fenolu v chloroformu
VODNÁ
FÁZE
RNA
ORG.
FÁZE
Proteiny
DNA
Proteiny
pH
4-6 7-8
VODNÁ
FÁZE
DNA, RNA
ORG.
FÁZE
INTERFÁZE INTERFÁZE
27
- isoamylalkohol: zvyšuje rozpustnost fenolu v chloroformu
• TRIzol® ⇒ monofázický roztok fenolu a guanidin thiokyanátu
izoluje NK v přítomnosti chloroform nebo bromochloropropanu
(TRI reagent®) – izolace DNA, RNA a proteinů z 1 vzorku
nevýhody:
• časově náročné
• nebezpečí kontaminace, zejména fenolem (odstranění fenolu
pomocí extrakce směsí chloroform-isoamylalkohol ⇒ fenol do
chloroformové/organické fáze)
• nebezpečné chemikálie ⇒ digestoř
Extrakce NK – převedení NK do vodné fáze
II. Alkalická extrakce
alkalická denaturace (NaOH, pH = 12) ⇒ vysokomolekulové
chromozomální DNA i plazmidové DNA v přítomnosti SDS
neutralizace (KAc, pH = 5.5) ⇒ selektivní renaturace
plazmidové DNA, dlouhá bakteriální genomová DNA NErenaturuje
centrifugace ⇒ plazmidová DNA v roztoku, genomová DNA
vázána na proteiny, které v tomto prostředí precipitují
28
(RNáza A), precipitace ethanolem
aplikace: plazmidová DNA (i kolonková verze)
srážení v nevodném prostředí
*ethanol, isopropylalkohol
– alkohol má nižší dielektrickou konstantu než voda ⇒ neutralizace negativního
náboje NK, která se stává méně hydrofilní, tedy rozpustnou ve vodě
– odmytí solí oplachem 70% ethanolem a rozpuštění NK ve vodě nebo pufru
(TE pufr o pH 7,5)
srážení ve vodném prostředí
*polyaminy (spermidin, spermin)
vysrážené NK
Precipitace NK – srážení NK z vodné fáze
29
*polyaminy (spermidin, spermin)
– vysoce selektivní precipitace (nevhodné pro genomovou DNA, ne < 50 bp)
– vhodné pro izolaci NK-vazebných proteinů
– odmytí polyaminu oplachem peletu koncentrovanou solí
*PEG (různá MW i koncentrace)
– vysoce selektivní precipitace (nevhodné pro nízkomolekulární NK <150 bp)
– vhodné pro selektivní precipitaci v závislosti na délce NK
– odmytí PEG oplachem peletu ethanolem
NK:NK: IZOLACEIZOLACE
Klasické metody vKlasické metody v roztokuroztoku -- „anorganická extrakce“„anorganická extrakce“
Vysolování:
1. Lýze buněk ⇒ SDS
2. RNA odstraněna
RNázami
3. Proteiny precipitovány
30
3. Proteiny precipitovány
v koncentrovaném
roztoku solí (octan
sodný či amonný)
4. DNA precipitována
ethanolem a
rehydratována
NK:NK: IZOLACEIZOLACE
Klasické metody vKlasické metody v roztokuroztoku -- „anorganická extrakce“„anorganická extrakce“
Odstranění polysacharidů:
rostliny, houby a některé bakterie
extrakce s cetyltrimetylamonium bromidem (CTAB)
kladně nabitý CTAB se váže s negativně nabitými
polysacharidy (pectin, xylan)polysacharidy (pectin, xylan)
při 0.7-0.8 M NaCl jsou polysacharidy vyprecipitovány a
DNA/RNA zůstává v roztoku ⇒ precipitace alkoholem
31
NK:NK: IZOLACEIZOLACE
Adsorpční na pevnou matriciAdsorpční na pevnou matrici
NK se v přítomnosti chaotropních solí
adheruje na pevný povrch/nosič
adsorpce NK na pevnou fázi záleží na pH a
obsahu solí v roztoku
pevná fáze: silikát, silikagel, skleněné kuličky,
křemelina a nosiče aniontů
32
křemelina a nosiče aniontů
Kroky:
1. Lýze buněk
2. Adsorpce NK na pevnou fázi
3. Oplach
4. Vymytí
1. Lýze
2. Přidání chaotropních solí a protřepání se silikátovými
částicemi
NK v přítomnosti chaotropních solí (jodid sodný, guanidinové
soli) adherují na silikátový povrch (na sklo)
vazba: vysoký obsah soli a pH≤7, vymytí: nízký obsah soli a
pH≥
1. Adsorpce na silikát
částicemi
3. Centrifugace a oplach navázané NK roztokem
chaotropních solí
4. Přidání vody či pufru ⇒ eluce
5. Centrifugace ⇒ NK v roztoku
33
lyzát buněk se přidá na kolonky se speciálními membránami
(silikát) vázajícími NK v přitomnosti chaotropních solí,
následuje vymytí NK pufrem s nízkým obsahem soli
rozpuštěná NK se vysráží ethanolem a naváže se v pufru s
vysokým obsahem soli (pH < 7) a eluuje v pufru s nízkým
obsahem soli (pH > 7)
2. Kolonky založené na adsorpční chromatografii
34
obsahem soli (pH > 7)
1. Lýze
2. Navázání
3. Oplach
4. Vymytí
https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Qiagen_Mini_Spin_Column.svg
3. Magnetické částice
magnetické silikátové částice ⇒ NK se váží při vysoké
koncentraci chaotropních solí
magnetické silikátové částice váží při vysoké koncentraci
solí i kratší NK a eluují při nízké
35
http://www.bio-protocol.org/e1238
http://eng.bioneer.com/products/Protein/MagneticBeads-technical.aspx
4. Iontoměniče
resin ⇒
36
interakce mezi negativně nabitými fosfátovými skupinami
NK a pozitivně nabitými molekulami zvoleného povrchu
(např. DEAE, diethylaminoethyl)
vazba i eluce při různých koncentrací solí a pH dle
izolované NK
5. FTA® Technology
„fast technology for analysis of nucleic acids“
37
opakované použití enzymů a opakovaná extrakce
fenolem
zákaz natahování a napínání v opačném směru a
vortexování
NK:NK: IZOLACEIZOLACE
Specifické aplikaceSpecifické aplikace && modifikacemodifikace
1. Izolace vysokomolekulární chromozomální DNA
38
vortexování
několika hodinová fenolová extrakce za pomalého
míchání
po vysrážení DNA ethanolem dojde k namotání
DNA
www.tulane.e
du/~wiser/me
thods/notes.p
df
2. Izolace mitochondriální DNA
osmotická lýze buněk v pufru pH=7 – rostlinná tkáň:
sacharóza nebo mannitol 0,2-0,5 M, živočišná tkáň:
0,15 M KCl
EDTA – inhibuje proteolytické enzymy
BSA – bovinní sérový albumin – vychytává fenolické látky uvolněné
např. z vakuol, váže mastné kys., inhibice proteáz
PVP – polyvinylpyrrolidone – absorbuje fenolické látky
o Differenciační centrifugace
- krátce nízké otáčky např. 3000 g/5-10 min ⇒ pelet: zbytky
buněčných stěn, jádra, intaktní plastidy, škrobová zrna; supernatant:
mitochondrie
- dlouze vysoké otáčky např. 10,000 g/10-20 min ⇒ pelet:
mitochondrie, peroxizómy, zbytky membrán plastidů
o Gradientová ultracentrifugace
- v roztoku Percolu – separovaný prstenec oddělený od ostatních
kontaminant
39
o Differenciační centrifugace
- krátce nízké otáčky např. 1500 g/15 min ⇒ pelet: plastidy, zbytky buněčných stěn,
jádra, škrobová zrna
o Gradientová ultracentrifugace
- v roztoku Percolu nebo CsCl – separovaný prstenec oddělený od ostatních
kontaminant
3. Izolace chloroplastové DNA
40
http://www.bio-protocol.org/e1238
4. „Rychlé izolace“ DNA nebo RNA
DNA vhodná pro přímou PCR bez nutnosti zdlouhavé izolace a
přečištění – klíčový je návrh primerů
extrakt buněk vhodný přímo pro RT-PCR
mRNA
Ho 2013. PLOS One 8, e72463.
miRNA
(http://www.komabiotech.com/product/su
b/directPCR_selectiongGuide.php)
http://www.genscript.jp/direct_pcr.html 41
95% objemu NK v buňce (rRNA - 80-85 %, tRNA a snRNA – 15-
12 %, mRNA – 1-5 %)
inaktivace stabilních Rnáz ⇒ inhibitory (RNasin, RNaseOUT),
detergenty, DTT, merkaptoethanol
DNáza bez přítomnosti Rnáz, selektivní polymer/nosič (Adsorbin)
nestabilní ⇒ dlouhodobě uchovávat vysráženou v 70% etanolu při
při -80°C
selektivní precipitace: LiCl, acetát amonný
5. Izolace RNA
42
Organická extrakce v roztoku:
lýze buněk a solubilizace RNA v guanidinových solích (guanidin
thiokyanát-fenol-chloroform)
fenol saturovaný pufrem o pH 4
Trizol®, Tri reagent ⇒ monofázický roztok fenolu a guanidin
thiokyanátu izoluje RNA v přítomnosti chloroformu
Selektivní precipitace LiCl:
- vysráží selektivně delší RNA (rRNA, mRNA)
- postup: 8M LiCl (1:1), promíchání, inkubace při 20°C a
centrifugace
Afinitní chromatografie:
- kolonky s oligodT pro mRNA
www.tulane.edu/~wiser/methods/notes.pdfwww.tulane.edu/~wiser/methods/notes.pdf
43
Magnetické částice nesoucí oligodT:
44
http://www.lifetechnologies.com/cz/en/home/life-
science/dna-rna-purification-
analysis/napamisc/mrna-isolation-dynabeads.html
6. Gradientová centrifugace (hustota)
hustota v CsCl:
DNA ~ 1,7 g/cm3
proteiny ~ 1,3 g/cm3
RNA > DNA
ssDNA > dsDNA
http://biochem1362blog.wordpress.com/
45
http://cbc.arizona.edu/classes/bioc471/pages/Lecture2/Lecture2.html
46
NUKLEOVNUKLEOVÉ KYSELINY AÉ KYSELINY A
JAK JE ZÍSKAT DOMAJAK JE ZÍSKAT DOMA
47
NK:NK: ReceptRecept dodo domdomácíácí kuchařkykuchařky
• Homogenizace jahod v roztoku detergentu a NaCl
• Pomůcky: igelitový sáček, vidlička, JAR,
solnička, slivovice (55-65%), hrubé plátno nebo
kuchyňské cedítko
• Postup:
- jahody zhomogenizovat pomocí vidličky
s přídavkem pár kapek soli a detergentu
(JAR, PUR… = popraskání stěn buněk,
48
(JAR, PUR… = popraskání stěn buněk,
uvolnění DNA do roztoku)
- Filtrace přes plátno
- Přídavek etanolu = vysrážení DNA v
podobě bílé hmoty
http://www.priroda21.upol.cz/docs/2012-01-30_-_Kitner_-
_Zakladni_metody_molekularni_biologie_v_botanice.pdf
http://www.youtube.com/watch?v=UDKm9rZbhyI
• Homogenizace kousku jater (5-10g) v 10% roztoku kuchyňské soli
a vysrážení DNA alkoholem
• Pomůcky: talířek, vidlička, nůž, solnička, slivovice (55-65%),
kuchyňské cedítko (hrubé plátno)
• Postup:
- kousek jater zhomogenizovat pomocí vidličky
- zalít přiměřeným objemem 10% NaCl – popraskání stěn
NK:NK: ReceptRecept dodo domdomácíácí kuchařkykuchařky
49
- zalít přiměřeným objemem 10% NaCl – popraskání stěn
buněk, uvolnění DNA do roztoku
- filtrace přes plátno
- přídavek etanolu = vysrážení DNA v podobě bílé hmoty
http://www.priroda21.upol.cz/docs/2012-01-30_-_Kitner_-
_Zakladni_metody_molekularni_biologie_v_botanice.pdf
http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/extraction/howto/
http://www.youtube.com/watch?v=DBb1utQBlY4
NUKLEOVNUKLEOVÉ KYSELINY A JAK S NIMIÉ KYSELINY A JAK S NIMI
PRACOVATPRACOVAT
50
dekontaminace a sterilizace pracovních ploch UV zářením,
čerstvým 10% roztokem bělidla (SAVO) a komerčním roztokem pro
inkativaci RNáz (např. RNaseZapTM), DNáz a NK (např.
DNAZapTM)
používat pouze vodu pro molekulární biologii („molecular grade
water“)
sklo – omýt detergentem a vodou a sušit při vysoké teplotě
(350°C/2 h)
NK:NK: PRACOVNÍ PODMÍNKYPRACOVNÍ PODMÍNKY
51
(350°C/2 h)
plast – garantované bez RNáz/DNáz a DNA/RNA nebo
autoklávovat
nosit rukavice a často je měnit
používat špičky s filtry
52
52
NUKLEOVNUKLEOVÉ KYSELINY AÉ KYSELINY A
JAK JE STANOVITJAK JE STANOVIT
53
SPEKTROFOTOMETRICKYSPEKTROFOTOMETRICKY
VLNOVÁ DÉLKA ODEZVA KOMENTÁŘ
215-230 nm
*NK absorbují minimálně
*Peptidová vazba v proteinech absorbuje
Měření nejsou při této délce prováděny, protože obecně
používané pufry a solventy (např. Tris) také absorbují při
těchto vlnových délkách.
260 nm *NK absorbují maximálně
Puriny absorbují maximálně při vlnové délce mírně pod
260 nm; pyrimidiny kolem 260 (mírně nad). Puriny mají
vyšší molární absorptivitu než pyrimidiny. Maximum
absorbance a absorptivity záření úseku RNA/DNA proto
závisí na přítomných bází. Proteiny absorbují pouze slabě
při této vlnové délce.
Fenol může být kontaminant ve vzorku izolovaných NK.
NK:NK: KVANTITAKVANTITA && KVALITAKVALITA
54
270 nm * Fenol absorbuje silně
Fenol může být kontaminant ve vzorku izolovaných NK.
280 nm *Aromatické aminokyseliny absorbují NK také absorbují při této vlnocé délce.
320 nm *Ani proteiny ani NK neabsorbují
Používá se jako pozadí, když ani NK, ani proteiny
neabsorbují.
DNA TRIZOL EDTA
DNA A260 1,0 ~ 50 µµµµg/ml dsDNA
1,0 ~ 33 µµµµg/ml ssDNA
A260/A280
A260/A230
1,6-1,8 (>1,8 ⇒ RNA; <1,6 ⇒ protein, fenol atd.)
1,8-2,2 (< 1,8 naznačuje přítomnost např. fenolu, solí,
EDTA, TRIZOlu, guanidine HCl)
RNA A260 1,0 ~ 40 µµµµg/ml RNA
A260/A280
A260/A230
~2,0 (>2 ⇒ guanidin isothiokyanát; <1,6 ⇒ proteiny, fenol
atd.)
1,8-2,2 (< 1,8 naznačuje přítomnost např. fenolu, solí,
EDTA, TRIZOlu)
Koncentrace
Typ vzorku
260/280
260/230
55
-NanoDrop® ⇒ UV/Vis spektrum vlnových délek (220-750
nm), 1 µl vzorku bez ředění (3700 ng/µl dsDNA)
56
FLUORESCENČNĚFLUORESCENČNĚ
- vzorky s nízkou koncentrací
nebo kontaminované
- fluorescentní barvy: ethidium
bromid, Ribogreen, QuantiFluor®
RNA Systém, PicoGreen
57
Eppendorf, Application Note 271, Březen 2013
58
Eppendorf, Application Note 271, Březen 2013
RADIOAKTIVNĚRADIOAKTIVNĚ
- vizualizace malého množství DNA
- Southernův či Northernův přenos na nylonovou membránu,
hybridizace s radioaktivně značnou sondou
- 32P
http://biocadmin.otago.ac.nz/fmi/xsl/bioc2h/learnbitslecture.xsl?-
db=bioc2hweb.fp7&-lay=Lectures&-recid=4604&-find=
Southern EM (1975). J Mol Biol, 98 (3), 503-517
59
HORIZONTÁLNÍ ELEKTROFORÉZOU V AGARÓZOVÉMHORIZONTÁLNÍ ELEKTROFORÉZOU V AGARÓZOVÉM
GELUGELU
- odečet množství NK z gelu - marker
- kvalita a integrita
- barvení ethidium bromidem nebo dalšími fluorescenčními
barvami pro NK ⇒ vizualizace UV světlem
6073
http://worldwide.promega.com/resources/pubhub/met
hods-of-rna-quality-assessment
http://www.priroda21.upol.cz/docs/2012-01-30_-
_Kitner_-
_Zakladni_metody_molekularni_biologie_v_botanice
.pdf http://worldwide.promega.com/products/pm/genomics/rnasin
1. Trizol1. Trizol (12(12 µµµµµµµµg)g)
2.2. TrizolTrizol (24(24 µµµµµµµµg)g)
3. RNeasy (123. RNeasy (12 µµµµµµµµg)g)
4. Invisorb II (124. Invisorb II (12 µµµµµµµµg)g)
5. Invisorb II (245. Invisorb II (24 µµµµµµµµg)g)
6. Invisorb Spin (126. Invisorb Spin (12 µµµµµµµµg)g)
7. Invisorb Spin (247. Invisorb Spin (24 µµµµµµµµg)g)
61
JAK SEPAROVAT NKJAK SEPAROVAT NK
62
NK:NK: ELEKTROELEKTROMIGRACEMIGRACE
využívá separace makromolekul na základě náboje, konformace
nebo velikosti v elektrickém poli
migrace nabité částice v elektrickém poli je ůměrná jejímu celkovému
náboji, velikosti a tvaru
malé částice s velkým nábojem vs. velké částice s velkým nábojem
ELEKTROFORÉZA V GELUELEKTROFORÉZA V GELU
Agarózová – vhodné pro rozlišení dlouhých fragmentů DNA a RNA
(>400 bp), 1 kbp ssDNA ~ 330 kDa
Polyakrylamidová – vodné pro rozlišení krátkých fragmentů DNA
nebo sekvenci lišícího se záměnou jednoho nukleotidu (<400 bp)
63
CO OVLIVŇUJE MIGRACI NK V GELUCO OVLIVŇUJE MIGRACI NK V GELU::
- velikost pór, napětí, iontová síla roztoku, koncentrace
fluorescenční barvy
- velikost NK ⇒ menší rychleji
- konformace DNA či RNA
slower migration
faster migration
77
NK:NK: ELEKTROELEKTROMIGRACEMIGRACE
HORIZONTÁLNÍ ELEKTROFORÉZAHORIZONTÁLNÍ ELEKTROFORÉZA
− agarózová (neutrální lineární polymer agarobiózy)
⇒ hustá síť, kterou rychleji prostupují kratší fragmenty (molekuly) než
delší fragmenty – „molekulové síto“
65
NK:NK: ELEKTROELEKTROMIGRACEMIGRACE
HORIZONTÁLNÍ ELEKTROFORÉZAHORIZONTÁLNÍ ELEKTROFORÉZA
− agarózová (neutrální lineární polymer agarobiózy)
⇒ hustá síť, kterou rychleji prostupují kratší fragmenty (molekuly) než
delší fragmenty – „molekulové síto“
65
NK:NK: ELEKTROELEKTROMIGRACEMIGRACE
HORIZONTÁLNÍ ELEKTROFORÉZAHORIZONTÁLNÍ ELEKTROFORÉZA
− agarózová (neutrální lineární polymer agarobiózy)
⇒ hustá síť, kterou rychleji prostupují kratší fragmenty (molekuly) než
delší fragmenty – „molekulové síto“
65
www.tulane.edu/~wiser/methods/notes.pdf
Agaróza – odlišná úroveň čistoty podle množství zbytkových nabitých
sulfátových a karboxylových skupin, jejichž ionty mohou migrovat ke
katodě a způsobovat jev zvaný elektroendoosmóza (EEO) ⇒
neselektivní, nežádoucí tok částic
agaróza s nízkým bodem tání (<90°C) – až 4% „méně pevné“
gely, vhodné pro separaci menších molekul DNA
- izolace DNA z gelu bez denaturace
- „in-gel“ PCR nebo „in-gel“ ligace
agaróza pro „pevné“ gely – pulse field gel elfo (PFGE)agaróza pro „pevné“ gely – pulse field gel elfo (PFGE)
66
Agaróza – odlišná úroveň čistoty podle množství zbytkových nabitých
sulfátových a karboxylových skupin, jejichž ionty mohou migrovat ke
katodě a způsobovat jev zvaný elektroendoosmóza (EEO) ⇒
neselektivní, nežádoucí tok částic
agaróza s nízkým bodem tání (<90°C) – až 4% „méně pevné“
gely, vhodné pro separaci menších molekul DNA
- izolace DNA z gelu bez denaturace
- „in-gel“ PCR nebo „in-gel“ ligace
agaróza pro „pevné“ gely – pulse field gel elfo (PFGE)agaróza pro „pevné“ gely – pulse field gel elfo (PFGE)
66
Elektroforetické pufry:
TBE (Tris/kyselina boritá/EDTA)
- 0.1-3 kb DNA
- i vysoké napětí (>150 V)
TAE (Tris/kyselina octová/EDTA)
- 12-50 kb DNA
- nižší pufrovací schopnost než TBE
- nižší napětí (90-120 V)
67
VERTIKÁLNÍVERTIKÁLNÍ ELEKTROFORELEKTROFORÉZAÉZA
- polyakrylamidová (PAGE,(PAGE, polymer z akrylamidu zesíťovaný N,N‘-
methylenbisakrylamidem)
68
5-10 ng DNA
agarózová elektroforéza ⇒
100 bp až 20 kb
polyakrylamidová
elektroforéza ⇒ malé NK a
oligonukleotidy
www.tulane.edu/~wiser/methods/notes.pdf
Alberts (2015), Základy buněčné biologie. 2. vydání. Espero
Publishing, 2005. 740 s. ISBN 80-902906-2-0.
Separace NK:Separace NK:
- bez denaturujících činidel si DNA i RNA zachovává sekundární
struktury, které znemožňují separaci dle velikosti
RNA: Formaldehydový denaturační gel – agarózový gel v elektroforetickém
pufru MOPS (3-(N-morfolino)propan sulfonová kyselina) s přídavkem
formaldehydu
DNA: Denaturující alkalické gely pro DNA– agarózový gel s přídavkem
NAOH a EDTA v elektroforetickém pufru (75mM NaOH)
DNA&RNA: denaturující PAGE s močovinou nebo formaldehydem čiDNA&RNA: denaturující PAGE s močovinou nebo formaldehydem či
formamidem
69
2D AGARÓZOVÁ GELOVÁ ELEKTROFORÉZA2D AGARÓZOVÁ GELOVÁ ELEKTROFORÉZA::
- 1. rozměr – separace molekul dle velikosti: např. při nízkém
napětí v nízkoprocentní agaróze
- 2. rozměr – při vysokém napětí ve vysokoprocentní agaróze
v přítomnosti interkalační látky (EtBr) ⇒ separace molekul dle
tvaru a složistosti struktur
http://pubs.rsc.org/en/content/articlehtml/2005/mb/b509471m
http://cdn.intechopen.com/pdfs-wm/34921.pdf
70
2D PAGE ELEKTROFORÉZA2D PAGE ELEKTROFORÉZA
-- „Two„Two--dimensional strandnessdimensional strandness--dependent electrophoresis“ (2Ddependent electrophoresis“ (2D--SDE)SDE)::
- 1. rozměr ⇒ separace dle počtu řetězců, jejich délky i
konformace
- 2. rozměr - denaturace všech fragmentů na jednořetězcové
⇒ separace dle délky
Gunnarsson et al. (2007), Nature Protocols 1, 3011. 71
VIZUALIZACE SEPAROVANVIZUALIZACE SEPAROVANÝCH NK V GELUÝCH NK V GELU
•••••••• agarózový gel ⇒ ethidium bromid, SYBR Green I
•••••••• polyakrylamidový gel ⇒ ethidium bromid, stříbro,
radioaktivita, kovalentně navázané fluorescenční
sloučeniny
wiki.png
http://en.wikipedia.org/wiki/Molecular-
weight_size_marker#mediaviewer/File:DNAgel4wiki
72
KAPILÁRNÍ GELOVÁ ELEKTROFORÉZA (CGE)KAPILÁRNÍ GELOVÁ ELEKTROFORÉZA (CGE)
využívá elektrokinetických principů elektroforézy a elektroosmózy k separaci
látek uvnitř křemenné kapiláry ⇒ vysokoúčinná kapilární elektroforéza
(HPCE)
- volná kapilární elektroforéza
- gelová elektroforéza
73
https://publi.cz/books/140/02.html
delliss.people.cofc.edu
PULZNÍ GELOVÁ ELEKTROFORÉZA (PFGE)PULZNÍ GELOVÁ ELEKTROFORÉZA (PFGE)
• standardní gelová ELFO rozliší
DNA fragmenty do 75 kb
• separace velkých molekul DNA
(až 10 Mb) v měnícím se
elektrickém poli (orientace pólů o
90°, 120°, 180° atd.
• délka pulzu, orientace, chlazení,
www.tulane.edu/~wiser/methods/notes.pdf
„Contoured-Clamped
Homogeneous Electric Field“
• délka pulzu, orientace, chlazení,
pufr agaróza s nízkým EEO
• i celé buňky
• genotypování, genetický otisk
(„fingerprint“), epidemiologie
pathogenních organismů
74
SEPARACE DNA LIŠÍCÍ SE V JEDNÉ BÁZISEPARACE DNA LIŠÍCÍ SE V JEDNÉ BÁZI
• bodová mutace
SSCPSSCP = jednovláknový= jednovláknový konformační polymorfismuskonformační polymorfismus
DGGEDGGE = denaturační gradientová gelová elektroforéza= denaturační gradientová gelová elektroforéza
chemickým čchemickým činidleminidlem
TGGETGGE = denaturační gradientová gelová elektroforéza= denaturační gradientová gelová elektroforéza
teplotním gradientemteplotním gradientem
75
SSCPSSCP ((““SingleSingle--strandstrand conformationconformation polymorphismpolymorphism””))
Separace jednořetězcové DNA (denaturovaná) na nedenaturujícím
polyakrylamidovém gelu při nízké teplotě ⇒ DNA řetězec se sbalí na
základě vnitřních komplementarit a separuje se na základě odlišnosti
tání DNA fragmentů
http://www.lf2.cuni.cz/projekty/prusaDNA/newlook/defa7.htm
http://wiki.biomine.skelleftea.se/biomine
/molecular/index_11.htm
76
DGGEDGGE & TGGE& TGGE ((““DenaturingDenaturing/Temperature/Temperature Gradient GelGradient Gel
ElectrophoresisElectrophoresis””))
⇒⇒⇒⇒ Separace na základě odlišnosti tání DNA fragmentů
• posloupnost nukleotidů
• obsah GC párů
• ovlivňují průběh tání fragmentu DNA a následně rychlost
migrace v denaturačním gradientu v polyakryamidovém gelu zvyšující
se teplota, nebo koncentrace denaturantů
www.wikiskripta.eu/index.php/DGGE
http://wiki.biomine.skelleftea.se/biomine/molecular/index_11.htm
77
NK:NK: IZOLACE Z GELUIZOLACE Z GELU
http://webcast.skola-profession.cz/Pages/Player.aspx?id=41
AGARÓZOVÝ GEL
• elektroeluce
• vazba a eluze ze skleněných nebo silikátových kuliček
• elektroforéza na DEAE-celulózovou membránu
• agaróza s nízkou teplotou tání
POLYAKRYLAMIDOVÝ GEL
• metoda “crush and soak”
http://www.peqlab.co.uk/wcms/uk/products/index.php?do=getArticlesByGroup&which=Gelex
78
NUKLEOVNUKLEOVÉ KYSELINY AÉ KYSELINY A
JAK S NIMI MANIPULUJEMEJAK S NIMI MANIPULUJEME
79
EnzymyEnzymy propro manipulace s NKmanipulace s NK
(štěpení, klonování, značení atd.)(štěpení, klonování, značení atd.)
- polymerázy ⇒ syntetizují NK dle
templátu
- ligázy ⇒ spojují fragmenty DNA
- fosfatázy a kinázy ⇒ defosforylace
a fosforylace
NK:NK: MANIPULACEMANIPULACE && MODIFIKACEMODIFIKACE
80
a fosforylace
- nukleázy ⇒ štěpí fosfodiesterovou
vazbu; exonukleázy a endonukleázy
Příklady nukleázPříklady nukleáz::
Bal31 3’-exonukleáza pro ds nebo ss DNA
S1 5’-exonukleáza pro ssDNA nebo ssRNA
DNáza I ss nebo dsDNA (5’, pyr)
ExoIII 3’-exonukleáza pro dsDNA
RNáza A endonukleáza pro ssRNA (3’, pyr)
RNáza T1 Endonukleáza pro ssRNA (3’, G)
81
RestrikRestrikční endonukleázyční endonukleázy::
⇒ štěpí DNA na specifických místech
⇒ Třída II: štěpí DNA v rozpoznávacím místě
(4-8 nukleotidů), palindrom
82https://quizlet.com/25549586/genetics-flash-cards/
GENETICKÝ OTISKGENETICKÝ OTISK
83
Metody detekce bodových polymorfismů (SNP)Metody detekce bodových polymorfismů (SNP)
-- SSCP,SSCP, DGGE, TGGE
-- RFLP (RFLP (restrictionrestriction fragmentsfragments lengthlength polymorpfismuspolymorpfismus))
NK:NK: MAPOVÁNÍ SNPMAPOVÁNÍ SNP
84
• Autozomální mikrosatelity („Short Tandem Repeats“, STRs) ⇒
nekódující čtyřnukleotidové tandemově se opakující repetice
• VNTR (variabilní počet tandemových opakování) ⇒ polymorfismu
repetitivních úseků DNA
• Variabilita v populaci je délková, daná počtem repetic
85
(PCR/)RFLP (Polymorfismus v délce restrikčních fragmentů) ⇒
restrikční analýza DNA
• gDNA nebo namnožený specifický úsek naštěpíme restriktázou
• Fragmenty rozdělíme elektroforeticky
• Z gelu je přesajeme na membránu
• Membránu hybridizujeme se sondou Southern blot
NK:NK: MAPOVÁNÍMAPOVÁNÍ
• Membránu hybridizujeme se sondou Southern blot
• Navázanou sondu detekujeme
86
(PCR/)RFLP (Polymorfismus v délce restrikčních fragmentů) ⇒
restrikční analýza DNA
• gDNA nebo namnožený specifický úsek naštěpíme restriktázou
• Fragmenty rozdělíme elektroforeticky
• Z gelu je přesajeme na membránu
• Membránu hybridizujeme se sondou Southern blot
NK:NK: MAPOVÁNÍMAPOVÁNÍ
• Membránu hybridizujeme se sondou Southern blot
• Navázanou sondu detekujeme
o genetické mapování
o dědičné onemocnění
o kriminalistika
o určení otcovství
86
87
88
89
http://www.hbwbiology.net/quizzes/ch20-DNA-technology.htm
(PCR/)T-RFLP (Terminální polymorfismus v délce restrikčních
fragmentů) ⇒ restrikční analýza DNA
http://en.wikipedia.org/wiki/File:Step-by-
step_procedure_of_using_T-RFLP_analysis_in_microbiology.pdf
90
AFLP („Amplified fragment length polymorphism“)
http://www.nature.com/scitable/content/outline-of-the-aflp-procedure-41047
https://botany.natur.cuni.cz/dna/index.php?option=com_content&view=article&id=47:af
lp-princip&catid=35:aflp&Itemid=55
91
OTISK MIKROBIÁLNÍHO SPOLEČENSTVAOTISK MIKROBIÁLNÍHO SPOLEČENSTVA
92
Stanovení profilu diverzity mikrobiálního
společenstva pomocí technik mol. biologie
Odhad množství variant genu ve společenstvu
Celkový pohled na společenstvo, neřekne nic o
přímé identifikaci nebo počtech individuálních
buněk
Studium mikrobiálních systémů (vodníStudium mikrobiálních systémů (vodní
ekosystémy, půdy, lidská mikroflóra) - měření
biodiverzity, změny ve společenstvu v čase, vliv
faktorů..... sukcese společenstva, environmentální
narušení habitatu, odpověď na znečištění
polutanty
www.moloch.upol.cz/uploads/vyukovy-portal/eko-mem-rulik.pdf
93
• DGGE, TGGE, SSCP, RFLP,T-RFLP, ARDRA, ARISA
• Izolace DNA ze vzorku s mikrobiálním společenstvem
• Cílem analýzy je gen nebo specifický úsek DNA
• Častým cílem geny kódující 16S rRNA nebo geny, které
mají klíčovou roli v metabolických procesech
http://www.scielo.cl/scielo.php?pid=S0718-
27912008000200004&script=sci_arttext
94
ARDRA („Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis“)
• restrikční štěpení amplifikovaného fragmentu DNA pro
konzervativní úseky rRNA bakterií
http://entamoeba.lshtm.ac.uk/riboprnt.htm
95
RISA/ARISA („(Automated) Ribosomal Intergenic Spacer
Analysis“)
• prokaryocká DNA kodující vysoce konzervativní 16SrRNA a
23SrRNA geny
• mezi těmito dvěma geny se nachází tzv. „internal transcribed
spacer (ITS)“ region
• ITS - nekoduje proteiny, vysoce variabilní v sekvenci a délce
nukleotidů
http://en.wikipedia.org/wiki/Community_Fingerprinting
96
97