Bi5596 Moderní metody v ekotoxikologii STUDIUM RNASTUDIUM RNA && DNADNA IIII..STUDIUM RNASTUDIUM RNA && DNADNA IIII.. Co nCo násás zajímá a jak to zjistímezajímá a jak to zjistíme RNDr. Iva Sovadinová, Ph.D. sovadinova@recetox.muni.cz podzim 2015 http://www.hbwbiology.net/quizzes/ch20-DNA-technology.htm 2 http://www.hbwbiology.net/quizzes/ch20-DNA-technology.htm 3 http://www.hbwbiology.net/quizzes/ch20-DNA-technology.htm 4 http://www.hbwbiology.net/quizzes/ch20-DNA-technology.htm 5 http://www.hbwbiology.net/quizzes/ch20-DNA-technology.htm 6 http://www.hbwbiology.net/quizzes/ch20-DNA-technology.htm 7 http://www.hbwbiology.net/quizzes/ch20-DNA-technology.htm 8 http://www.hbwbiology.net/quizzes/ch20-DNA-technology.htm 9 http://www.hbwbiology.net/quizzes/ch20-DNA-technology.htm 10 http://www.hbwbiology.net/quizzes/ch20-DNA-technology.htm 11 CÍLE PŘEDNÁŠKY Jak namnožit NK Jak zjistit sekvenci NK Co to je transkriptom a k čemu nám je Co to je (eko)toxigenomika 3 Jak zapnout či vypnout gen Jak zkoumat genotoxicitu CÍLE PŘEDNÁŠKY Jak namnožit NK Jak zjistit sekvenci NK Co to je transkriptom a k čemu nám je Co to je (eko)toxigenomika 3 Jak zapnout či vypnout gen Jak zkoumat genotoxicitu CÍLE PŘEDNÁŠKY Jak namnožit NK Jak zjistit sekvenci NK Co to je transkriptom a k čemu nám je Co to je (eko)toxigenomika 3 Jak zapnout či vypnout gen Jak zkoumat genotoxicitu CÍLE PŘEDNÁŠKY Jak namnožit NK Jak zjistit sekvenci NK Co to je transkriptom a k čemu nám je Co to je (eko)toxigenomika 3 Jak zapnout či vypnout gen Jak zkoumat genotoxicitu CÍLE PŘEDNÁŠKY Jak namnožit NK Jak zjistit sekvenci NK Co to je transkriptom a k čemu nám je Co to je (eko)toxigenomika 3 Jak zapnout či vypnout gen Jak zkoumat genotoxicitu CÍLE PŘEDNÁŠKY Jak namnožit NK Jak zjistit sekvenci NK Co to je transkriptom a k čemu nám je Co to je (eko)toxigenomika 3 Jak zapnout či vypnout gen Jak zkoumat genotoxicitu CÍLE PŘEDNÁŠKY Jak namnožit NK Jak zjistit sekvenci NK Co to je transkriptom a k čemu nám je Co to je (eko)toxigenomika 3 Jak zapnout či vypnout gen Jak zkoumat genotoxicitu CO NÁS, (EKO)TOXIKOLOGYCO NÁS, (EKO)TOXIKOLOGY,, ZAJÍMÁ PŘIZAJÍMÁ PŘI STUDIU NUKLEOVÝCH KYSELINSTUDIU NUKLEOVÝCH KYSELIN?? 19 NUKLEOTIDOVÁ SEKVENCE ⇒ analýza variací POLYMORFISMUS DNA ⇒ bodový nebo repetitivní GENETICKÝ OTISK OTISK MIKROBIÁLNÍHO SPOLEČENSTVA MUTACE NK:NK: PROPROČČ ZKOUMZKOUMÁÁME?ME? GENOVÁ EXPRESE, REGULACE A FUNKCE REKOMBINACE DNA 20 NUKLEOTIDOVÁ SEKVENCE ⇒ analýza variací POLYMORFISMUS DNA ⇒ bodový nebo repetitivní GENETICKÝ OTISK OTISK MIKROBIÁLNÍHO SPOLEČENSTVA MUTACE NK:NK: PROPROČČ ZKOUMZKOUMÁÁME?ME? GENOVÁ EXPRESE, REGULACE A FUNKCE REKOMBINACE DNA 21 NUKLEOTIDOVÁ SEKVENCE ⇒ analýza variací POLYMORFISMUS DNA ⇒ bodový nebo repetitivní GENETICKÝ OTISK OTISK MIKROBIÁLNÍHO SPOLEČENSTVA MUTACE NK:NK: PROPROČČ ZKOUMZKOUMÁÁME?ME? GENOVÁ EXPRESE, REGULACE A FUNKCE REKOMBINACE DNA 22 NUKLEOTIDOVÁ SEKVENCE ⇒ analýza variací POLYMORFISMUS DNA ⇒ bodový nebo repetitivní GENETICKÝ OTISK OTISK MIKROBIÁLNÍHO SPOLEČENSTVA MUTACE NK:NK: PROPROČČ ZKOUMZKOUMÁÁME?ME? GENOVÁ EXPRESE, REGULACE A FUNKCE REKOMBINACE DNA 23 NUKLEOTIDOVÁ SEKVENCE ⇒ analýza variací POLYMORFISMUS DNA ⇒ bodový nebo repetitivní GENETICKÝ OTISK OTISK MIKROBIÁLNÍHO SPOLEČENSTVA MUTACE NK:NK: PROPROČČ ZKOUMZKOUMÁÁME?ME? GENOVÁ EXPRESE, REGULACE A FUNKCE REKOMBINACE DNA 24 NUKLEOTIDOVÁ SEKVENCE ⇒ analýza variací POLYMORFISMUS DNA ⇒ bodový nebo repetitivní GENETICKÝ OTISK OTISK MIKROBIÁLNÍHO SPOLEČENSTVA MUTACE NK:NK: PROPROČČ ZKOUMZKOUMÁÁME?ME? GENOVÁ EXPRESE, REGULACE A FUNKCE REKOMBINACE DNA 25 NUKLEOTIDOVÁ SEKVENCE ⇒ analýza variací POLYMORFISMUS DNA ⇒ bodový nebo repetitivní GENETICKÝ OTISK OTISK MIKROBIÁLNÍHO SPOLEČENSTVA MUTACE NK:NK: PROPROČČ ZKOUMZKOUMÁÁME?ME? GENOVÁ EXPRESE, REGULACE A FUNKCE REKOMBINACE DNA 26 NUKLEOTIDOVÁ SEKVENCE ⇒ analýza variací POLYMORFISMUS DNA ⇒ bodový nebo repetitivní GENETICKÝ OTISK OTISK MIKROBIÁLNÍHO SPOLEČENSTVA MUTACE NK:NK: PROPROČČ ZKOUMZKOUMÁÁME?ME? GENOVÁ EXPRESE, REGULACE A FUNKCE REKOMBINACE DNA 27 PCRPCR anebaneb JAK NAMNOŽIT SPECIFICKÝ ÚSEK NKJAK NAMNOŽIT SPECIFICKÝ ÚSEK NK??JAK NAMNOŽIT SPECIFICKÝ ÚSEK NKJAK NAMNOŽIT SPECIFICKÝ ÚSEK NK?? 28 PCRPCR:: „KOPÍRKA“ PRO DNA„KOPÍRKA“ PRO DNA PCR = „Polymerase Chain Reaction“ Polymerázová řetězová reakce objevena v roce 1983 ⇒ Kary Mullis Nobelova cen 1993 ústřední metoda v biochemii a molekulární biologii „polymerázová“ – využití DNA polymerázy ⇒ replikace in vitro „řetězová reakce“ – více reakcí za sebou, produkt první reakce se stává „šablonou“ v další reakci atd. atd. atd. atd. atd. atd. 29 PCRPCR:: „KOPÍRKA“ PRO DNA„KOPÍRKA“ PRO DNA PCR = „Polymerase Chain Reaction“ Polymerázová řetězová reakce objevena v roce 1983 ⇒ Kary Mullis Nobelova cen 1993 ústřední metoda v biochemii a molekulární biologii „polymerázová“ – využití DNA polymerázy ⇒ replikace in vitro „řetězová reakce“ – více reakcí za sebou, produkt první reakce se stává „šablonou“ v další reakci atd. atd. atd. atd. atd. atd. 30 PCRPCR:: „KOPÍRKA“ PRO DNA„KOPÍRKA“ PRO DNA PCR = „Polymerase Chain Reaction“ Polymerázová řetězová reakce objevena v roce 1983 ⇒ Kary Mullis Nobelova cen 1993 ústřední metoda v biochemii a molekulární biologii „polymerázová“ – využití DNA polymerázy ⇒ replikace in vitro „řetězová reakce“ – více reakcí za sebou, produkt první reakce se stává „šablonou“ v další reakci atd. atd. atd. atd. atd. atd. 31 240 = 1 099 511 627 776 kopií PCRPCR:: „KOPÍRKA“ PRO DNA„KOPÍRKA“ PRO DNA PCR = „Polymerase Chain Reaction“ Polymerázová řetězová reakce objevena v roce 1983 ⇒ Kary Mullis Nobelova cen 1993 ústřední metoda v biochemii a molekulární biologii „polymerázová“ – využití DNA polymerázy ⇒ replikace in vitro „řetězová reakce“ – více reakcí za sebou, produkt první reakce se stává „šablonou“ v další reakci atd. atd. atd. atd. atd. atd. 32 240 = 1 099 511 627 776 kopií 33 PCRPCR:: CCOO POTPOTŘEBUJEMEŘEBUJEME?? I.I. 1. TEMPLÁT DNA 2. PRIMERY ⇒⇒⇒⇒ krátké oligonukleotidy DNA ⇒ Specifické pro např.⇒ Specifické pro např. – gen (receptor, enzym, membránový přenašeč atd.) – kmen bakterií (16S RNA) ⇒ Nespecifické 34 PCRPCR:: CCOO POTPOTŘEBUJEMEŘEBUJEME?? I.I. 1. TEMPLÁT DNA 2. PRIMERY ⇒⇒⇒⇒ krátké oligonukleotidy DNA ⇒ Specifické pro např.⇒ Specifické pro např. – gen (receptor, enzym, membránový přenašeč atd.) – kmen bakterií (16S RNA) ⇒ Nespecifické 35 20 až 30 bazí Teplota nasedání závislá na sekvenci primerů (~ 50% obsahu GC) Neměl by tvořit sekundární struktury, zejména na 3’ konci Neměly by tvořit tzv. dimery ⇒⇒⇒⇒ komplementarita sekvencí primerů 20 až 30 bazí Teplota nasedání závislá na sekvenci primerů (~ 50% obsahu GC) Neměl by tvořit sekundární struktury, zejména na 3’ konci Neměly by tvořit tzv. dimery ⇒⇒⇒⇒ komplementarita sekvencí primerů PCRPCR:: (NE)SPECIFICKÉ PRIMERY(NE)SPECIFICKÉ PRIMERY primerů Sekvence primerů by měla končit GC ⇒⇒⇒⇒ silnější vazba ńa templát primerů Sekvence primerů by měla končit GC ⇒⇒⇒⇒ silnější vazba ńa templát 5’-ACGGATACGTTACGCTGAT-3’ 3’-GACTATTCCATGTAGACCT-5’ Primer 1 5’-ACGGATACGTTACGCTGATAAGGTACATCTGGA-3’ 3’-TGCCTATGCAATGCGACTATTCCATGTAGACCT-5’ Primer 2 36 PCRPCR:: PROGRAMY PRO DESIGNOVÁNÍPROGRAMY PRO DESIGNOVÁNÍ PRIMERŮPRIMERŮ OLIGO www.oligo.ne PRIMER3 http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi OLIGO www.oligo.ne PRIMER3 http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgihttp://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi PrimerQuest http://www.idtdna.com/primerquest/home/index http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi PrimerQuest http://www.idtdna.com/primerquest/home/index 37 PCRPCR:: CCOO POTPOTŘEBUJEMEŘEBUJEME?? II.II. 3. PŘÍSTROJ umožňující rychlé a precisní střídání teplot 95 °C ⇒⇒⇒⇒ denaturace DNA 50-60 °C ⇒⇒⇒⇒ nasednutí primerů 72 °C ⇒⇒⇒⇒ prodloužení vlákna72 °C ⇒⇒⇒⇒ prodloužení vlákna 38 Průběh PCR před vynalezením thermocykleru Průběh PCR před vynalezením thermocykleru 8 NUDNÝCH hodin !!!8 NUDNÝCH hodin !!! 95º C 5 min 95º C 5 min 35 cyklů35 cyklů 55º C 3 min 55º C 3 min 72º C 5 min 72º C 5 min 39 Průběh PCR před vynalezením thermocykleru Průběh PCR před vynalezením thermocykleru 8 NUDNÝCH hodin !!!8 NUDNÝCH hodin !!! 95º C 5 min 95º C 5 min 35 cyklů35 cyklů 55º C 3 min 55º C 3 min 72º C 5 min 72º C 5 min 40 Automatizace „Baby Blue“ (1986) Starší prototyp termocykleru Techne TC-PLUS (2010) AUTOMATIZACE G-STORM GS4 (2006) termocykleru Biometra T1 (1999) Eppendorf Mastercycler EP (2003) Biometra Toptical (2012) 41 PCRPCR:: CCOO POTPOTŘEBUJEMEŘEBUJEME?? III.III. 5. REAKČNÍ SMĚS VE ZKUMAVCE Vzorek DNA Primery pro (ne)specifickou detekci Nukleotidy Enzym – termostabilní DNA polymerázaEnzym – termostabilní DNA polymeráza 42 Taq DNA (templát) Termostabilní DNA polymeráza (Tag polymeráza) Volné deoxynukleotidy G SložkySložkyPCRPCR:: PufrPufrA C T G 43 www.zivaveda.ivb.cz Polymerázová řetězová reakce aneb Děkujeme, pane Mullis!, Mgr. Tereza Králová ddH2O Hořčík SložkySložky Primery + + A C T G VIDEO ⇒ http://www.dnalc.org/view/15475-The-cycles-of-the-polymerase-chain-reaction-PCR-3D-animation.html 1. DENATURACE 2. NASEDÁNÍ PRIMERŮ 3. PRODLUŽOVÁNÍ PRIMERŮ Clin. Microbiol. Rev. (2004) 17: 903-925 44 Obvyklé teploty & časy PCRObvyklé teploty & časy PCR 0.5 – 1 min 0.5 – 1 min 45o – 65o C45o – 65o CNasedání primerů Nasedání primerů 0.5 – 1 min 0.5 – 1 min 90o – 95o C90o – 95o CDenaturaceDenaturace 1 – 3 min 1 – 3 min 90o – 95o C90o – 95o CPočáteční denaturace Počáteční denaturace 20 – 40 cyklů 20 – 40 cyklů 4o C4o CUkončení reakce Ukončení reakce 5 – 10 min 5 – 10 min 70o – 75o C70o – 75o CKonečné prodlužování Konečné prodlužování 0.5 – 2 min 0.5 – 2 min 70o – 75o C70o – 75o CProdlužování primerů Prodlužování primerů 45 Obvyklé teploty & časy PCRObvyklé teploty & časy PCR 0.5 – 1 min 0.5 – 1 min 45o – 65o C45o – 65o CNasedání primerů Nasedání primerů 0.5 – 1 min 0.5 – 1 min 90o – 95o C90o – 95o CDenaturaceDenaturace 1 – 3 min 1 – 3 min 90o – 95o C90o – 95o CPočáteční denaturace Počáteční denaturace 20 – 40 cyklů 20 – 40 cyklů 94ºC94ºC 94ºC94ºC 55ºC55ºC 72ºC72ºC3 min3 min 1 min1 min 45 sec45 sec 1 min1 min Počáteční denaturacePočáteční denaturace 1X1X 35X35X 1X1X 4o C4o CUkončení reakce Ukončení reakce 5 – 10 min 5 – 10 min 70o – 75o C70o – 75o CKonečné prodlužování Konečné prodlužování 0.5 – 2 min 0.5 – 2 min 70o – 75o C70o – 75o CProdlužování primerů Prodlužování primerů nasedánínasedání 4ºC4ºC 45 sec45 sec ∞ udržování∞ udržování Počáteční denaturace DNA Počáteční denaturace DNA prodlouženíprodloužení denaturacedenaturace 46 po n-tém cyklu => 2n molekul DNApo n-tém cyklu => 2n molekul DNA 47 PCRPCR:: JAK DETEKUJEME NAMNOŽENÉ KOPIEJAK DETEKUJEME NAMNOŽENÉ KOPIE DNA?DNA? GELOVÁ ELEKTROFORÉZA horizontální elektroforéza na agarózovém gelu DNA fragmenty: 100 až 500 pb potvrzení specificity fragmentu http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html 48 fragmentu sekvenačními metodami PCRPCR:: JAK DETEKUJEME NAMNOŽENÉ KOPIEJAK DETEKUJEME NAMNOŽENÉ KOPIE DNA?DNA? GELOVÁ ELEKTROFORÉZA horizontální elektroforéza na agarózovém gelu DNA fragmenty: 100 až 500 pb potvrzení specificity fragmentu http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html ⇒KONVENČNÍ PCR („end-point“ PCR) 49 fragmentu sekvenačními metodami KONVENČNÍ PCRKONVENČNÍ PCR:: LIMITACELIMITACE http://www.labome.com/method/Current-PCR-Methods.html 50 ↓↓↓↓ citlivost ↓↓↓↓ rozlišení ↓↓↓↓ dynamický rozsah < 2 logs neautomatizovatelná pouze rozlišení velikosti KONVENČNÍ PCRKONVENČNÍ PCR:: LIMITACELIMITACE ethidium bromid je spíše pro semikvantitativní barvení 51 qPCRqPCR:: DETEKCE V REÁLNÉM ČASEDETEKCE V REÁLNÉM ČASE kvantitativní PCRkvantitativní PCR http://www.gene-quantification.de/block.html 52 ⇒ fluorescenční barva vázající se na dsDNA qPCRqPCR:: SYBR GREEN ISYBR GREEN I http://www.sigmaaldrich.com/life-science/molecular-biology/pcr/quantitative-pcr/sybr-green-based- qpcr/syber-green-animation.html 53 ⇒ fluorescenční barva vázající se na dsDNA qPCRqPCR:: SYBR GREEN ISYBR GREEN I http://www.sigmaaldrich.com/life-science/molecular-biology/pcr/quantitative-pcr/sybr-green-based- qpcr/syber-green-animation.html 54 DeBiasi R L , and Tyler K L Clin. Microbiol. Rev. 2004;17:903-925 55 DeBiasi R L , and Tyler K L Clin. Microbiol. Rev. 2004;17:903-925 https://dna.utah.edu/LightCycler/Top_LightCycler.html 56 ⇒⇒⇒⇒ limitace ⇒⇒⇒⇒ SYBRG GREEN se váže nespecificky na jakoukoliv dsDNA (“primer-dimer”, nespecifický produkt atd.) http://hrm-dyes.gene-quantification.info/ https://dna.utah.edu/LightCycler/Top_LightCycler.html 57 Fluorescenčně značené próby vázající se specificky na cílový produkt PCR qPCRqPCR:: PRÓBYPRÓBY DeBiasi R L , and Tyler K L Clin. Microbiol. Rev. 2004;17:903-925 58 http://www.labome.com/method/Current-PCR-Methods.html 59 http://www.labome.com/method/Current-PCR-Methods.html 60 qPCRqPCR:: KVANTIFIKACEKVANTIFIKACE 61 qPCRqPCR:: KVANTIFIKACEKVANTIFIKACE 62 RTRT--((qq))PCRPCR:: PCR PRO RNAPCR PRO RNA “Reverse transcription polymerase chain reaction“ RNA (total, mRNA, miRNA) Reverzní transkriptáza Primery pro RT: oligodToligodT specifický primer náhodný primer VIDEO ⇒⇒⇒⇒ https://www.youtube.com/watch?v=0 MJIbrS4fbQ http://en.wikipedia.org/wiki/Reverse_transcription_polymerase_chain_reaction 63 RTRT--((qq))PCRPCR:: PCR PRO RNAPCR PRO RNA “Reverse transcription polymerase chain reaction“ RNA (total, mRNA, miRNA) Reverzní transkriptáza Primery pro RT: oligodToligodT specifický primer náhodný primer VIDEO ⇒⇒⇒⇒ https://www.youtube.com/watch?v=0 MJIbrS4fbQ http://en.wikipedia.org/wiki/Reverse_transcription_polymerase_chain_reaction 64 RTRT--((qq))PCRPCR:: KRITÉRIA ÚSPĚŠNOSTIKRITÉRIA ÚSPĚŠNOSTI http://www.gene-quantification.de/optimization2.html#overview 65 RTRT--((qq))PCRPCR:: KRITÉRIA ÚSPĚŠNOSTIKRITÉRIA ÚSPĚŠNOSTI http://www.gene-quantification.de/optimization2.html#overview 66 (RT)(RT)--((qq))PCRPCR:: KONTROLYKONTROLY KONTROLA „no-RT“ ⇒⇒⇒⇒ bez reverzní transkriptázy kontaminace genomovou DNA (využití primerů vázajících se na introny) kontaminace DNA PCR KONTROLA „NTC“⇒⇒⇒⇒ bez DNA templátu (DNA, cDNA) kontaminace DNAkontaminace DNA nespecifické produkty POZITIVNÍ KONTROLY http://bitesizebio.com/4074/the-pcr-controls-you-must-use/ 67 RTRT--((qq))PCRPCR:: KVANTIFIKACEKVANTIFIKACE využívá tzv. REFERENČNÍ GENY “housekeeping genes” http://www.gene-quantification.de/strategy.html stabilní exprese GAPDH, ββββ-Aktin, 18S RNA 68 RTRT--((qq))PCRPCR:: PUBLIKOVATELNOST DATPUBLIKOVATELNOST DAT The MIQE Guidelines - Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments Clinical Chemistry 2009, 55(4): 611-622 http://miqe.gene-quantification.info/ http://www.rdml.org/MIQE_checklist.pdf 69 RTRT--((qq))PCRPCR:: PUBLIKOVATELNOST DATPUBLIKOVATELNOST DAT The MIQE Guidelines - Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments Clinical Chemistry 2009, 55(4): 611-622 http://miqe.gene-quantification.info/ http://www.rdml.org/MIQE_checklist.pdf 70 „direct“ PCR • PCR bez přečištěné DNA nebo RNA ((RTRT))--((qq))PCRPCR:: ModifikaceModifikace 71 multiplex PCR • v jedné PCR směsi vícero primerových párů/prób 72 PCR ARRAY • více sad primerů ve 96j nebo 384j desce • exprese až 88 genů (96j deska) • stanovuje specifické produkty v jednotlivých jamkách desky • referenční geny • biologické dráhy ⇒ oprava DNA, buněčný cyklus, oxidativní stres, apoptóza, cytokiny & zánět, signální dráhy atd.stres, apoptóza, cytokiny & zánět, signální dráhy atd. 73 PCR ARRAY • více sad primerů ve 96j nebo 384j desce • exprese až 88 genů (96j deska) • stanovuje specifické produkty v jednotlivých jamkách desky • referenční geny • biologické dráhy ⇒ oprava DNA, buněčný cyklus, oxidativní stres, apoptóza, cytokiny & zánět, signální dráhy atd.stres, apoptóza, cytokiny & zánět, signální dráhy atd. 74 PCR čip • mikrofluidní čip • rychlejší • není nutná standardní křivka při absolutní kvantifikaci • vysoká citlivost 75 PCR čip • mikrofluidní čip • rychlejší • není nutná standardní křivka při absolutní kvantifikaci • vysoká citlivost 76Lab Chip, 2008,8, 2121-2127 PCR čip • mikrofluidní čip • rychlejší • není nutná standardní křivka při absolutní kvantifikaci • vysoká citlivost 77Lab Chip, 2008,8, 2121-2127 dPCR („digital PCR“) a ddPCR („droplet digital PCR“) • alternativní metoda ke konvenční qPCR využívaná např. pro detekci vzácných alel a sekvencí a při analýze 1 buňky • mnoho individuálních, paralelních PCR reakcí • absolutní kvantifikace • kombinace nanofluidního čipu, microarray či točící se mikrofluidní disk a TaqMan® prób http://www.bio-rad.com/de-de/applications-technologies/digital-pcr dPCR („digital PCR“) a ddPCR („droplet digital PCR“) • alternativní metoda ke konvenční qPCR využívaná např. pro detekci vzácných alel a sekvencí a při analýze 1 buňky • mnoho individuálních, paralelních PCR reakcí • absolutní kvantifikace • kombinace nanofluidního čipu, microarray či točící se mikrofluidní disk a TaqMan® prób http://www.bio-rad.com/de-de/applications-technologies/digital-pcr dPCR („digital PCR“) a ddPCR („droplet digital PCR“) • alternativní metoda ke konvenční qPCR využívaná např. pro detekci vzácných alel a sekvencí a při analýze 1 buňky • mnoho individuálních, paralelních PCR reakcí • absolutní kvantifikace • kombinace nanofluidního čipu, microarray či točící se mikrofluidní disk a TaqMan® prób http://www.bio-rad.com/de-de/applications-technologies/digital-pcr Experimental needs PCR method Advantages Limitations determine if a target NA sequence is present or absent in a few samples standard or conventional •easy access to equipment •minimal cost •qualitative results only •post reaction handling determine quantities of target NA in many samples real-time •can generate quantitative results •can be sequence specific •more expensive than conventional •PCR speed is mid- level determine quantities •up to 88 genes can •one array is needed determine quantities of many target NA for a few samples PCR arrays •up to 88 genes can be measured per sample at a time •one array is needed per sample •costly for many samples detect target NA in the field microfluidic chip •fast results •small size •portable •specialized equipment •costly detect very low abundance NA targets or need extremely accurate quantitation digital and drop digital •very precise absolute quantitation •specialized equipment •costly http://www.labome.com/method/Current-PCR-Methods.html 81 AFLP („Amplified fragment length polymorphism“) ⇒ Polymorfismus délky amplifikovaných fragmentů Princip • metoda založená na restrikci DNA dvěma enzymy • selektivní namnožení jen některých proužků • vizualizace proužků na gelu ((qq))PCRPCR:: VYUŽITÍVYUŽITÍ • vizualizace proužků na gelu Využití • polymorfismus DNA • genetická variabilita • fylogenetické studie 82 AFLP („Amplified fragment length polymorphism“) ⇒ Polymorfismus délky amplifikovaných fragmentů Princip • metoda založená na restrikci DNA dvěma enzymy • selektivní namnožení jen některých proužků • vizualizace proužků na gelu ((qq))PCRPCR:: VYUŽITÍVYUŽITÍ • vizualizace proužků na gelu Využití • polymorfismus DNA • genetická variabilita • fylogenetické studie http://www.nature.com/scitable/content/outline-of-the-aflp-procedure-41047 https://botany.natur.cuni.cz/dna/index.php?option=com_content&view=article&i d=47:aflp-princip&catid=35:aflp&Itemid=55 83 RAPD („Random Amplified Polymorphic“ DNA) • krátké nespecifické primery (8–12 nukleotidů) • není potřeba znát sekvenci celé genomové DNA nebo studovaného úseku • VYUŽITÍ fylogeneze DNA polymorfimus genetický otiskgenetický otisk otisk mikrobiální komunity 84 RAPD („Random Amplified Polymorphic“ DNA) • krátké nespecifické primery (8–12 nukleotidů) • není potřeba znát sekvenci celé genomové DNA nebo studovaného úseku • VYUŽITÍ fylogeneze DNA polymorfimus genetický otisk RAPD genetický otisk otisk mikrobiální komunity http://www.majordifferences.com/2013/02/difference-between-rapd-andrflp.html#.VDD5SBawRSM 85 RAPD („Random Amplified Polymorphic“ DNA) • krátké nespecifické primery (8–12 nukleotidů) • není potřeba znát sekvenci celé genomové DNA nebo studovaného úseku • VYUŽITÍ fylogeneze DNA polymorfimus genetický otisk RAPD RFLP genetický otisk otisk mikrobiální komunity http://www.majordifferences.com/2013/02/difference-between-rapd-andrflp.html#.VDD5SBawRSM 86 SSH-PCR („Suppression subtractive hybridization“ PCR) • dovoluje namnožit pouze cDNA fragmenty, které se liší mezi kontrolou („driver“) a experimentální skupinou („test“) https://cellularphysiology.wikispaces.com/Suppression+subtractive+hybridization+ %28SSH%29 87 ((qq))PCRPCR:: APLIKACEAPLIKACE o klonování DNA o sekvenace DNA o fylogenetické analýzy založené na DNA o genetická diverzita o genetický otisko genetický otisk o detekce genu o exprese genu a jejich funkce o mutace 88 Typy sekvencí DNA • jedinečné sekvence ⇒ geny (člověk – 80-100 000) • repetitivní sekvence ⇒ tandemové - bloky opakujících se repetitivních sekvencí uspořádaných za sebou ((qq))PCRPCR:: POLYMORFISMUS DNAPOLYMORFISMUS DNA sekvencí uspořádaných za sebou satelitní DNA minisatelitní DNA mikrosatelitní DNA ⇒ rozptýlené SINE – krátké rozptýlené repetice LINE – dlouhé rozptýlené repetice 89 VNTR – variabilní počet tandémových repetitivních sekvencí http://www.thenakedscientists.com/HTML/uplo ads/tx_naksciimages/dalya8_vntr_diagram.gif Typy sekvencí DNA • jedinečné sekvence ⇒ geny (člověk – 80-100 000) • repetitivní sekvence ⇒ tandemové - bloky opakujících se repetitivních sekvencí uspořádaných za sebou ((qq))PCRPCR:: POLYMORFISMUS DNAPOLYMORFISMUS DNA sekvencí uspořádaných za sebou satelitní DNA minisatelitní DNA mikrosatelitní DNA ⇒ rozptýlené SINE – krátké rozptýlené repetice LINE – dlouhé rozptýlené repetice 90 VNTR – variabilní počet tandémových repetitivních sekvencí http://www.thenakedscientists.com/HTML/uplo ads/tx_naksciimages/dalya8_vntr_diagram.gif Mikrosatelity • krátké tandemové repetice STR („short tandem repeats“) • repetice jednoduchých sekvencí SSR („simple sequence repeats“) • kódující i nekódující oblasti • hlavní zdroj vysoké proměnlivosti – sklouznutí nukleotidového řetězce během replikace („replication slippage“) • alely se liší delkou 91 Osobní stránky K. Mullise, obsahují popis objevu a principu PCR (vč. videa) http://www.karymullis.com/pcr.shtml Video o průběhu PCR http://www.youtube.com/watch?v=2KoLnIwoZKU PCR song, povedená píseň firmy BioRad PCRPCR:: UUŽITEČNÉ ODKAZY I.ŽITEČNÉ ODKAZY I. PCR song, povedená píseň firmy BioRad http://www.youtube.com/watch?v=x5yPkxCLads PCR song, text http://bio- rad.cnpg.com/lsca/videos/ScientistsForBetterPCR/assets/BioRad_PCRsong_Ly rics.pdf 92 93 PCRPCR:: UUŽITEČNÉ ODKAZY II.ŽITEČNÉ ODKAZY II. Kvantifikace qPCR http://www.gene-quantification.de Fóra, diskusní skupiny http://www.researchgate.net/topics http://www.bio.net/ www.molecularstation.comwww.molecularstation.com www.protocol-online.org molecularbiology.forums.biotechniques.com www.scienceforums.net www.biotechnologyforums.com www.biology-online.org 94 JAK ZJISTÍME SEKVENCI NKJAK ZJISTÍME SEKVENCI NK??JAK ZJISTÍME SEKVENCI NKJAK ZJISTÍME SEKVENCI NK?? 95 NK:NK: SEKVENOVÁNÍSEKVENOVÁNÍ –– „klasika“„klasika“ 1) Předstupeň: PCR s použitím dvojice primerů • namnožení studovaného úseku DNA 2) Sekvenační reakce • použití pouze jednoho primeru • produkce fragmentů lišících se přesně o 1 bázi• produkce fragmentů lišících se přesně o 1 bázi 3) Elektroforetická separace fragmentů na gelu 96 SEKVENOVÁNÍSEKVENOVÁNÍ:: SANGEROVA METODASANGEROVA METODA Sangerova metoda terminace řetězce • založena na terminaci replikace nového řetězce podle matrice zkoumané sekvence dideoxynukleozidtrifosfátem (ddNTP) • na 3’-uhlíku deoxyribózy chybí OH - skupina a proto k nim DNA polymeráza nemůže navázat dalšíproto k nim DNA polymeráza nemůže navázat další nukleotid • pokud během replikace dojde k náhodné inkorporaci dideoxynukelotidu (ddA, ddC, ddG, ddT), replikace se zde zastaví 97 https://www.youtube.com/watch?v=oYpllbI0qF8 http://biologie.upol.cz/metody/Sekvenovani%20DNA.htm 98 https://www.youtube.com/watch?v=oYpllbI0qF8 http://biologie.upol.cz/metody/Sekvenovani%20DNA.htm 99 SEKVENOVÁNÍSEKVENOVÁNÍ:: DATABÁZE DNADATABÁZE DNA 100 EntrezEntrez: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Class/MLACourse/Original8Hour/Entrez/ - prohledává všechny databáze asociované s NCBI („National Center for Biotechnology Information“) – např. databáze „Nucleotide“, „Gene“, „Genome“ GenBankGenBank: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ - název místa, délka sekvence, typ molekuly (DNA/RNA), NK:NK: KdeKde najnajítít či porovnatči porovnat sekvencsekvencii?? 101 - název místa, délka sekvence, typ molekuly (DNA/RNA), nukleotidová sekvence EMBLEMBL: http://www.embl.de/ - databáze Evropského bioinformačního institutu http://molbiol-tools.ca/ - sekvence a jejich analýza SEKVENOVÁNÍSEKVENOVÁNÍ:: SANGEROVA METODASANGEROVA METODA -- limitacelimitace Sangerova metoda – limitace: • nutná PCR amplifikace či klonování jednotlivých DNA fragmentů • sekvenace jednotlivých DNA fragmentů (v 1 sekvenačním běhu ⇒⇒⇒⇒ max. 96 vzorků - 96sekvenačním běhu ⇒⇒⇒⇒ max. 96 vzorků - 96 kapilárové sekvenátory) • délka získané sekvence cca 650 bp • max. sekvenační výtěžek jednoho sekvenačního běhu cca 60 kb 102 SEKVENOVÁNÍSEKVENOVÁNÍ:: SEKVENOVÁNÍ NOVÉSEKVENOVÁNÍ NOVÉ GENERACEGENERACE „Next generation sequencing“: Paralelizace procesu sekvenování, kdy dochází k sekvenování tisíců až milionů sekvencí současně: 1. templátová DNA fragmentovaná na úseky několika set bází dlouhé 2. konce získaných fragmentů jsou enzymatickou reakcí zatupeny a napojeny k oligonukleotidům určité sekvence (tzv. adaptéry) 3. jednotlivé fragmenty jsou odděleně amplifikovány PCR reakcí (u některých technologií tento krok chybí) a pak v jednom kroku paralelně sekvenovány. Při tomto paralelním sekvenování se sekvenují milióny sekvencí najednou. • Délka získaných sekvencí je cca 20-700 bp. Sekvenační výtěžek jednoho běhu sekvenátoru může být až několik tisíc Gb, přičemž cena sekvenování za 1 b je až o dva řády nižší než by byla u kapilárního sekvenování Sangerovou metodou. http://web.natur.cuni.cz/zoologie/biodiversity/prednasky/GenetickeMetody VZoologii/Prednasky_2014/NextGenerationSequencing_2014.pdf 103 SEKVENOVÁNÍSEKVENOVÁNÍ:: SEKVENOVÁNÍ NOVÉSEKVENOVÁNÍ NOVÉ GENERACEGENERACE -- VyužitíVyužití • celogenomové sekvenování, tzn. de novo sekvenování neznámých genomů • sekvenování jednotlivých chromosomů, plazmidů či mitochondrií • studium genetické variability, mutační analýzu, kvantifikaci jednotlivých alel • transkriptomovou analýzu („RNA-sequencing“) – analýza exprese kódující i nekódující RNA v genomu • studium DNA-proteinových interakcí („ChIP-sequencing“) • metagenomika (analýza biologické diverzity) – např. pro genotypizaci baktéri http://labguide.cz/sekvenovani-nove-generace/ 104 105 SEKVENOVÁNÍSEKVENOVÁNÍ:: SEKVENOVÁNÍ NOVÉSEKVENOVÁNÍ NOVÉ GENERACEGENERACE -- PlatformyPlatformy 106 http://inovace-mbb.upol.cz/files/vyukovy-portal/portal-old/genomika_- _simkova/sekvenovani-web.pdf SEKVENOVÁNÍSEKVENOVÁNÍ:: PCR v emulzi (PCR v emulzi (emPCRemPCR)) PCR v emulzi (emPCR) • fyzické oddělení jednotlivých fragmentů NK Čtení sekvence • sekvenování syntézou („sequencing by synthesis“) •sekvenování založeném na ligaci („ligation based sequencing“) 107 http://inovace-mbb.upol.cz/files/vyukovy-portal/portal-old/genomika_- _simkova/sekvenovani-web.pdf SEKVENOVÁNÍSEKVENOVÁNÍ:: PCR v emulzi (PCR v emulzi (emPCRemPCR)) PCR v emulzi (emPCR) • fyzické oddělení jednotlivých fragmentů NK Čtení sekvence • sekvenování syntézou („sequencing by synthesis“) •sekvenování založeném na ligaci („ligation based sequencing“) 108 http://inovace-mbb.upol.cz/files/vyukovy-portal/portal-old/genomika_- _simkova/sekvenovani-web.pdf SEKVENOVÁNÍSEKVENOVÁNÍ:: PYROSEKVENOVÁNÍPYROSEKVENOVÁNÍ Pyrosekvenování ⇒založeno na cyklických reakcích (přidávání T, A, G, C, T, A, ...) a uvolnění pyrofosfátu v případě, že se inkorporovala specifická báze ⇒ následuje kaskáda reakcí, která na konci vede k emisi⇒ následuje kaskáda reakcí, která na konci vede k emisi viditelného světla ⇒ před dalším cyklem - degradace neinkorporovaného nukleotidu. 109 http://inovace-mbb.upol.cz/files/vyukovy-portal/portal-old/genomika_- _simkova/sekvenovani-web.pdf SEKVENOVÁNÍSEKVENOVÁNÍ:: PYROSEKVENOVÁNÍPYROSEKVENOVÁNÍ Pyrosekvenování ⇒založeno na cyklických reakcích (přidávání T, A, G, C, T, A, ...) a uvolnění pyrofosfátu v případě, že se inkorporovala specifická báze ⇒ následuje kaskáda reakcí, která na konci vede k emisi⇒ následuje kaskáda reakcí, která na konci vede k emisi viditelného světla ⇒ před dalším cyklem - degradace neinkorporovaného nukleotidu. 110 RNA-seq (RNA Sequencing), "Whole Transcriptome Shotgun Sequencing"("WTSS") • sekvenování RNA (total, mRNA, siRNA, miRNA atd.) http://www.labome.com/method/RNA-seq-Using-Next-Generation-Sequencing.html#ref2111 • Stanovení genové exprese • Objevení a popsání všech transkriptů • Charakterizace alternativního sestřihu (hranice exonintron) a polyadenylace http://rnaseq.uoregon.edu/ 112 • Stanovení genové exprese • Objevení a popsání všech transkriptů • Charakterizace alternativního sestřihu (hranice exonintron) a polyadenylace Front. Plant Sci., 28 August 2012 http://rnaseq.uoregon.edu/ 113 Transl Lung Cancer Res 2013;2(2):87-91 114 JAK STUDUJEME INTERAKCE GENŮ AJAK STUDUJEME INTERAKCE GENŮ A PROSTŘEDÍPROSTŘEDÍ??PROSTŘEDÍPROSTŘEDÍ?? 115 NKNK:: TRANSKRIPTOMIKATRANSKRIPTOMIKA Aquatic Toxicology 67 (2004) 143–154 116 NATURE REVIEWS | GENETICS VOLUME 5 | DECEMBER 2004 | 937 117 NATURE REVIEWS | GENETICS VOLUME 5 | DECEMBER 2004 | 937 118 TRANSKRIPTOMIKATRANSKRIPTOMIKA:: METODYMETODY TRANSKRIPTOM ⇒⇒⇒⇒ výčet a kvantifikace RNA v buňce, tkáni nebo organismu (mRNA, microRNA, siRNA, dlouhá nekódující RNA) METODY ⇒⇒⇒⇒ RT-qPCR ⇒⇒⇒⇒ RNA-seq ⇒⇒⇒⇒ microarray 119 TRANSKRIPTOMIKATRANSKRIPTOMIKA:: DNADNA arrayarray a čipa čip DNA ARRAY a čipy • dvouřetězcové úseky molekul cDNA (komplementární DNA) vzniklé reverzní transkripcí mRNA • oligonukleotidové sondy sekvenčně specifické pro každý gen z genomu • hybridizační technika• hybridizační technika • vychází z tzv. Northern blotu ⇒ imobilizována mRNA se hybridizuje se značenou probou reprezentující jeden gen • geny nebo fragmenty genů (cDNA, EST – „expressed sequence tag“) jsou roboticky v přesně daných souřadnicích umístěny na mikroskopické sklo (plast) 120 PRINCIP • funguje na principu specifické hybridizace ⇒ na principu párování komplementárních bází nukleotidů (spojení vodíkovými můstky) • destička (skleněná nebo silikonová) s mnoha (běžně desetitisíci, statisíci, výjimečně až miliony) vzorky jednořetězcových DNA oligonukleotidů Klin. Biochem. Metab., 14 (35), 2006, No. 2, p. 89–95.121 POSTUP: 1. Vytvoření DNA čipu Navázáním oligonukleotidu (sondy) kovalentní vazbou na destičku 2. Příprava vzorku (cDNA) nezbytný krok označení molekul (fluorescentní, radioaktivní) a denaturace 3. Hybridizace vzorku s čipem nanesení vzorku na čipnanesení vzorku na čip 4. Omytí čipu sondy pevně přichycené kovalentní vazbou k povrchu čipu a molekuly vzorku přichycené dostatečně pevně na sondách. 5. Skenování čipu Vícekanálový skener 6. Zpracování výsledků podle intenzity vyzářeného světla lze určit množství komplementárních molekul přítomných ve vzorku http://www.molbio.upol.cz/stranky/vyuka/cgi/5.pdf122 POSTUP: 1. Vytvoření DNA čipu Navázáním oligonukleotidu (sondy) kovalentní vazbou na destičku 2. Příprava vzorku (cDNA) nezbytný krok označení molekul (fluorescentní, radioaktivní) a denaturace 3. Hybridizace vzorku s čipem nanesení vzorku na čipnanesení vzorku na čip 4. Omytí čipu sondy pevně přichycené kovalentní vazbou k povrchu čipu a molekuly vzorku přichycené dostatečně pevně na sondách. 5. Skenování čipu Vícekanálový skener 6. Zpracování výsledků podle intenzity vyzářeného světla lze určit množství komplementárních molekul přítomných ve vzorku http://www.molbio.upol.cz/stranky/vyuka/cgi/5.pdf123 POSTUP: 1. Vytvoření DNA čipu Navázáním oligonukleotidu (sondy) kovalentní vazbou na destičku 2. Příprava vzorku (cDNA) nezbytný krok označení molekul (fluorescentní, radioaktivní) a denaturace 3. Hybridizace vzorku s čipem nanesení vzorku na čipnanesení vzorku na čip 4. Omytí čipu sondy pevně přichycené kovalentní vazbou k povrchu čipu a molekuly vzorku přichycené dostatečně pevně na sondách. 5. Skenování čipu Vícekanálový skener 6. Zpracování výsledků podle intenzity vyzářeného světla lze určit množství komplementárních molekul přítomných ve vzorku http://www.molbio.upol.cz/stranky/vyuka/cgi/5.pdf124 Cell Biosci. 2012;2:26 125 NATURE REVIEWS | GENETICS VOLUME 5 | DECEMBER 2004 | 937 126 Aquatic Toxicology 67 (2004) 143–154 127 TRENDS in Biotechnology Vol.25 No.10 128 JAK VYTVOŘIT REKOMBINANTNÍ MODELJAK VYTVOŘIT REKOMBINANTNÍ MODEL PRO (EKO)TOXIKOLOGIIPRO (EKO)TOXIKOLOGII??PRO (EKO)TOXIKOLOGIIPRO (EKO)TOXIKOLOGII?? 129129 REKOMBINACE DNAREKOMBINACE DNA:: REPORTÉROVÉREPORTÉROVÉ MODELYMODELY http://worldwide.promega.com/resources/multimedia/reporter-assays- and-transfection/introduction-to-reporter-gene-assays/ 130 REKOMBINACE DNAREKOMBINACE DNA:: REPORTÉROVÉREPORTÉROVÉ MODELYMODELY http://worldwide.promega.com/resources/multimedia/reporter-assays- and-transfection/introduction-to-reporter-gene-assays/ 131 http://en.wikipedia.org/wiki/Biomolecular_engineering 132 1. Promoter nebo 3’UTR responzivního elementu 2. Tvorba plazmidu a jeho namnožení (restrikční enzymy, klonování, selekce a izolace plazmidů) 3. Přenesení konstruktu3. Přenesení konstruktu (plazmidu) do buněk = transfekce http://www.activemotif.com/catalog/900/lightswitch-luciferase-assay-system 133 http://worldwide.promega.com 134 EHP 120 (2012): 990 135 REKOMBINACE DNAREKOMBINACE DNA:: JAKJAK VYPNOUTVYPNOUT//ZAPNOUT GENZAPNOUT GEN?? “GENE KNOCK OUT” ⇒ kombinace technik vede k vyřazení genu z provozu ⇒ DNA konstrukt přenesen do buněčné kultury ⇒ u zvířat jsou embryonální kmenové buňky geneticky upraveny a vneseny do ranního stádia embryaupraveny a vneseny do ranního stádia embrya „GENE KNOCK-IN“ jedná se o nahrazení genu, ne o jeho vymazání „GENE KNOCK-DOWN“ jedná se o snížení či inhibici genové exprese 136 REKOMBINACE DNAREKOMBINACE DNA:: JAKJAK VYPNOUTVYPNOUT//ZAPNOUT GENZAPNOUT GEN?? “GENE KNOCK OUT” ⇒ kombinace technik vede k vyřazení genu z provozu ⇒ DNA konstrukt přenesen do buněčné kultury ⇒ u zvířat jsou embryonální kmenové buňky geneticky upraveny a vneseny do ranního stádia embryaupraveny a vneseny do ranního stádia embrya „GENE KNOCK-IN“ jedná se o nahrazení genu, ne o jeho vymazání „GENE KNOCK-DOWN“ jedná se o snížení či inhibici genové exprese 137 138 http://www.nobelprize.org/nobel_ prizes/medicine/laureates/2007/aprizes/medicine/laureates/2007/a dvanced.html 139 “siRNA”, ribozymy, 140 JAK STUDUJEME GENO(EKO)TOXICITUJAK STUDUJEME GENO(EKO)TOXICITU?? 141 GENOTOXICITAGENOTOXICITA:: COMET ASSAYCOMET ASSAY httphttp:://www//www..sigmaaldrichsigmaaldrich..com/lifecom/life--science/cellscience/cell--biology/cancerbiology/cancer--research/learningresearch/learning-- center/cancercenter/cancer--researchresearch--protocols/cometprotocols/comet--assayassay..htmlhtml 142 GENOTOXICITAGENOTOXICITA:: COMET ASSAYCOMET ASSAY httphttp:://www//www..sigmaaldrichsigmaaldrich..com/lifecom/life--science/cellscience/cell--biology/cancerbiology/cancer--research/learningresearch/learning-- center/cancercenter/cancer--researchresearch--protocols/cometprotocols/comet--assayassay..htmlhtml http://cometassayuoc.blogspot.cz/2010/03/introduction-to-comet-assay.html 143 GENOTOXICITAGENOTOXICITA:: MIKROJÁDROVÝ TESTMIKROJÁDROVÝ TEST http://www.gentronix.co.uk/product/micro-nucleus-test/ 144 GENOTOXICITAGENOTOXICITA:: FISHFISH –– „Fluorescence in„Fluorescence in situsitu hybridizationhybridization““ http://www.nature.com/scitable/topicpage/fluorescence-in-situ-hybridization-fish-327# 145 GENOTOXICITAGENOTOXICITA:: FISHFISH –– „Fluorescence in„Fluorescence in situsitu hybridizationhybridization““ http://www.nature.com/scitable/topicpage/fluorescence-in-situ-hybridization-fish-327# 146 GENOTOXICITAGENOTOXICITA:: FISHFISH –– „Fluorescence in„Fluorescence in situsitu hybridizationhybridization““ http://www.nature.com/scitable/topicpage/fluorescence-in-situ-hybridization-fish-327# 147 http://commons.wikimedia.org/wiki/File:FISH_%28Fluorescent_In_Situ_Hybridization%29.jpg 148 149