1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif STUDIUM ÚČINKŮ – metabolity Analýza malých molekul v (eko)toxikologii Lucie Bláhová, MU, RECETOX 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Schéma přednášky •Metabolity a metabolomika •Přírodní látky •Význam vybraných metabolitů a přírodních látek • •Metody stanovení –Extrakce à Separace à Detekce – •Příklady –Thioly (GSH) –Analýza lipidů 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif http://www.duchodovareforma.cz/wp-content/uploads/2012/12/premier_lid%C3%A9-mus%C3%AD-dostat-objekt ivn%C3%AD-informace-o-II.-piliri.jpg http://pharmacometabolomics.duhs.duke.edu/files/pictures/illustration%20website%20front%20page%20no %20title.PNG Metabolity Léčiva Nutrienty Xenobiotika Sekundární metabolity Side effect Metabolity: část systémové biologie 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif https://encrypted-tbn2.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcTz7GSK09nHEiEX2_Y4whFXMxIhTSF9S_H8PH162chj99G xl4f0 Metabolity a malé molekuly https://encrypted-tbn1.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcTF8aspliB7WErkLbQZVI7t6mBzMVux2ACQ-U41_nWp9V0 cK4Py https://encrypted-tbn1.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcSv4k9zwl-eTBSaPUyEVW3wetx9hFmk6PSxbu2YNreq1FX 1f_2_ http://mikrobiologie.xf.cz/files/imgs/fos-cyk-bac.png 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif http://genomemedicine.com/sites/3008/images/Diseasemetabolomics.png METABOLOMIKA 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif METABOLOM •Metabolit •Produkt enzymové reakce •Vyskytuje se převážně uvnitř buňky (!) •Neakumuluje se •Má biologickou funkci (na enzymatické i transkripční úrovni) •Podobná struktura s prekurzorem •Nízká koncentrace a malá MW • Příklad: cholesterol (prekurzor)- kortisol (metabolit) steroidní hormon - řízení metabolismu živin Metabolom Soubor nízkomolekulárních produktů a meziproduktů genové exprese a enzymatické aktivity v daném čase 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif METABOLOM – proč? •Využití metabolomu? •Množství metabolitů obecně nižší než počet genů a proteinů v buňce (S. cerevisiae – 600 metabolitů MW <300 z 6000 genů) –Výjimkou sekundární metabolity – např. rostliny •Analýzy časově méně náročné –ve srovnání s analýzou velkých makromolekul •Změny v hladinách metabolitů –při nezměněné koncentraci enzymu –násobně vyšší než změny exprese nebo koncentrace proteinů –dány nejen úrovní exprese, ale i environmentálními vlivy, stádiem vývoje organizmu, biol. cykly, aj. http://biomarkers.cardiosource.org/~/media/BioMarkers/Images/sabatinefig2.ashx Fluxome 13C Genome Transcriptome Proteome Metabolome 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif METABOLOM – jak? Figure 5. http://cancerdiscovery.aacrjournals.org/content/2/10/881.figures-only?cited-by=yes&legid=candisc;2/ 10/881 Klesá počet analyzovaných molekul RT-PCR DNA Microarrays Gene Chips 2D-PAGE MALDI-MS 2D-LC-MS NMR GC, LC, CE-MS MALDI, DESI- MS MSI Roste chemická komplexnost analyzovaných sloučenin 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif METABOLOMIKA http://jdr.sagepub.com/content/90/5/561/F2.large.jpg Metabolomika: Kvantitativní i kvalitativní studium metabolitů <1000 Da (metabolomu) látkové přeměny živých systémů Využití: • Adaptace organizmu na prostředí • Odhad toxicity látek • Vývoj nových léčiv • Hledání biomarkerů metabolismu, onemocnění, průběhu terapie • Charakterizace a identifiace buněk (savčí, rostlinné, GMO) • Forenzní medicína 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif METABOLOMIKA - přístupy 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Výsledek obrázku pro urine Výsledek obrázku pro cells METABOLOMIKA - přístupy Metabolite target analysis: •kvantitativní i kvalitativní analýza substrátů nebo produktů metabolické dráhy, nízký LOD, náročná příprava vzorku Metabolic profiling: •semikvantitativní analýza více metabolitů s podobnými vlastnostmi (např. polární lipidy, isoprenoidy, sacharidy) Untarget metabolomic (Finger / Footprinting ): •komplexní analýza intra (finger-) a extracelulárních (foot-) metabolitů •bez nutnosti kvantifikovat a identifikovat, screening Metabonomics (definice není 100%ní!): •podoba s fingerprinting, cílem je sledovat odpověď po expozici např. toxickou látkou (farmakologie, toxikologie) •analýza “metabolitů vznikajících z toxické látky” Buňka, tkáň Frakce metabolitů Derivatizace MS NMR CE MS Metabolic profiling Biologické tekutiny NMR, FT-ICR Finger/Footprinting Derivatizace Čištěná frakce metabolitů MS MS ECD UV Metabolite target analysis Extrakt 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Untarget metabolomic •Srovnáváme až 1000 molekul •K většině nemáme standard •Kvantifikace - relativní změna mezi skupinami •Nutné znát hypotézu •Pečlivá a jednotná příprava vzorků a analýza •Neexistuje jednotná příprava všech skupin metabolitů (lipidomic, glycomic) •Rychlost (peníze) vs. rozlišení (citlivost)? •Nutné využívat statistiku (při designu i vyhodnocení experimentu) • •Target metabolomics •Srovnáváme až 100 molekul •Existence databází známých molekul (Metlin) •Existuje-li standard, možná kvantifikace •Vyšší citlivost analytických metod (identifikace nízkých koncentrací) • • • • • • METABOLOMIKA - přístupy Mulvihill , MM and Nomura DK. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism (2014) 307/3, E237-E244. DOI: 10.1152/ajpendo.00228.2014 https://masspec.scripps.edu/ 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif oInput data format oPeak finding oChromatogram alignment oData correction (missing values, empty rows..) oData processing oStatistics - heat maps o - PCA (principle component analyses) o - CA (cluster analyses) o - descriptive statistics oIdentification of metabolite (databases) • Data processing https://xcmsonline.scripps.edu/xcmsonline/xcmsonline_logo_06112015.jpg Výsledek obrázku pro scientific package for R 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif http://www.elmhurst.edu/%7Echm/vchembook/images/590metabolism.gif http://www.elmhurst.edu/~chm/vchembook/5900verviewmet.html Hlavní skupiny metabolitů ! Diskutován je heterotrofní metabolismus (ne sinice, rostliny a zvláštní typy bakterií ...) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif METABOLITY LIPIDŮ 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif METABOLITY LIPIDŮ •Databáze Lipid MAPS (3.5.2013) – 37 500 biologicky relevantních lipidů • •Fatty acids 5795 •Glycerolipids 7538 „fats“ •Sterol lipids 2678 „sterols“ •Prenol lipids 1200 •Sacccharolipids 1293 •Sphingolipids 4318 •Glycerophospholipids 8001 •Polyketides 6741 • Nepolární lipidy Polární lipidy http://hyperphysics.phy-astr.gsu.edu/hbase/biology/imgbio/celmem.gif http://www.lipidmaps.org/ Různorodá skupina sekundárních metabolitů 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif METABOLITY LIPIDŮ – dělení Funkce: •Zásobárna energie •Metabolické regulátory •Strukturní komponenty •Elektrické izolanty (nepolární lipidy) Složení: •Polární x nepolární •Jednoduché x složené x odvozené Mastné kyseliny: •Délka řetězce •Počet dvojných vazeb a jejich umístění •Stereoizomerie •Regioizomerie http://oilpalmblog.files.wordpress.com/2014/01/fatty-acids-2.jpg Lisa M. J. Chromatogr.A 1218 (2011) : 5146 http://www.nutriology.com/PL.gif 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif FOSFOLIPIDY •Součást membrán •Složení •Diacylglycerol-fosfát (může být esterifikován) •Mastné kyseliny –palmitová, oleová, arachidonová – •Nejvíce prostudované a biologicky významné • à metabolity kyseliny arachidonové (AA) • • • • http://www.phschool.com/science/biology_place/biocoach/images/bioprop/lipbilar.gif 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Diacylglycerol Adukty s DNA, proteiny •Cholesterol •Oxysterol Acetyl-CoA METABOLITY FOSFOLIPIDŮ •Oxidace fosfolipidů •nejčastější proces •ztráta funkčnosti membrán •enzymaticky i neenzymaticky •metabolity s fyziologickými účinky (eikosanoidy) •reaktivní metabolity http://hyperphysics.phy-astr.gsu.edu/hbase/biology/celmem.html http://www.phschool.com/science/biology_place/biocoach/bioprop/phospho.html http://www.scielo.br/img/revistas/jbpneu/v35n12/en_a11fig03.gif http://www.phschool.com/science/biology_place/biocoach/images/bioprop/lipbilar.gif 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif FOSFOLIPIDY – enzymatická oxidace •Eikosanoidy •20 C, deriváty AA • •Prostaglandiny PG • •Tromboxany TX • •Leukotrieny LT • •Lipoxiny • •Hydroxyeikosatetraenové kyseliny - HETE • • • • nsb.gif (11345 bytes) http://www.arthritis.co.za/nsaids2.htm http://www.wikiskripta.eu/images/thumb/0/09/Thromboxane_A2_acsv.svg/180px-Thromboxane_A2_acsv.svg.p ng http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/7/77/Leukotriene_B4.svg/440px-Leukotriene_B4.sv g.png http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/a/ae/Lipoxin_B4.svg/200px-Lipoxin_B4.svg.png http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/3/31/5-HETE.png http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/7/75/Prostaglandin_D2.PNG Významné biologické funkce • Zprostředkování zánětlivé odpovědi (COX 2-PG-horečka, bolest, zánět, aspirin-COX1-PG-sekret mucinu v žaludku-ibuprofen) • Regulace krevního tlaku, koagulace, horečky, bolesti • Buněčná signalizace • Řídí činnost ledvin • Inhibice lipolýzy a sekrece trávicích šťáv CYP 450 EETs, DiHETEs (neuroprotektant) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif FOSFOLIPIDY – neenzymatická oxidace • Isoeikosanoidy •Produkty neenzymatické oxidace AA • •Nejstudovanější – Isoprostany •Stabilní molekuly, vznikají po ataku ROS •Nejznámější 8-iso-PGF2α (synonyma iPF2α-III, iPF2α-IV, 15-F2t-IsoP) • •Známé účinky 8-iso-PGF2α •vasokonstrikce •inhibice shlukování krevních destiček •účast při zánětlivých procesech • •Využití •biomarker oxidativního stresu a pracovní expozice •biomarker neurodegenerativních a kardiovaskulárních onemocnění •řízení terapeutického zásahu • http://pvac.vscht.cz/ustav/sites/default/files/files/projects/biomarkery/ROS.png http://pvac.vscht.cz/ustav/vyzkumne-projekty/biomarkery-oxidacniho-stresu 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif FOSFOLIPIDY – neenzymatická oxidace •Konečné produkty oxidace AA malé reaktivní aldehydy • • •MDA – malondialdehyd (MW 72.07) • •HNE – 4-hydroxynonenal (MW 156.22) • •ONE – 4-oxononenal (MW 155.22) • •ACR – acrolein (MW 56.06) • • •koncové produkty oxidace i potravních lipidů •reaktivní malé molekuly – tvorba aduktů s DNA, s peptidy, s GSH („mercapturomika“) •biomarkery oxidativního stresu in vivo a vnější expozice •biologické a toxické účinky • • • http://pvac.vscht.cz/ustav/sites/default/files/files/projects/biomarkery/ROS.png http://pvac.vscht.cz/ustav/vyzkumne-projekty/biomarkery-oxidacniho-stresu 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif DALŠÍ METABOLITY LIPIDŮ •Cholesterol •Součást membrán živočichů, prekurzor steroidních hormonů a žlučových kyselin • •Oxysteroly (7b-hydroxycholesterol) • •produkt lipidní peroxidace cholesterolu, MW 402.7 •biomarker oxidativního stresu a různých onemocnění (diabetes, atherosclerosis, liver diseases, alzheimer) •vysoká koncentrace v plasmě •biologické účinky: apoptoza, agregace destiček, metabolismus sfingolipidů, cytotoxicita • •t-HODE (hydroxyoctadecadienoic acid) • •produkt oxidace kyseliny linoleové C:20, •biomarker antioxidační kapacity a oxidativního stresu in vivo • •HEL (hexanoyl-lysine adduct) •Adukt lipid hydroperoxidu s lysinem, produkt peroxidace LA nebo AA •biomarker lipidní peroxidace, detected in oxidatively modified LDL in human atherosclerotic lesions and in human urine • • • • http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/structure9/041/mfcd00058406.png/_jcr_content/ renditions/large.png https://www.caymanchem.com/images/catalog/38610.png http://1.bp.blogspot.com/-SO5hsovd6PE/UE9faUXmaeI/AAAAAAAAAG8/BNHQH_B18UE/s320/linoleic%2Bacid-7487 36.gif 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif METABOLITY PEPTIDŮ 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif METABOLITY PEPTIDŮ http://images.flatworldknowledge.com/zimmerman/zimmerman-fig06_x009.jpg 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif METABOLITY PEPTIDŮ (1) Aminokyseliny a jejich deriváty: Proteinogenní 1) funkce strukturní (proteiny) 2) další funkce - př. přenos vzruchu v CNS - glycin, kyselina asparagová, kyselina glutamová Neproteinogenní – specifické funkce více: DOI 10.1007/s11104-010-0673-y * b-alanin, N-methyl-d-asparagová kyselina NMDA (stimulátor mozkových receptorů), * GABA (přenos vzruchu) Metabolity aminokyselin: methylglycin (=sarkosin - antinádorové účinky); kreatin (derivát glycinu); acetylcholin (mediátor vzruchu), cholin, ethanolamin (derivát serinu); serotonin, melatonin (derivát tryptofanu, regulační funkce); histamin (derivát histidinu); hormony dřeně nadledvinek – př. adrenalin a štítné žlázy (deriváty tyrosinu); 3-nitrotyrosin, o-tyrosin, karboxymethyl nebo MDA adukt lysinu (biomarkery oxidativního stresu), močovina (konečný metabolit degradace aminokyselin) Epinephrine structure.svg adrenalin 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif METABOLITY PEPTIDŮ (2) •Konjugáty s peptidy: • • Glykosilace, Cysteinylace, Glutathionylace, Oxidační produkty (karboxymethyl), Ubiquitace, Adukty s reaktivními aldehydy • • •ANALÝZY peptidů – viz přednášky jinde (proteiny) • •Příklad - kvantifikace oxidovaných proteinů – –- homogenizace- –- 2Dgel elektroforéza –- immunoblotting nebo afinitní kolony- –- vyjmutí skvrn –- trypsin –- redukce/derivatizace/značení biotinem- – -protein indentifikace pomocí MS (fingerprinting) –- statistické zpracování dat – • http://www.kcl.ac.uk/departmentalimages/research/corefacilities/cems-dh/CemsDHIDworkflowPuff1.jpg 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif DALŠÍ METABOLITY (sacharidy, nukleotidy) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif http://patentimages.storage.googleapis.com/EP0656215A1/imgb0002.png METABOLITY SACHARIDŮ •Jednoduché sacharidy: •Příklad: Glukóza •Rozpustná ve vodě, zdroj energie, konstantní hladina v krvi •Stanovení: enzymaticky, spektrofotometricky, amperometricky • •Deriváty sacharidů: •Příklad: Kyselina glukuronová •Konjugační agens v detoxikačních reakcích • • •Konjugáty sacharidů - glykoproteiny a glykolipidy: •Stanovení obtížné (mnoho struktur s různými chemickými vlastnostmi, často větvené struktury, nízké koncentrace) •Příklad konjugujícího sacharidu: N-acetylglukosamin, glukóza, galaktóza, sialové kyseliny, chondroitin sulfát deriváty •Účinky: účastní se imunitních reakcí, buněčné diferenciace, markery nádorových onemocnění, přítomné v buněčné membráně, možná léčiva •Stanovení: LC/MS, immunohistochemie, ELISA, microarray, elektroforéza s kys. jodistou a Ag+ • • • • • http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/6/64/Glucose_Haworth.png/160px-Glucose_Haworth. png https://www.biotechnologie.de/BIO/Redaktion/Bilder/de/Foerderportraits/galab-glykoprotein,property= bild,bereich=bio,sprache=de.jpg 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif METABOLITY NUKLEOTIDŮ •nukleotidy: •Adeninové nukleotidy a koenzymy (ATP, ADP, AMP, NADPH, NADH) •Adukty bazí (8-oxodG, 8-OH-dA, dT-glycol, and 5-hydroxy-methyl-dU, adukty s MDA-M1dG) • • • • • •léčiva na bázi nukleotidů: •6-aza-uridin (cytostatika)-inhibice DNA syntézy •5-fluorouracil (antimetabolit, analog pyrimidinu) • http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/0/0c/DNA-adduct_M1G.png M1dG http://www.pearsonhighered.com/mathews/UV/URIDINE.GIF 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif DALŠÍ “malé molekuly” v ORGANIZMU 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif MALÉ MOLEKULY V ORGANIZMU http://pharmacometabolomics.duhs.duke.edu/files/pictures/illustration%20website%20front%20page%20no %20title.PNG •Přírodní látky malé oligoeptidy, biogenní aminy, alkaloidy, polyfenoly, barviva, glykosidy, terpenoidy, sinicové toxiny, mykotoxiny, antibiotika, vonné látky • •Další (ne v této přednášce) •Farmaka - antibiotika, analgetika, cytostatika •Nutrienty - vitaminy, cukry, mastné kyseliny •Environmentální látky - potravinová aditiva, pesticidy, cigaretový kouř Kromě endogenních metabolitů mohou i cizorodé malé molekuly modulovat procesy na všech úrovních (fyziologické, buněčné a molekulární). 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif PŘÍRODNÍ LÁTKY - příklady •Biogenní aminy •Dekarboxylace AA, • Efedrin, Histamin • •Alkaloidy •Heterocykly – Nikotin • Anatoxin A • • •Polyfenoly •Flavonoidy – antioxidanty, • pigmenty, UV ochrana, fytoestrogeny • • •Oligopeptidy •Cyanobakteriální toxiny (microcystin) • • Nicotin http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/5/52/Anatoxin-a.svg/620px-Anatoxin-a.svg.png Anatoxin A Microcystin Efedrin https://encrypted-tbn2.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcTJE3-JVFjkaxehYW1WUcMqPTR3KbL-wyINK_IDvIpgYy7 hXY0_ Mass spectrometry in plant metabolomics strategies: from analytical platforms to data acquisition and processing - Natural Product Reports (RSC Publishing) | Natural Products Chemistry Breaking News | Scoop.it Flavonová struktura 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Cyanobakteriální toxiny (domoic acid, BMAA) •Rostlinný původ (L-DOPA, BOAA) neurotoxické à kompetice s mediatory vzruchu inkorporace do proteinů à nefunkční proteiny (patologie) • • • Vitamíny •vit E (tokoferoly-lipid) •vit C (kys. askorbová-sacharid) • • http://botanika.wendys.cz/kytky/prew.php?../foto/O388.jpg BMAA BOAA https://encrypted-tbn3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcRYAP6CwLbmvpbVeQV8dzjjky4KfKbyWSZVc-H_5NEePDN l1-U0kw Neproteinogenní aminokyseliny Vit C PŘÍRODNÍ LÁTKY - příklady 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif https://encrypted-tbn1.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcQjWGs0G9ySK19Q_aSv2K_Uw2sPBb8aD9JT3AtfMcIK37w XpZQC METODY STUDIA METABOLOMU 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Stanovení metabolitů 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Metabolit x Matrice (vzorek) •Matrice: • krev (rozpuštěné proteiny, lipidy, soli, sacharidy, suspendované buňky) • plasma (centrifugací oddělené jen buňky (heparin, EDTA) • sérum (oddělené buňky a srážecí proteiny, cca 5%) • moč (soli, močovina, metabolity ve volné formě) • mléko (lipidy, proteiny, sacharidy) • tkáně (buňky, proteiny, lipidy, sacharidy) • dechový kondenzát (voda, částice) • sliny (99% voda, dále enzymy, soli, glykoproteiny) • •Analyt: • nízkomolekulární látka • nízká a variabilní koncentrace v přítomnosti komplexní matrice • volná forma nebo vázané na proteiny (glucuronid, sulfát) • velká fyzikálně chemická variabilita • • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif PŘÍPRAVA VZORKU 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif EXTRAKCE Zastavení buněčného metabolismu (t=s) Vzorkovací technika (tkáň, extracelulární médium) Uvolnění analytu (homogenizace, rozbití, odstranění buněk) Přečištění, zakoncentrování (SPE, LLE) Derivatizace Odstranění makromolekul, homogenizačního roztoku Výměna rozpouštědel Separace (LC, CE, GC) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Homogenizace http://depts.washington.edu/oldenlab/wordpress/wp-content/uploads/2013/03/BioticHomogenization.gif https://encrypted-tbn0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcT0pVG3pRna18atbBQElctqTw_ko62zi3cy3S_DcZSy-3i J-xNk http://img.youtube.com/vi/olwyI7_EFNE/hqdefault.jpg Musilová J. Chem. Listy 105, 745-751 (2011) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Odstranění matrice •Odstranění makromolekul •Klíčové je odstranění zejména peptidů/proteinů a lipidů •Proteiny –Srážení –Hydrolýza (6N HCl, teplota, enzymaticky, mikrovlnná extrakce) –Ultrafiltrace –Centrifugace •Lipidy –Gelová permeační chromatografie –Extrakce (LLE) –Vymražení • •Odstranění homogenizačního roztoku •Lyofilizace •Sušárna 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Přečištění - Zakoncentrování •LLE - extrakce kapalina-kapalina •extrakce širokého množství látek, jednoduchá •časová náročnost, variabilní výtěžnost, spotřeba materiálu, vznik odpadů • •SFE - superkritická fluidní extrakce • CO2 v nadkritickém stavu, kapalina s vlastnostmi plynu (viskozita, difuze), recyklace • •(Elektro)dialýza - koncentrační rozdíl nebo rozdíl el. potenciálu na polopropustné membráně • •Reverzní osmoza, ultrafiltrace - využití hydrostatického tlaku • •TLC – tenkovrstvá kapalinová chromatografie – využití separace tříd lipidů před MALDI-MS • http://www.siumed.edu/%7Ebbartholomew/images/chapter6/F06-11.jpg https://encrypted-tbn2.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcQe_n-4F6X4i4O9SM-E76S3qWQMBog-9Y7-w4y29k5dVIV gDe5g82p6rA Phase diagram http://www.agua.cz/fotocache/gallery/Reverseosmosis.jpg 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Přečištění – Zakoncentrování: SPE •SPE - extrakce na tuhé fázi – často užívaná metoda (!) • selektivita, automatizace, reprodukovatelnost, časová nenáročnost, malá spotřeba rozpouštědel, miniaturizace, odsolení, výměna rozpouštědel, zakoncentrování, možnost frakcionace •různá kvalita sorbentu, ztráty analytu sorbcí nebo předčasnou elucí při promytí, horší reprodukovatelnost mezi laboratořemi, kolonky na jedno použití • • • • Kondicionace Aplikace vzorku Promytí, úprava pH Sušení Eluce Oplach rozpouštědlem, odstranění nečistot z výroby, příprava na solvataci (př. methanol/voda) Rychlost „crocodille“ Nemusí se vždy využít, odstraní matrici Odstranění nečistot bez ztráty analytu (voda); možné vysoušet inertním N2 Eluce rozpouštědlem – přerušení vazby analytu a sorbentu (methanol) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Přečištění - Zakoncentrování: SPE https://encrypted-tbn0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcSDdFWkHdVZctxGVIFWKJ93TxH1aF4tHPgwH4uqRpwvIpF HYZfGuw •SPE výběr kolony (objem vzorku, vlastnosti matrice a analytu) • •Nepolární interakce: •Reverzní fáze, na pevné fázi navázány uhlovodíkové řetězce (C18, Ph, CN) •Analyty - protonované nebo neutrální molekuly, aromáty, alifatické řetězce •Eluce - nepolární až středně polární rozpouštědla • •Polární interakce: •Normální fáze, pevná fáze (silikagel) s modifikacemi •Analyty - aminy, alkoholy, fenoly, karboxylové kyseliny, aromatické uhlovodíky, heterosloučeniny •Eluce - středně polární až polární rozpouštědla • •Iontově výměnné interakce: •Nabitý povrch částice (alkylsulfonáty, tetraalkylamoniová sůl) •Analyty-organické kyseliny, mastné kyseliny •Eluce – změna pH • •Afinitní interakce: •Imobilizovaný ligand (protilátky) reagující s analytem •Analyty – léčiva, potravinářství • •Mix interakcí: •Reverzní fáze se silnými/slabými kationtově/aniontově výměnnými skupinami • • • • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Extrakce https://qeryz-seohacker.netdna-ssl.com/blog/wp-content/uploads/2015/03/Best-Questions-for-Surveys.j pg 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Extrakce –vliv postupu na analýzu - příklad •Amitriptyline (antidepresivum, pKa 9.4, solubility 9.7 mg/L) v plasmě • http://www.pharmacy-and-drugs.com/reviews/Amitriptyline.jpg https://encrypted-tbn3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcSWF70Wgq8lUzd5DHROQ2k0Npzr6slzZzQLFfhimXY-smf w-6EO http://healthcare.utah.edu/healthfeed/images/factoids/0914_W4_F_depression.jpg 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Extrakce –vliv extrakčního postupu na analýzu - příklad •Amitriptyline (antidepresivum, pKa 9.4, solubility 9.7 mg/L) v plasmě • http://www.chromatographyonline.com/lcgc/data/articlestandard/lcgc/452008/564645/i5.gif http://www.chromatographyonline.com/lcgc/article/articleDetail.jsp?id=564645&pageID=2 http://www.pharmacy-and-drugs.com/reviews/Amitriptyline.jpg https://encrypted-tbn3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcSWF70Wgq8lUzd5DHROQ2k0Npzr6slzZzQLFfhimXY-smf w-6EO srážení kyselinou nepolární interakce mix interakcí 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Derivatizace •nezbytná pro GC •stabilizuje molekuly •vnáší chromo/elektrofory do molekuly analytu •mění polární látky na více lipofilní •zvyšuje sensitivitu signálu v MS http://www.restek.com/images/articles/figure_forensics_005-1.gif 1. androsterone 2. dehydroepiandrosterone (DHEA) 3. 17-α-estradiol 4. estrone 5. 17-β-estradiol 6. testosterone 7. derivatization by-product Příklad: Analysis of Steroid Hormones in urine by GC/MS - derivatizace „Silylation“ Více : Hanbook of sample preparation (2010) ISBN 978-0-470-09934-6 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif SEPARACE A ANALÝZA 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Separace •Chromatografie - dělení látek ze směsi mezi stacionární a mobilní fázi oddělí i isomery (různá struktura), isobary (různé molekuly) • • • • • •Elektroforéza - dělení na základě pohyblivosti nabitého analytu nebo micel v elektrickém poli (CZE, MEKC) vhodné pro látky s nábojem např. pro organické kys., nukleotidy, • měření obsahu látek v malém objemu • • https://encrypted-tbn2.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcSk8I2zivENy026L-ne5R8jzHDG9Cfw4S00TolXqCtv3-y 2epuu https://encrypted-tbn3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcQPwpUofXpjfgKkqcXuPpfCC4I3fZdv1fkUAJPXfprarg3 8oIMU Uspořádání HPLC Uspořádání GC http://plantbreeding.boku.ac.at/957308/qu_hplc.gif 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Separace •Mobilní fáze • • •Stacionární fáze • • • •tR retenční čas látky zdržující se v systému •tM retenční čas látky, která se pohybuje spolu s MF •FM objem mobilní fáze za čas •VM mrtvý objem (FM*tM) • • • • •Náboj – ionex •Hydrofobicita – reverzní fáze, normální fáze, HILIC •Biospecifická afinita – afinitní kolona •Velikost a tvar molekuly – gelová kolona (sephadex, sepharoza) •plyn •kapalina •gradient vs. isokratika 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif LC - separace •Princip kapalinové chromatografie: http://chemwiki.ucdavis.edu/@api/deki/files/12382/Figure12.06.jpg http://chemwiki.ucdavis.edu/@api/deki/files/12383/Figure12.07.jpg http://chemwiki.ucdavis.edu http://chemwiki.ucdavis.edu/@api/deki/files/12385/Figure12.09.jpg 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif LC - separace •Stacionární fáze •- podobné principy s SPE •- materiál více homogenní, malé částice •- opakované použití (vs. SPE – single use only) Ionex kationt-aniont exchange; eluce zvýšení iontové síly, změna pH Reverzní fáze hydrofobní povrch; eluce zvýšením hydrofobicity, nejvyužívanější stacionární fáze http://www.shodex.net/img/lesson_05_01b.gif http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/migrationresource4/g003571.gif 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif LC - separace Afinitní kolona Specifický povrch; biochemické interakce, eluce nízkým pH, vyšší koncentrace soli, často v sérii s další kolonou Gelová kolona Náplň tvoří silikagel nebo polymery, velké molekuly obtečou, malé se zdrží difúzí v pórech. http://www.ivtnetwork.com/sites/default/files/imagecache/gallery_full/Binding-of-Target-Molecule-to -Affinity-Chromatography-Resin.jpg HILIC, NP kolona Hydrofilní polymery nebo silikagel s různými polymery, eluce zvýšeným podílem vody (př. dělení aminokyselin, sacharidů) http://www.sepscience.com/images/Articles/HILIC/3/Fig1.jpg 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif LC - separace Využití více kolon Například 2D - LC uspořádání nejprve iontově výměnné a pak reverzní fáze (využití např. v proteomice) Chirální kolona Separuje enantiomery, využití například ve farmakologii http://www.daicel.com/en/ir/lab/img/0906_img02.gif http://www.chem.agilent.com/promotions/PromotionImages/06272012_ibt_2dlc-proof.gif 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif GC – separace •MF: inertní plyn, N2, Ar, He, CO2, isokratika (konst. teplota plynu), gradient (teplotní gradient) • •SF: kolonky (Al, Cu, Ni, sklo), 1-5 m s adsorbenty (silikagel, alumina, active carbon) • •Analyt: těkavá a teplotně stabilní látka, často nutná derivatizace, nízký limit detekce • •Ve spojení s MS v posledních letech velmi využívaná v metabolomice à knihovny hmotnostních spekter (u LC – různá spektra za různých podmínek: tvorba knihoven omezená) • • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Analyzátory - Detektory •fotometrický detektor –absorpce fotonů chromoforem (metabolity s dvojitými vazbami, aromatické sloučeniny, některé heteroatomy) •fluorescenční detektor –emise fotonů z „excitovaných molekul“ (PAH a jejich deriváty, nebo metabolity po konjugaci – vnesení fluoroforu) •elektrochemický detektor –změna elektrické veličiny po elektrochemické reakci látky v cele detektoru s elektrodami (látky lehce oxidovatelné, redukovatelné, fenoly, aromatické aminy, peroxidy, merkaptany, ketony, aldehydy, konjugované nitrily, aromatické halogenované sloučeniny) • • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Analyzátory – Detektory – Hmotnostní detekce • • Nejvyužívanější - targeted metabolomics: LC-MS, direct injection analysis-MS - untargeted metabolomics: vysokorozlišovací MS (Orbitrap, QTOF) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Principy MS analyzátorů - separace iontů dle jejich doby letu, zakřivení dráhy letu, oscilací, frekvencí cyklického pohybu a to v elektrických, elektromagnetických a nebo magnetických polích à konečná detekce – řada principů (měření hodnoty iontového proudu, detekce emitovaných částic-scintilace, elektronové násobiče, fotonásobiče), softwarové zpracování à vyhodnocení záznam (pík) J Vznik iontů (zdroje iontů) PI fotoionizace EI elektronová ionizace - malé nepolarní molekuly, spojení s GC ESI elektrosprej – spojení s CE, LC DESI desorpce elektrosprejem – bez separace APCI chemická ionizace APPI fotoionizace UV zářením -hydrofobní látky – steroidy MALDI desorpce a ionizace laserem za nebo bez účasti matrice Analyzátory TOF napětí urychluje ionty, m/z malé, t krátký, vhodné pro analýzy směsí, ve spojení s MALDI identifikace proteinů, vysokorozlišovací detekce OrbiTrap ionty oscilují v elektrostatickém poli a vytváří zaznamenatelný proud úměrný jejich m/z, vysokorozlišovací Kvadrupoly změna radiofrekvenčního pole na elektrodách vytváří filtr pro dané m/z, ty se dělí v prostoru, omezený hmotnostní rozsah Lineární a sférické iontové pasti podoba s kvadrupoly, ionty zakoncentrovány a izolovány ne v prostoru, ale v čase Analyzátory – Detektory – Hmotnostní detekce 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Analyzátory – další detektory •NMR - Nukleární magnetická resonance •Zlatý standard 1H-NMR • sleduje odezvy jader s nenulovým magnetickým momentem v silném magnetickém poli a jejich interakci s vysokofrekvenčním elektromagnetickým vlněním • • nedestruktivní technika • minimální příprava vzorku před analýzou• snadná identifikace neznámých sloučenin • možnost měření in vivo • kvantifikovatelná • nevyžaduje derivatizaci • • vyšší požadavky na množství vzorku • nízká citlivost • • • • • • • • • • • • • • http://chemwiki.ucdavis.edu/@api/deki/files/8081/spctrmtr.gif?size=bestfit&width=537&height=315&rev ision=1 Slide 40 FTICR – Iontová cyklotronová rezonance s Fourierovou transformací ionty v cele v silném magnetickém poli se pohybují v cyklech s frekvencí úměrnou jejich m/z, záznam frekvence se převádí FR na hmotnostní spektrum ultracitlivá MS • spektra s nejvyšším rozlišením a přesností • identifikace tisícovek metabolitů bez předchozí separace nárok na prostor a vakuum • vysoká cena 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •MSI – hmotnostně spektrometrické zobrazování •(farmacie, medicína, hledání biomarkerů, objasnění biochemických pochodů) • Zobrazovací techniky detekce Info o molekulách (Optická mikroskopie) (procházející “viditelné” záření) (barvení: chemické reakce např. s proteiny..) Elektronová mikroskopie elektronů Jen prvková analýza Rentgenová spektroskopie rentgen. záření Jen prvková analýza Autoradiografie fotonů (IR) Funkční skupiny Pozitronová emisní tomografie g-záření Značené molekuly Fluorescenční mikroskopie fotonů (UV, VIS) Značené molekuly Hmotnostní spektrometrie (MALDI, DESI-MSI) (an)organické ionty Ano Fujimura, Y., Miura, D. Metabolites 2014, 4(2), 319-346 Analyzátory zobrazovací techniky 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Fujimura, Y., Miura, D. Metabolites 2014, 4(2), 319-346 MSI Př. Analýza metabolitů lipidů v mozku - MALDI-MSI 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Imunoanalýza (immunoassays) • • Reakce antigenu s protilátkou, kdy enzymově značené (ALP, HRP) nebo radioaktivně značené (125 I) antigeny nebo protilátky se měří pomocí fluorescence/absorbance/chemiluminiscence po reakci dodaného substrátu s enzymem (nebo v případě radioaktivního značení měřením scintilace) . •Analyt: •steroidy, hormony, (glyko)lipidy, peptidy, sekundární metabolity •Protilátky polyklonální: •po imunizaci zvířete, protilátky proti různým epitopům, silná afinita •Protilátky monoklonální: • produkce buněčnými liniemi, proti jednomu epitopu, možná krosreaktivita • •Kompetitivní EIA, RIA •(enzyme) radioimmunoassay • • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif http://www.socmucimm.org/wp-content/uploads/2014/06/The-ELISA-Method.jpg •ELISA •Enzyme-linked immunosorbent assay Imunoanalýza (immunoassays) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Praktické poznámky, validace •Výběr vhodného blanku: • Kontrolní vzorek: čistá voda nebo arteficiální „tkáň (arteficiální moč, voda z „čisté“ lokality), rozpouštědlo (vyloučení kontaminace během procesu), instrumentální blank (chování vzorku během analýzy, opakované měření mezi vzorky) • •Výběr vhodné metody extrakce a analýzy: • Selektivita: schopnost nalézt a kvantifikovat analyt v matrici • Accuracy a Precision: měření známé koncentrace analytu v replikátu • Spike recovery: zjištění změny známé koncentrace analytu (surrogate standard) způsobené procesem extrakce, analýzy • •Kvantifikace: • Vhodná detekce (MS, DAD, ECD) • Kalibrace: interní, externí standard v čisté matrici nebo rozpouštědle • Snížení vlivu matrice: nízký nástřik, přítomný interní standard, standardní přídavek analytu • • • • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklady stanovení metabolitů (oligopeptidy a lipidy) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Analýza metabolitů – thioly (příklad) •Stanovení: thioly •Stanovení GSH/GSSG (cytosol) a CyS/CySS (plasma), GSH: antioxidant, kofaktor peroxidáz, reverzibilní oxidace na GSSG, konjugační agens pro xenobiotika i endogenní látky (chrání peptid před oxidací vratným navázáním na cystein), správný poměr GSH/GSSG důležitý pro homeostázu • •Homogenizace-redukce S=S z peptidu (DTT)-srážení proteinů kyselinou-konjugace-SH skupiny (NEM, DTNB, DansylCl, IAA)- chromatografie-MS, spektrofotometrie, fluorometrie, elektrochemická detekce •ELISA • •Příklad stanovení volného GSH a GSSG ve tkáni • • • • • • • • • • • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Modelový příklad •Vliv nanončástic Cd po respirační expozici u myší –Expozice 13 týdnů –5 myší: Kontroly (K), dvě „dávky” Cd (D1, D2) –Vyhodnocení fyziologických a toxikologických parametrů •Př.: peroxidace lipidů, změny enzymové aktivity, GSH / GSSG • http://www.intechopen.com/source/html/40655/media/image2.png Bláhová (2014) Anal Bioanal Chem 406:5867–5876 Výsledek obrázku pro mys http://www.ijp-online.com/articles/2011/43/1/images/Indian%20J%20Pharmacol_2011_43_1_45_75669_f7.jp g Bharavi K et al. Indian J Pharmacol 2011;43:45-9 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Modelový příklad – výzkumná studie •Ukončení experimentu: na co dát pozor? • •VZORKOVÁNÍ –Organizace odběrů •3 skupiny, zpracovávat “současně” nebo „náhodně“ (ne nejprve “K”, pak D1…) –Výběr tkání pro analýzu •Respirační cesta à primárně plíce; pak orgány citlivé k Cd (ledviny, prostata, játra, kosti) –Rychlost zpracování •Velká rychlost nutná ! Malé molekuly - rychlý turnover –Celý orgán ihned do tekutého dusíku –Udržování a transport •Stále v mraženém stavu – 80°C • Bláhová (2014) Anal Bioanal Chem 406:5867–5876 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Modelový příklad – výzkumná studie •Zpracování vzorku: na co dát pozor? • •HOMOGENIZACE –Odběr části (reprezentativní alikvot) •zmrzlá tkáň •vážení orgánu –Přidání homogenizačního roztoku •kontrola pH, iontové síly – vodný pufr (GSH-GSSG dobře rozpustné ve vodě) •práce v ledu(!) –Homogenizace •vysokorychlostní třepání (s) •stálé chlazení • Bláhová (2014) Anal Bioanal Chem 406:5867–5876 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Další úpravy vzorku: na co dát pozor? • • •EXTRAKČNÍ KROKY –Vhodné pH •Zajištěno alkalickým pufrem (použit již pro extrakci) • –Reakce – co nejméně kroků, přesné pipetování •Přidání INTERNÍ STANDARD (izotopicky značený GSH) •Přidání konjugačního činidla: blokování reaktivních –SH skupin (DTNB) •Konjugace (T-lab, pH) • –Vysrážení proteinů •Přidání kys. Sulfosalycilové (pH) •Srážení (chlazení) •Centrifugace (chlazení) • –Ředění vzorku •Snížení “vysoké” koncentrace GSH a zachování detekovatelnosti „nízké“ koncentrace GSSG •Menší vliv matrice •Analyt rozpuštěn v MF, lepší dělení při chromatografii • –Uchování k analýze -80°C Modelový příklad – výzkumná studie Bláhová (2014) Anal Bioanal Chem 406:5867–5876 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Modelový příklad – výzkumná studie •Analýza: na co dát pozor? • –Typ separace – LC, GC, bez separace –Výběr kolony •Modifikovaná C18 (analyty jsou polárnější) –Detekce •elektrochemická (redoxní reakce na -SH) •ELISA •UV-VIS (detekce barevného konjugátu GSH-DTNB , ne! GSSG) •hmotnostní detekce (GSH-DTNB (konjugovaný GSH), 13C-15N-GSH-DTNB (konjugovaný interní standard), GSSG –Vyhodnocení (kalibrace s int. standardem) –Koncentrace GSH/mg proteinů, mg tkáně; GSH/GSSG • Bláhová (2014) Anal Bioanal Chem 406:5867–5876 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Modelový příklad – výzkumná studie •Vyhodnocení • Fig. 6 Content of GSH (a), content of GSSG (b), and GSH/ GSSG ratio (c) in lung of mice after chronic exposure (13 weeks) to CdO nanoparticles at dose 1 (D1) and dose 2 (D2). Numbers with asterisk (*) in the graph indicate significant differences compared to the control variant within the respective week (p<0.05; N=5 animals) Bláhová (2014) Anal Bioanal Chem 406:5867–5876 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Analýza metabolitů – lipidy http://www.lipidall.com/img/Lipidomics.png 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Analýza metabolitů – lipidy Extrakt, tkáň Bioinformatika (korekce dat, analýza dat-PCA, visualizace, interpretace) Extrakce: různá pro různě polární lipidy, aditiva podporující rozpustnost, nutné antioxidanty, práce ve skle, inertní atmosféra N2, -80°C, využití interních standardů Analýza: „Shotgun“ MS (bez separace), UHPLC MS, SFC MS Detail – viz další snímek 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Student(ka) by měl(a) znát –Co je to metabolomika, principy stanovení metabolomu –Co jsou to metabolity? Jaké existují typy a skupiny? Významné metabolity lipidů, AA, NA –Jaké jsou klíčové kroky v jejich analýze? Principy metod extrakce, separace a detekce –U vybrané látky navrhnout a diskutovat přístup k analýze z biologického vzorku Shrnutí https://encrypted-tbn1.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcScSEFiEpBvu_G1IUcIi9ZLImJLnwBDfsTIfI8E5rmaJzz HC8O4 https://encrypted-tbn1.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcScSEFiEpBvu_G1IUcIi9ZLImJLnwBDfsTIfI8E5rmaJzz HC8O4