NEURÁLNÍ A BUNĚČNÉ PROCESY SMYSLOVÉ TRANSDUKCE – JAK SMYSLOVÉ PODNĚTY VSTUPUJÍ DO NERVOVÉHO SYSTÉMU. A CO UŽITEČNÉHO Z TOHO PLYNE? • to, co se děje na membránách smyslových buněk a jak mohou smyslové podněty zasáhnout do metabolismu buněk. • Paralely se známými signálními drahami diferenciace, imunity, apoptózy… • Společně využívané „vyzkoušené“ funkce a vztah mezi studiem chování, smyslů a buněčné komunikace Upozornění na: Schopnost organizmů rozpoznávat i nepatrné změny vnějšího prostředí a reagovat na ně v případě ohrožení je jednou z nejdůležitějších podmínek zachování života. Selekční tlak byl natolik silný, že schopnosti receptorů jsou často na samé hranici fyzikálních možností. Jednotlivé fotony, jednotlivé molekuly, pohyby nanometrových amplitud, nesmírně slabé elektromagnetické pole fascinují fyziology. Výzkum molekulární podstaty transdukčních mechanismů chemických signálů, mechanických podnětů, ale i např. infračervené detekce, elektrických polí nebo magnetického pole jsou výzvami fyziologii s velkým potenciálem. Všech 5 pohromadě Vstup do NS, potřeba rychlé motorická reakce, kontakt s vědomím. Kontakt se světem Předpoklad: některé buňky dokážou reagovat na různé formy energie (chemické, mechanické, elektromagnetické). Metabolická reakce se pak zobrazí jako změna elektrického membránového napětí. Motorický NS Vegetativní NS Hormonální S Kůra telencefala Vnější podněty: zvuky, vůně… Vnitřní podněty: hladina Glc, apoptotický signál, růstový f. … VĚDOMÍ PODVĚDOMÍ Reflexní, automatické řízení Buněčná recepce a komunikace Hranice smyslového a ne-smyslového signálu Buněčné „oči“ a „uši“ Motorický NS Vegetativní NS Hormonální S Kůra telencefala Vnější podněty: zvuky, vůně… Vnitřní podněty: hladina Glc, apoptotický signál, tah v membráně… VĚDOMÍ PODVĚDOMÍ Reflexní, automatické řízení Buněčná recepce a komunikace Motorický NS Vegetativní NS Hormonální S Kůra telencefala Vnější podněty: zvuky, vůně… Vnitřní podněty: hladina Glc, apoptotický signál, tah v membráně… VĚDOMÍ PODVĚDOMÍ Reflexní, automatické řízení Buněčná recepce a komunikace Klasické smysly propojené s kůrou, mechanismy ale stejné  Nervový systém vsadil na elektricky předávané informace.  Kanály jsou odpovědné za regulaci membránového napětí a tedy klíčové pro vznik a přenášení nervových signálů.  Nervový systém tedy „vidí“ jen to, co změní kanálovou propustnost.  Pro vstup do NS podstatné to, co se děje mezi receptory a kanály Kanály v molekulární fyziologii smyslů Ionotropní transdukce – receptor přímo na kanálu Klíčová otázka: co se děje mezi receptory a kanály Metabotropní Transdukce – receptor a kanál jsou odděleny Ionotrponí a Metabotropní transdukce Kanály – prostředek pasivního transportu udržování integrity buňky a komunikace Už jste se mimo NS potkali s kanály? Do řetězců buněčné komunikace patří. Vodní hospodářství je otázkou řízené propustnosti membrán. Osmolalita a pH Už jste se mimo NS potkali s kanály? Už jste se mimo NS potkali s kanály? Všude, kde je jako druhý nebo třetí posel IP3 a Ca signál Už jste se mimo NS potkali s kanály? Už jste se mimo NS potkali s kanály? Už jste se mimo NS potkali s kanály? Už jste se potkali s kanály? Buněčná migrace Increasing evidence suggests that ion channels and pumps are involved in the regulation of cell proliferation and migration, and channel proteins have been shown to form macromolecular complexes with cell adhesion molecules and other signaling proteins. …it is being increasingly suggested that regulation of ion channels and pumps could contribute to cancer progression. Frontiers in Cellular Neuroscience | www.frontiersin.org 1 March 2015 | Volume 9 | Article 86 Plasma membrane depolarization can trigger cell proliferation. By responding to voltageinduced changes in phosphatidylserine spatiotemporal dynamics, K-Ras nanoclusters set up the plasma membrane as a biological field-effect transistor, allowing membrane potential to control the gain in mitogenic signaling circuits. SCIENCE sciencemag.org 21 AUGUST 2015 • VOL 349 ISSUE 6250 Kanály tedy řídí pasivní transport látek i předávají signály: Spolupracují na udržení osmolality, pH a membránového potenciálu. Podílí se na signalizaci i mimo NS: celá Ca signalizace, svalový stah, buněčné signály nekrózy, apoptózy, hemostázy (destičky) atd. Podílí se na řízení proliferace, migrace buněk, buněčné morfologie, karcinogeneze, angiogeneze, vazomotoriky, Poruchy kanálů – např. srdce, cystická fibróza, vznik malformovaných metastazujících buněk. Možná otázka Jak se kanály zkoumají? Terčíkový zámek (Patch clamp) – vidíme, jak kanál pracuje Jak se kanály zkoumají? analýza sekvence AK – Prostorová rekonstrukce ze složení řetězce. X ray krystalografie - vzhled Jak se kanály zkoumají? Možná otázka FOTORECEPCE - ZRAK Rhodopsin Od 70. let obecné schéma G-proteinové signalizace Nejprozkoumanější kaskáda Prostetická skupina – chromofor nezbytná pro absorpci vyšších délek Chromofor ve funkci ligandu, světlo iniciuje Drosophila jako užitečný model zrakové (a i jiné) transdukce: Mimořádné zesílení – reakce na jediný foton Nízký šum ve tmě (spontánní termální izomerizace) Široká adaptace – rozsah až 106 (arestin, Ca) Rychlá terminace odpovědi Nejrychlejší známá G signální dráha – 10x než obratlovci (10Hz u člověka) fosfolipáza Drosophila jako užitečný model zrakové transdukce: Taková rychlost? PLC octomilky je jeden z nejvýkonnějších známých enzymůlimitem je jen přísun cGMP Výkonnost transdukce omezena pouze difuzním pohybem v membráně. Drosophila jako užitečný model zrakové transdukce: Difuzní model signálového přenosu x Signalplex, scaffolding proteins Multimolekulární signalizační komplex zvyšuje rychlost a specifitu „rozhovorů“ TRP kanál (transient receptor potential) popsán u D.m. – viz dále Organizace proteinů signalplexu v čase a prostoru – oddělení, zhášení v odpověď na světlo Drosophila jako užitečný model zrakové transdukce: How does a light stimulus lead to the opening of TRP channels? Surprising link between light-activated changes in membrane tension and the opening of TRP channels 12 OCTOBER 2012 VOL 338 SCIENCE Drosophila jako užitečný model zrakové transdukce: Drosophila jako užitečný model zrakové transdukce: Taková adaptace? Translokace TRP signalplexu – mechanismus adaptace na tmu a světlo Čím přispěl výzkum fotorecepce Drosophily do poznání buněčné signalizace? Co je to signálový komplex (transducizóm nebo také signalplex) a jaký má význam? Možná otázka Chemorecepce - čich Všechny buňky umí čichat ! Nejstarší smysl Konzervativní organizace Podobnost s rhodopsinem Jeden neuron – jeden receptor Rozeznává tisíce látek 1000 genů – 3% genomu! 350 funkčních receptorů Hypervariabilní oblast Kombinace 3.000-100.000 vůní (?) Ale: 21 MARCH 2014 VOL 343 SCIENCE 1012 – trilion vůní G-prot. signální dráha G-prot. signální dráha 2004 Nobelova cena 50% léků působí přes G-proteinové signální dráhy Jeden neuron – jeden receptor – jedna základní vůně CHEMORECEPCE - CHUŤ G-prot. signální dráha vlastně gustducinová Přímý vliv Všimněme si: TRP Na kanál (viz dále) ATP jako mediátor Matters of taste Kde ještě jsou mimo ústní dutinu v těle člověka využity principy chuťové detekce? Popište signální dráhy a význam. Možná otázka CHUŤ NA TUČNÉ • CD36 – receptor na lipidy (?), scavenger receptor, v metabolismu lipidů, zánětu, hemostáze, ateroskleróze, řízení tlaku, při malárii sekvestrace Ery http://www.scientificamerican.com/article.cfm?id=potential-taste-receptor MECHANORECEPCE – HMAT, SLUCH Mechanorecepce může přímo řídit expresi bez zprostředkování kanálem Např. růst svalů Moyes … nebo uvolňování chemických signálů řídících srdeční činnost. Mechanické napětí přenášeno na cytoskelet a přímo mění enzymatickou aktivitu vázaného signálního komplexu. Tkáňově specifická diferenciace: exprese pod mechanickým řízením. Cellular mechanosensation Cells can both sense and dictate the physical properties of their microenvironment while preserving the structural continuity within the surrounding tissue. Consequently, tissues acquire stiffness optima as an emergent property of the physical and biochemical interactions between their constituent cells. This tensional equilibrium confers macroscopic compliance properties that are critical for processes such as stem cell differentiation, embryonic development, and tissue homeostasis. DOI: 10.1126/science.1243643 Science 341, 965 (2013) Sluch, hmat, rovnováha, osmorecepce, hygrorecepce Zrychlení Magnetorecepce? Dlouho neznámý mol. mechanismus Modelový organismus háďátko Modelový organismus octomilka Mutanti byli necitliví na dotyk. Podobně i mutanti drosophil. Larvy, které nebyly citlivé na dotek, byly v dospělosti hluchými mouchami s nekoordinovanými pohyby. Princip je zřejmě dosti konzervovaný a obecný pro různé aplikace mechanorecepce. Mutace se týkaly kotev na jedné nebo druhé straně membrány nebo kanálu samotného. Kanál opět patří do rodiny TRP. Háďátko essay Savčí mechanorecepce sluchu Mechanosensitivita TRP Háďátko se nevyhýbalo doteku, ani škodlivým látkám Drosophila hluchá a špatně chodící 3 možné mechanismy: a) Tenze membrány b) Tenze kotvy cytoskeletu c) Změna aktivity enzymu Možná otázka Jaký je molekulární mechanismus mechanorecepce? Kde se molekulární mechanismy mechanorecepce uplatňují mimo klasické smysly? NOCICEPCE – VNÍMÁNÍ BOLESTI V případě zraku nebo čichu potřebují primární neurony jediný druh stimulu. Nocicepce je jiná v tom, že primární neurony dráhy bolesti mají schopnost detekovat širokou škálu modalit včetně chemické a fyzikální povahy. Musí být tedy vybavena rozmanitým repertoárem transdukčních zařízení. Na rozdíl od zraku chuti nebo čichu nejsou nervová zakončení pro bolest lokalizována v nějaké anatomické struktuře, ale jsou rozptýlena po celém těle, v kůži, svalech, kloubech vnitřních orgánech. Jsou různé typy vláken, o kterých se předpokládá, že vedou různou rychlostí a zprostředkovávají akutní, ostrou prudkou bolest a jiná difúzní, pozdní bolest tupou. Receptory jsou obvykle polymodální, odpovídající jak na teplotu, tak na mechanické a chemické stimuly a na poranění tkáně. Odpověď na horko je jednou z nejprostupovanějších bolestivých odpovědí. Na rozdíl od čichu nebo fotorecepce polymodalita nociceptorů – chemické, fyzikální i teplotní stimuly Receptory jsou rozptýleny po celém těle Jste li u zubaře a necháte-li si aplikovat anestezi, anestetika blokují všechny napěťově řízené sodíkové kanály. To zablokuje jakékoliv čití a i motorické funkce. Nyní však byly objeveny sodíkové kanály, které jsou pouze v neuronech vnímajících bolest. To je výzva pro farmaceutické laboratoře, aby našly „kouzelnou kulku“ selektivně na ně. TRPV1 kanál, který je otevírán kapsaicinem, nebo teplotami nad 42°C se vyskytuje pouze na nociceptorech! Takže jeho blokáda způsobí anestezii bez paralýzy. MAGNETORECEPCE Varianta mechanorecepce- Magnetit? Johnsen, S. and Lohmann, K. J. (2008). Magnetoreception in animals. Physics Today March, 29-35. Varianta mechanorecepce- Magnetit? Varianta mechanorecepce- Magnetit? VARIANTA FOTORECEPCE? Fotochemický model založený na reakcích radikálových párů. Spontánní oscilace mezi S a T stavem. Posun v pravděpodobnosti výtěžku reakce. Magnetická síla •Nejpravděpodobnější kandidáti na magnetoreceptor zrakové dráhy. •Signální proteiny zvířat i rostlin, homologní DNA fotolyázám. •Součástí biologických hodin. Kryptochromy: Kryptochromy: Radikálový pár tvoří FAD (akceptor e-) a tryptofan (donor e-). Flavinový kofaktor obsazuje molekulární kapsu kryptochromu a tvoří radikálový pár [FAD°- + TrpH°+], který se nachází v singletovém (25 %) nebo tripletovém (75 %) stavu. Kryptochromy: http://www.ks.uiuc.edu/Research/cryptochrome/ Solov’yov, I. A., H. Mouritsen, and K. Schulten. 2010. Acuity of a cryptochrome and vision-based magnetoreception system in birds. Biophysical Journal 99: 40-49. Je-li Cry fixován na membránu polokruhovité struktury a napojen na zrakovou dráhu, mohl by vytvořit „magnetické obrazce“. Solov’yov, I. A., H. Mouritsen, and K. Schulten. 2010. Acuity of a cryptochrome and vision-based magnetoreception system in birds. Biophysical Journal 99: 40-49. Reakce je směrově specifická a některé receptory v polokruhovité struktuře (nejspíše sítnici) budou ovlivněny více než ostatní. Je-li Cry fixován na membránu polokruhovité struktury a napojen na zrakovou dráhu, mohl by vytvořit „magnetické obrazce“. Cry byl původně objeven jako protein řídící cirkadiánní rytmy Rytmické děje jsou přirozenou součástí funkce organizmu. Předpovídají pravidelné změny bez ohledu na přechodné výkyvy denní nebo sezónní. Rytmicita s vazbou na prostředí Cirkadiánní = asi 24 hod perioda Chronobiologie Chronopatologie Pracovní výkon, učení soustředění, ale i účinnost léků závislá na denní době. Při konfliktu hodin nebezpečí poruch spánku (jet lag), příjmu potravy (obezita, diabetes), onkologických poruch… Suprachiasmatické jádro a řízení motorické aktivity. Po vyřazení SCN se rytmus rozpadá Molekulární hodiny a zpětnovazebná smyčka synchronizovaná světlem. Centrální a periferní oscilátory Circ. hodiny jsou v různých orgánech odpovědných za řízení metabolismu a pohybu. Master clock v SCN je synchronizuje. SCN a pineální orgán citlivé na světlo. Ve zpětnovazebné smyčce jsou pozitivními elementy transkripční faktory CLOCK and BMAL1. Ty dimerizují a iniciují transkripci genů Period a Cryptochrome. Negativní zpětná vazba je zajištěna PER:CRY dimery, které translokují zpátky do jádra, kde potlačují svou vlastní transkripci působením na CLOCK:BMAL1 komplex, kterému brání v dimerizaci. Jiná regulační smyčka je indukována CLOCK:BMAL1 heterodimery. MYŠ Cyklující faktory řídí transkripci regulačních Ccg genů. Ty zajišťují downstream efekty. Možná otázka Jaké jsou možné mechanismy magnetorecepce? Co víte o kryptochromech? CÍTĚNÍ PŘES TRP KANÁLY TRP – TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL Objeveny v oku octomilky 1969 Univerzální buněčné sensory změn v okolním prostředí – slouží i organismům Evoluční specializace na zrak, čich, chuť, sluch, dotek, osmolalitu, teplotu, bolest. TRP superrodina je specifická třída kanálů, které se otevírají v odpověď na celou škálu chemických a fyzikálních stimulů. Díky této škále vrátkování, TRP kanály slouží jako univerzální senzory, které dovolují buňkám a celým organizmům detekovat změny v jejich prostředí. Během evolučního vývoje došlo k pozoruhodné specializaci těchto bílkovinných komplexů tak, že mohou měnit svou konformaci vlivem různých chemických i fyzikálních podnětů: mohou hrát roli při zraku, čichu, chuti (sladka, hořka a umami), sluchu, doteku, osmolality, pH, teploty, bolesti od kvasinky a háďátka přes Drosophilu k člověku. Tedy téměř všech prozkoumaných modalit. Některé TRP kanály jsou přímo receptory, zatímco jiné jsou efektory výše stojících s G-proteinem spřažených receptorů. Některé TRP kanály fungují jako buněčná čidla, která převádějí změny okolního prostředí na produkci druhých poslů uvnitř buněk, a to především vápníku, čímž dochází k aktivaci nebo modulaci činnosti dalších receptorů. Různé teplotní nastavení Molekulární identifikace teplotně aktivovaného iontového kanálu TRPV1, který se uplatňuje v přenosu bolestivých podnětů na primárních nociceptivních neuronech, vedla k prudkému zvýšení zájmu fyziologů o další iontové kanály této skupiny a díky rozsáhlým genomickým projektům ukázala existenci obecných molekulárních principů senzorické transdukce. U člověka bylo dosud identifikováno 27 genů pro TRP receptory a jejich fyziologická úloha byla prokázána v souvislosti s některými onemocněními, jako jsou poruchy metabolizmu hořčíku (hypomagnezémie), polycystická onemocnění ledvin, nebo mukolipidózy (poruchy odbourávání glykoproteinů a jejich hromadění ve tkáních). Některé podtypy TRP receptorů se nacházejí v nedráždivých buňkách, jako jsou např. keratinocyty, ledvinný epitel a prostata. NO zprostředkovaná dráha vedoucí k relaxaci hladké svaloviny endotelu Studium TRP kanálů je zajímavé nejen pro jejich univerzální roli ve smyslové transdukci, ale i směřuje k hlubšímu porozumění mechanizmů, které se uplatňují při vzniku některých onemocnění nervového systému a k cílenému hledání prostředků pro jejich léčbu. Jejich studiem se blížíme pochopení Ca citlivých mechanismů Ca regulace neexcitabilních buněk jako je aktivace T buněk, řízení apoptózy, proliferace, sekrece a buněčné migrace. Možná otázka Charakterizujte funkci a význam TRP kanálů. • Závěrem: Buňky konzervativně využívají již vyzkoušených mechanismů k předávání signálů. Schopnosti buněk vidět, slyšet, čichat se svými mechanismy neliší od schopností regulovat vývoj, zrání, diferenciaci, transport, metabolismus a homeostázu. Studiem smyslových schopností poznáváme obecná pravidla molekulární komunikace.