Molekulární fyziologie živočichů Vítězslav Bryja Ústav experimentální biologie PřF MU & Biofyzikální ústav AV ČR Růstové faktory z rodiny Wnt ve fyziologii Wnts (Wingless/Int) - family of ligands - 19 members in human and mouse - glycosylated and palmitoylated extracellular proteins - short range of action, bind to extracellular matrix - only in multicellular animals canonical (eg. Wnt-1 or Wnt-3a) non-canonical (eg. Wnt-5a) Wnt/-kateninová dráha (= kanonická dráha) - např. Wnt-1 nebo Wnt-3a - induce axis duplication in Xenopus - induce transformation of mammary cell line C57mg -signal via nuclear translocation of -catenin Příklady vývojových a fyziologických procesů regulovaných kanonickou Wnt dráhou Maternální Wnt/-cateninová dráha determinuje dorsální (horní) pól vyvíjející se zygoty a embrya axis duplication assay: Wnt/-cateninová dráha určuje anterioro-posteriorní (AP, předozadní) osu těla během gastrulace – podporuje vznik zadních a blokuje vznik předních částí těla Uncx4.1/Mesogenin myší embryo po gastrulaci (E8.5): Cílové geny Wnt/-cateninové dráhy jsou exprimovány v zadní části těla. Deplece Wnt/-kateninové dráhy při gastrulaci = ztráta zadních částí těla wild type Wnt-3a knockout Deplece inhibitorů Wnt/kateninové dráhy při gastrulaci = ztráta předních částí těla wild type vs. Dkk1 knockout Wnt/-cateninová dráha je klíčovým regulátorem aktivace kmenových buněk jak v embryogenezi, tak v dospělých tkáních Wnt/-catenin dráha je velmi často deregulovaná u nádorů! according to Beachy et al., Nature 2004 Aktivace -cateninu ve vyvíjející se mozkové trubici: Chenn & Walsh, 2002: Science;297:365-369.Zechner et al., 2003: Dev. Biol.;258:406-418. midbrain (Brn4-promotor) cortex (nestin enhancer) Järvinenet al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 18627-18632 Aktivace beta-cateninu v kmenových buňkách zubu: Reya & Clevers 2005, Nature Aktivace kanonické Wnt dráhy indukuje de novo tvorbu vlasových kořínků Moore & Lemischka, Science, 2006 Wnt signalizace v normální a patologické fyziologii střevního epitelu Prostředí kmenových buněk (stem cell niche) střevní epitel – latest developments aneb jak opravdu na to (Barker et al., Nature, October 2007) A. Příprava transgenní myši č. 1 za účelem zjistit, kde je nový potenciální stem cell marker exprimován (in vivo expression profiling). Lgr5 je exprimován specificky v buňkách ve spodní části krypty. Prostředí kmenových buněk (stem cell niche) střevní epitel – latest developments aneb jak opravdu na to (Barker et al., Nature, October 2007) B. Příprava transgenní myši 2, 3 a 4 za účelem zjistit, co všechno vzniká z Lgr5-pozitivních buněk (Lgr5+ lineage tracing). Lgr5 pozitivní buňky dávají vzniknout všem částem buněčného epitelu. Prostředí kmenových buněk (stem cell niche) střevní epitel – latest developments aneb jak opravdu na to (Barker et al., Nature & Sato, Nature 2009) C. Lgr5 pozitivní buňky in vitro dávají vzniknout kompletní villus-crypt struktuře in vitro (Doposud se to s žádnými jinými buňkami nepodařilo) Experimentální důkaz: Vznik malých adenomů, které neprogredují Zkřížení s APC flox/flox myšima + tamoxifen Nekontrolovaná aktivace kmenových buněk má fatální následky Rychlý vznik adenomů a nádorů Zkříažení s APC flox/flox myšima + tamoxifen DMBA/TPA-induced skin carcinogenesis - benign papilomas, which in some cases progress into squamous cell carcinoma (SCC) DMBA/TPA-induced skin carcinogenesis Malanchi et al. 2008, Nature CD34+ CD34- Malanchi et al. 2008, Nature Wnt/-cateninová dráha v regeneraci zebrafish chick axolotl Wnt/-cateninová dráha v regulaci stárnutí Klotho myš -mutantní kmen myši s fenotypem akcelerovaného stárnutí: např. kratší život, arterioskleróza, snížená plodnost nebo kožní atrofie - protein Klotho je transmembránový protein s velkou extracelulární doménou, ta může být odštěpena a volně cirkulovat v krvi aktivita Wnt/-cateninové dráhy ve střevním epitelu Model 1 – svalová fibróza - s prodlužujícím se věkem stále častěji při regeneraci svalu vznikají místo svalových buněk buňky fibrózní tkáně – tak přispívají k nižší výkonnosti svalu, která souvisí se stárnutí Model 2 – parabiotické párování Fyzické propojení dvou krevních systémů (a tím i dvou vnitřních prostředí) u myši BrdU Nekanonická Wnt dráha - e.g. Wnt5a - do not induce axis duplication in Xenopus - do not induce transformation of mammary cell line C57mg - do not signal via nuclear translocation of - catenin Drosophila – PCP (planar cell polarity) Molekulární mechanismus ustavení PCP Seifert and Mlodzik, Nature Reviews in Genetics, 2007 Non-canonical/PCP (Planar cell polarity) pathway: phenotypes in mouse Stereocilia orientation in inner ear hair cells Actin Qian et al., 2007, Dev. Biol. Konvergentní extenze – migrace buněk směrem ke středu těla – vede k prodlužování tělní osy Non-canonical/PCP (Planar cell polarity) in mouse (and human) convergent extension Možnosti studia konvergentní extenze - Kellerovy explantáty (Xenopus) CE control XLRP5 MO XLRP5 MO + mLrp5 Důsledky narušené konvergentní extenze (CE) Exencephaly Hamblet et al., 2002, Development Open neural tube Known Wnt5a knockout phenotypes E 18.5 +/+ -/Yamaguchi et al., 1999 Qian et al, 2007 RRSBDB ror2 1740-1774del35 N620K W720X C182X R184C R189W R205X R366W R396X Q502X 1321-1325del(5) IVS8+3+5del3ins19 1398-1399insA W749X 2249delG Y755X Q760X Mutations in Ror2 cause dominant brachydactyly type B (BDB) and recessive robinow syndrome (RRS) Hari, L. et al. J. Cell Biol. 2002;159:867-880 I. Vývoj neurální lišty: - neurální lišta je zdrojem periferního nervového systému, melanocytů, obličejových kostí a svalů, srdce a dalších Wnt-3a Kanonické a nekanonické Wnt signálování často regulují odlišné části téhož vývojového procesu. Henderson DJ et al., 2006, TrendsCard. Res. Heart outflow tract development Wnt1/3aDKO Wnt5aKO Děkuji za pozornost Lo Celso, C. L. et al. Development 2004;131:1787-1799 Důsledky aktivace -cateninu v epidermis (po depilaci)