Biologie vitaminu A a jeho úloha ve
fyziologii živočichů
E-mail: jipa@sci.muni.cz
Tel: 532 146 223 / 116
KAROTENOIDY
von Linting, 2006
- Vitamin A jsou obecně lipofilní látky podobné struktury a aktivity (retinol,
retinal, kyselina retinová)
- Prekurzory retinoidů jsou karotenoidy, zejména b-karoten (~ 50 z >400 je
využitelných)
- Nejdůležitejším derivátem je kyselina retinová (RA), odvozená od retinalu
- Tělo je přijímá v potravě, karotenoidy v rostlinné, vitamin A a jeho deriváty v
živočišné
RETINOIDY
retinyl estery <-> retinol <-> retinal <-> kyselina retinová
(vit. A) (RA – retinoic acid)
Retinol equivalent (RE) = retinol v potravě (µg) + b-karoten (µg) + ostatní karotenoidy (µg)
6 12
RE u žen ~ 800 mg na den
RE u mužů ~ 1000 mg na den
STRUKTURY NEJBĚŽNĚJŠÍCH PŘIROZENÝCH RETINOIDŮ
Ross, 2000
karoteny & retinoidy
(potrava) retinyl estery
Retinoidy jsou resorbovány v tenkém střevě, v enterocytech se karotenoidy mění na
aktivní retinoidy (retinyl estery), s lipidy a dalšími lipofilními látkami tvořícími
chylomikrony jsou uvoněny do lymfatického systému odkud se postupně uvolňují do
celkového tělního oběhu. Zásoba je vytvářena v játrech (50-85% celkového) v
lipidových kapénkách ve hvězdicovitých buňkách jater.
Distribuce retinoidů v organismu
- 90% retinoidů je v těle v podobě retinyl esterů v lipidové složce chylomikronů,
část jich může být i přímo v buněčných membránách.
- beta-karoteny mohou být navíc uloženy v tukové tkáni
- v případě potřeby (mobilizace zásob) je retinol uvolňován z jater do krve,
vázaný s v hepatocytech syntetizovaným proteinem RBP (retinol vázající
(binding) protein). Tento komplex (holo-RBP) se váže s transthyretinem (TTR,
prealbumin), čímž je zabráněno vylučování retinolu v ledvinách. Takto v
plasmě cirkulující retinol je připraven ke zpracování v cílových buňkách.
- K přeměně na koněčné funkční retinoidy dochází až v místě spotřeby.
! Retinoidy tedy působí zejména autokrinně a parakrinně !
Distribuce retinoidů v organismu
Kyselina retinová (RA)
MORFOGEN & TERATOGEN
PLEIOTROPNÍ VLASTNOSTI
V průběhu embryonálního vývoje je metabolismus RA nezbytný zejména pro
formování tělní osy a segmentaci (Hox geny), vývoj CNS, očí, srdce, ledvin,
pohlavních orgánů, a epitelů obecně.
U dospělců se pak podílí zejména na udržování homeostáze imunitního systému,
epitelů a zrání pohlavních buněk (spermatogenezi).
Výběr nejvýznamějších oblastí vyžadujících metabolizmus retinolu/vit.A
A) fotorecepce B) růst a vývoj organismu
Ross, 2000
Marie Virtanen, Hans Törmä and Anders Vahlquist
J.Invest. Dermatol.
Účinek RA na epidermis
Úloha RA ve vývoji plic
Úloha RA ve vývoji plic
ÚLOHA RETINOIDŮ VE FOTORECEPCI
retinyl estery <-> retinol <-> retinal <-> kyselina retinová
(vit. A) (RA – retinoic acid)
Mechanismy regulující účinky RA v buňce
- proteiny jejího metabolismu
a) Enzymy
Metabolismus karotenoidů a retinoidů, zejména oxidace.
b) Retinoidy vázající proteiny
Zásoba v buňce, regulace jejich intracelulární koncentrace, transport.
c) Jaderné receptory RA (transkripční faktory)
Realizace transkripce na RA závislých i nezávislých genů.
REGULACE RA na buněčné úrovni
V regulaci ontogeneze je klíčovým
retinoidem kyselina retinová – RA,
a to její izoformy all-trans a 9-cis.
Ross, 2000
McCaffery, 2000
ENZYMY - I
Retinol dehydrogenázy : oxidace RETINOLU -> RETINALALDEHYD
Dvě skupiny alkoholdehydrogenáz, třída I a IV. Přitom třída I se zdá málo významná
pro metabolismus retinoidů, oproti třídě IV, kterou lze detekovat v oblastech intenzivního
metabolismu retinoidů od 10 dpc (myš). Pravděpodobně se ale uplatňují i membránově
vázané alkohol dehydrogenázy (známe 2 co oxidují retinol), upřednostňují však pouze
9-cis isomery.
ENZYMY metabolismu RA
ENZYMY - II
2) Retinaldehyd dehydrogenázy : oxidace RETINALDEHYDŮ -> KYSELINU RETINOVOU
Tato reakce může být katalyzována i aldehyd nebo xanthin oxidázami, ale převážně je řízena
retinaldehyd dehydrogenázami. Byly identifikovány 3 typy, RALDH, které s liší specifitou
k retinaldehydům a distribucí v organismu.
RALDH1 (=AHD2, ALDH1) ačkoliv je relativně málo aktivní, je silně exprimována v retině, a tak
prakticky všechna RA v retině je produktem tohoto enzymu. Dále je během embryogeneze
exprimována ve středním mozku (mesencefalon) a v corpus striatum. Váže také androgeny
a je možné, že tak zprostředkovává interakci mezi RA a androgenními jadernými receptory.
RALDH2 je vysoce selektivní k retinaldehydům. Začíná se exprimovat již v průběhu gastrulace
A odpovídá za produkci RA ve všech tkáních závislých na RA (mozek - zejména motoneurony,
mícha, srdce, ledviny, pohlavní orgány,…). RALDH2 -/- embrya hynou v důsledku neuzavření
nervové trubice a poruch ve vývoji srdce, přídavkem RA, lze tyto efekty potlačit.
RALDH3 (=V1) je sice vysoce aktivní enzym, ale málo specifický k oxidaci rentinaldehydům.
U časných embryí je exprimována ve ventrální části retiny a v gangliích koncového mozku
(telencephalon). Později je přítomen zejména v játrech a kůži. Společně s RALDH1 u embryí
Katalyzuje také přeměnu gamma-aminobutyraldehydu na GABA.
ENZYMY - III
CYP26 (=P450RAI) : oxidace KYSELINY RETINOVÉ -> KYSELINU 4-OXORETINOVOU
(Hydroxyláza kyseliny retinové, dvě formy CYP26A1 a CYP26B1)
CYP26 je členem velké rodiny cytochromů P450. V současné době je jediným známým
enzymem katabolizujícím RA. Exprese CYP26 je indukována RA, a je přítomen minimálně
ve všech buňkách s metabolismem RA a v buňkách citlivých k působení RA. Jeho podíl
na deaktivaci RA není však plně objasněn. Např. u žab, 4-oxoRA je silným aktivátorem
receptorů RA a tak i buněčných regulací citlivých k RA.
Je pravděpodobné, že enzymů metabolizujících retinoidy je více, avšak s menším významem
než výše jmenovaní. Jejich exprese, podobně jako syntéza RA je v průběhu embryonálního
vývoje velice dynamická v závislosti na typu tkáně a vývojovém období. Obecně je souhra v jejich
expresi a aktivitě nezbytná pro segmentaci (zejména regulace Hox genů) vyvíjejícího se embrya.
Retinoidy vázající proteiny
1) Intracelulární
a) Buněčný retinol vázající protein (CRBP – cellular retinol binding protein)
Váže retinol i retinaldehyd a chrání je před oxidacemi a světlem. Retinol vázaný
na CRBP-1 však může být oxidován na retinaldehyd retinol dehydrogenázou.
Uvolněný retinaldehyd je pak přístupný pro oxidaci RALDH na RA.
b) Buněčný RA vázající protein (CRABP – cellular RA binding protein)
CRABP-I chrání RA před další metabolizací podobně jako CRABP-II, který
je však přítomen nejen v cytoplasmě, ale i v jádře, asociuje s receptory pro RA
a slouží tak i jako transkripční regulátor / kofaktor.
Je zajímavé, že absence CRBP a CRABP (knock-out myši) má minimální účinek
na fenotyp organismu, na rozdíl od vypnutí některého z enzymů (viz. výše) nebo
receptorů (viz. níže).
2) Vázané na membránu
Megalin (gp330 / LRP-2) - patrří do rodiny LDL (low-density lipoprotein)
receptorů. Je exprimován v membránách zejména epiteliálních buněk a slouží
jako receptor pro RBP a retinol (a také sonic hedgehog (Shh)). Megalin
zprostředkovává transport retinolu (vázaného jak na RBP tak LDL) skrze vrstvy
epiteliálních buněk, ale i do jejich intracelulárního prostoru. V ledvinách se podílí
i na transportu dalších lipofilních vitaminů (např vit. D + vit. D vázající protein, vit.
B12 + transcomalamin). Komplex ligand – megalin je pohlcen procesem
endocytózy a vzniklý endosom cestuje buňkou na místo určení.
Retinoidy vázající proteiny
Receptory RA
Receptor RA = RAR = retinoic acid receptor (RARa, RARb, RARg + isoformy)
RAR je aktivovaný jak all-trans RA, tak 9-cis RA
Receptor retinoidu X = RXR = retinoid X receptor (RXRa, RXRb, RXRg + isoformy)
RXR je aktivovaný pouze 9-cis RA
RA receptory patří do rodiny jaderných receptorů společně s receptory
thyroidních hormonů, receptorem vit. D, receptory aktivujícími
peroxisomové proliferátory (PPARs), jaterním X Receptorem (LXR),
farsenoidovým receptorem (FXR) a se sirotčími (orphan) receptory. S
těmi zde jmenovanými RXR tvoří také heterodimery regulující transkripci
mnoha ontogeneticky významných genů.
Regulace genů řízených RA je zprostředkována jejími receptory, které
zároveň slouží i jako transkripční faktory. Vytvářejí funkční homo
(RAR/RAR, RXR/RXR) i heterodimery (RAR/RXR), přičemž heterodimery
jsou výrazně transkripčně silnější/aktivnější. Jejich kombinace (48) jsou
specifické pro konkrétní promotorové sekvence (response elements) v
promotorech genů indukovaných RA.
Signální dráha jaderných receptorů
DNA
DNA
transkripce on / off ?
TF
TF
NR
NR NR
NR
NR
ligandy
jaderné (nuclear)
receptory
transkripční
faktory
transkripce on / off ?
Příklady promotorových sekvencí s RAR/RXR vazebnými místy
Ross, 2000
Srovnání některých defektů vyvolaných nedostatkem RA (RAD),
oproti vyřazení jednotlivých receprotů RAR nebo RXR
Ross, 2000
Obecně vyřazení jednotlivých isoforem receptorů (homozygoti -/- RARa1,
RAb2 nebo RARg2) nemá žádný zásadní účinek na fenotyp takových zvířat.
Po vyřazením jednotlivých subtypů, však již můžeme pozorovat různé
malformace a nedostatečnosti. Z RAR se jeví nejvýznamnější RARg.
Větší účinek má vyřazení RXR, které je způsobeno pravděpodobně jejich
úlohou při vytváření heterodimerů s ostatním jadernými receptory. RXRa -/-,
hyne 13.5-16.5 dpc, z důvodu nedostatečně vyvinutého srdce, má také
nedostatečně vyvinuté oči. RXRb -/- je viabilní ale samci jsou sterilní.
Interakce transkripční aktivity RA a některých drah transdukce signálu
Aktivní komplex RAR/RXR v mnoha případech působí jako represor v promotorech
rozpoznávaných také AP-1 (Jun/Fos komplexy) a Smad proteiny (TGFb rodina).
Na druhou stranu, aktivita RA receptorů může být modifikována jejich fosforylací
na serinových a threoninových zbytcích serin/threonin kinázami. A to zejména MAPK
kinázami (Erk; JNK1,2,; p38), protein kinázou A (PKA) a na cyklinu H závislou cdk7.
Tyto postranslační modifikace RA receptorů vedou k další variabilitě v možnostech
regulovat RAR/RXR řízenou transkripci jak pozitivně, tak negativně a to i za nepřítomnosti
ligandu (RA). Modifikují, zejména interakce s dalšími proteiny transkripčního komplexu.
Některé fosforylace (např. p38 -> RARg) indukují degradaci daných receptorů)
Inhibice AP-1 zprostředkované
transkripce kyselinou retinovou
RXRa / RXRa
A/B DC FE
A/B DC E
LBD/AF-2DBDAF-1
LBD/AF-2DBDAF-1
EEIVPS74PPS77PPPLPR
EELVPS67PPS70PLPPPR
EEMVPSS66PS68PPPPPR
EEMVPSS77PS79PPPPPR
RARa1
RARb2
RARg2
RKRRPS369RP
RKRRPS362KP
RRRRPS360QP
RRRRPS371QPRARg1
RXRa
SSSLNS22PTGR….S44P.. S48P.. S54P… SS61P.. SS75P..PTT87P S96P..S101P LNPSS265PNDP
Serinové a threoninové zbytky fosforylované (■) u RAR/RXR receptorů,
ukázány jsou i potencionálně fosforylovatelné(čísla)
AF-1 (A/B doména) – oblast regulující aktivaci transcripce, nezávisle na ligandu
DBD (C doména) – DNA vázající doména (DNA-binding domain)
LBD/AF-2 (D/E doména) – oblast regulující aktivaci transkripce, závislé na ligandu
PKAMAPKs + cdk7
JNK1 + JNK2
NN-
-C
-C
Jedna z možných interakcí metabolismu RA s promocí nádorového onemocnění
Systém pro detekci RA v buňkách/tkáních
(RARE-LacZ reportér)
RARE * LacZ
RAR RXR
RA
RA
RA
RA
Xn*
b-galaktozidáza
X-Gal
X-Gal
X-Gal
X-Gal
X-Gal
*další faktory/sekvence nezbytné pro funkci promotoru
Exprese a aktivita RALDH-2 v mozku myšího embrya (16 dpc)
A) In situ hybridizace mRNA RALDH-2
B + C) RARE aktivita (RARE-LacZ reporter)
Detekce epxrese CYP26 (in situ mRNA hybridizace)
v retině (A) a RARE aktivita (RARE-LacZ reporter)
v embryonální retině (čelní a zadní pohled)(B)
13 dpc
2 ds postnatal
13.5 dpc 16 dpc
McCaffery, 2000
 Klinické využití kyseliny retinové a jejich derivátů
- kožní onemocnění (viz. Tab.1 další slide)
- různá onkologická onemocnění – stále předmětem výzkumu
- akutní promyelocytická leukémie
(spojeno s translokací RARa -> potlačení jeho fce)
- včetně retinoidů také inhibitory degradace RA
- inhibitory cytochromu P450/CYP26 (zejména dermatologie)
 Experimentální využití kyseliny retinové
- vděčné diferenciační činidlo, induktor diferenciace mnoha typů
nádorových buněk, ale i embryonálních kmenových a jim
příbuzných buněk
Retinoidy využívané v dermatologii
Literatura ke studiu
1. Clagett-Dame, M., and L. A. Plum. 1997. Retinoid-Regulated Gene Expression in Neural
Development. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression 7:299-342.
2. Clagett-Dame, M., and H. F. DeLuca. 2002. The Role of Vitamin A in Mammalian Reproduction and
Embryonic Development. Annu. Rev. Nutr. 22:347-381.
3. Maden, M., and M. Hind. 2003. Retinoic Acid, A Regeneration-Inducing Molecule. Developmental
Dynamics 226:237-244.
4. McCaffery, P., and U. C. Drager. 2000. Regulation of retinoic acid signaling in the embryonic nervous
system: a master differentiation factor. Cytokine & Growth Factor Reviews 11:233-249.
5. McCarthy, R. A., and W. S. Argraves. 2003. Megalin and the neurodevelopmental biology of sonic
hedgehog and retinol. J. Cell Science 116:955-960.
6. Napoli, J. L. 1999. Interactions of retinoid binding proteins and enzymes in retinoid metabolism.
Biochimica et Biophysica Acta 1440:139-162.
7. Rochette-Egly, C., and P. Chambon. 2001. F9 embryocarcinoma cells: a cell autonomous model to
study the functional selectivity of RARs and RXRs in retinoid signaling. Histol Histopathol 16:909-922.
8. Ross, S. A., P. J. McCarffery, U. C. Drager, and L. M. De Luca. 2000. Retinoids in Embryonal
Development. Physiological Reviews 80:1021-1054.
Shulman2005 RXR x metabolic syndrome