Biologie cytokinů rodiny gp130/IL-6 e-mail: jipa@sci.muni.cz Tel: 532 146 223 / 116 Gp130/IL-6 rodina - Rodina cytokinů sdílejících transmembránový receptor, glykoprotein - gp130. - gp130/IL-6 cytokiny nálěží do cytokinové třídy I, do skupiny s dlouhými řetězci tvořené 4 těsně semknutými a-helixy (A). - Na rozdíl od ostatních cytokinů třídy 1, jejichž hlavní funkce je regulace hematopoetického a lymfatického systému, gp130 cytokiny mají významné uplatnění i v ostatních buněčných systémech v rámci regulace ontogeneze a homeostáze. IL-6 – interleukin-6 IL-11 – interleukin-11 LIF – leukemia inhibitory factor CT-1 – cardiotrophin-1 CNTF – ciliary neurotrophic factor OSM – oncostatin M CLC – cardiotrophin-like cytokine NPN - neuropoietin Po navázání ligandu na specifický receptor se tento komplex váže na receptor gp130 za vzniku stabilního komplexu a spouští se transdukce signálu IL-6-R IL-11-R CNTF-R CLF OSM-R LIF-R Specifické receptory k jednotlivým ligandům Gp130 / IL-6 cytokiny (ligandy) IL-6 IL-11 LIF CT-1 OSM IL-6-R IL-11-R CNTF-RLIF-R OSM-R CLF CNTF CLC Gp130* ! Nesignalizující receptory - a Signalizující receptory - b *gp130 samotný má k ligandům velice nízkou afinitu, tím je zabráněno aktivaci gp130 samotným ligandem! NPN Komplexy tvořené cytokiny IL-6 rodiny s jejich receptory Nesignalizující receptory váží dva signalizující receptory, gp130 případně LIFR • IL-6 a IL-11 –> jejich receptor váže dvě molekuly gp130 • LIF, CT-1, CNTF, CLC –> sdílejí receptor LIF-R, který se po navázání ligandu váže k jedné molekule gp130. CNTF a CLC sdílejí dále CNTF-R tvořící tak receptorový hetero-trimer. • OSM –> se kromě LIF-R váže i na OSM-R Heinrich 2003 extracellular intracellular G-CSFR IL-6R gp130 LIFR CNTFR IL-11R Příklady struktury receptorů gp130 cytokinů gp130-R IL-12R Receptory cytokinů třídy 1 - Obecně regulují proliferaci, diferenciaci a apoptósu u imunitního, hematopoetického, nervového, kardiovaskulárního a endokrinního systému. Dále se uplatňují v metabolismu kostní a tukové tkáně, v zánětu a v indukci akutní odpovědi na zánět. - V současné době je nejlépe zmapován jejich význam v hematopoéze, imunitní odpovědi, neurogenezi, adipogenezi a reprodukci. - Předpokládá se, že gp130 indukovaná kaskáda transdukce signálu hraje jednu z klíčových rolí v regulaci kmenových buněk obecně a podobně i nádorových buněk. Mezi gp130 signalizující cytokiny se řadí i IL-27 (interleukin 27) patřící do rodiny IL-12 (interleukin 12), jeho specifickým receptorem je IL-27Ra (WSX-1) Do rodiny IL-6 cytokinů se dále řadí IL-31 (interleukin 31), který ovšem neváže gp130, ale „gp130-like monocyte receptor“- IL-31-Ra, který heterodimerizuje s OSM-R IL-6 cytokiny – regulace a funkce - Jednotlivé IL-6 cytokiny jsou ve svých účincích z velké části vzájemně zastupitelní - Specifičnost účinků je dána přítomností specifického receptoru na povrchu nebo v okolí buněk, ale také koncentrací jednotlivých cytokinů - gp130 je přítomen prakticky na všech buňkách - Membránově vázaný, receptor může být nahrazen solubilním (IL-6-R, IL-11-R, LIF-R, CNTF-R, gp130 – patrně působí jako competitor k membránově vázaným variantám, nebo jako a-receptor. In vivo byl v plasmě prokázán IL-6-R Pro experimentální účely byl připraven komplex IL-6 / IL-6-R = tzv. hyper-IL-6, který aktivuje gp130 vždy. Rose-John2002 IL-6 IL11 LIF OSM CNTF CT-1 Udržení pluripotentních buněk (ES) -/+ - + + + + Diferenciace do makrofágů (M1) + - + + -/+ + Růst myelomových buněk + + + + + nd Podpora trombopoesy + + + + nd nd Indukce proteinů akutní fáze + + + + + + Indukce ACTH -/+ + + + nd nd Neurální diferenciace + + + + + + Indukce osteoklastů + + + + nd nd Srdeční hypertrofie -/+ + + + -/+ + LIF (široké spektrum buněk, zejména mezenchymálního původu) má zásadní význam v reproducki, je nezbytný pro usazení blastocysty v děložní sliznici a pro přežívání a růst spermatocytů. V průběhu neurogeneze indukuje vznik astrocytů z neurálních progenitorů, indukuje diverzifikaci některých typů neuronů (např adrenergní na cholinergní). Celkově s podílí na regulaci diferenciace motoneuronů. V hematopoése indukuje zejména diferenciaci buněk myeloidní řady. Blokuje transport lipidů do adipocytů. V játrech indukuje produkci proteinů akutní fáze zánětu. Podílí se na růstu kostí, zvyšuje resorpci vápníku i počet osteoklastů, zároveň zvyšuje i počet osteoblastů. Působí hypertrofně na svalové buňky (i srdeční). Je hlavní regulátor produkce ACTH. IL-6 a IL-11 (hematopoetické a imunitní buňky, fibroblasty) se uplatňují zejména v regulaci hematopoésy a imunitní odpovědi. Obecně podporují proliferaci a diferenciaci hematopoetických progenitorů. IL-6 indukuje produkci protilátek B-lymfocyty. IL-11 podporuje vznik NK buněk, a podílí se na zdravém vývoji placenty. IL-6 patří také mezi myokiny (myokiny - cytokiny produkované svalovými buňkami). CNTF, CLC, CT-1 a NPN (hlavně neurální buňky – glie, astrocyty) působí zejména v průběhu neurogeneze, podobně jako LIF. Svaly produkovaný CT-1 reguluje jejich spojení s motoneurony, podporuje přežívání a růst kardiomyocytů. CNTF brání demyelinizaci neuronu. Uplatňují se ovšem i v hematopoése. (2.3 % japonců jsou CLC -/-, myši mají podobný fenotyp jako CNTF -/-) OSM (monocyty, lymfocyty) v hematopoése regulace trombopoésy a erytropoésy, v neurogenezi podpora motoneuronů. LIF a IL-11 a zahnízdění (implantaci / nidaci) blastocysty ve sliznici dělohy (endometriu) Hondo, 2004 a) estrogen a progesteron, zvyšují proliferaci a diferenciaci buněk sliznice b) Estrogen indukuje produkci LIF žlázkami endometria. LIF je produkován do lumen dělohy kde aktivuje buňky luminálního epitelu k produkci mnoha genů zahrnujících i faktory buněčné adheze jako jsou Coch a CD9. c) Invaginující blastocysta spouští procesy decidualizace řízené prostaglandiny (produkovanými Cox-2) a IL-11 Vliv antagonistů (LIFA & IL11A) na průběh implantace blastocysty do endometria dělohy. Požkození způsobené nadbytkem LIF Myším byly transplantovány buňky produkující zvýšené množství LIF. Tyto buňky se přednostně usazují v kostní dřeni a ve slezině. Po 2-3 měsících dochází ke ztrátě hmotnosti, kachexii, nervozitě a hypermobilitě myší (A). Detekujeme také zvýšenou proliferaci v dřeni dlouhých kostí (B), kalcifikaci v játrech, srdci a svalech. Dále pozorujeme ztrátu tukové tkáně, atrofii thymu, absenci žlutého tělíska v ováriu, absenci spermatogonií v semenotvorných kanálcích (C). Metcalf, 2003 Nadbytek hyper-IL6 zesílení tlouštky stěn srdečních komor, hematopoéza mimo kostní dřeň, thrombocytózy, plasmacytomy, hyperplasie hepatocytů Myši deficientní k některému z IL-6 cytokinům jsou životaschopné a s výjimkou LIF a IL-11 -/- i plodné. Jsou však menší, s poruchami hematopoésy, adipopoésy, a s nedostatečnou imunitní odpovědí. LIF, CNTF, CT-1, CLC -/- mají také nedostatečně vyvinuté motoneurony a jejich propojení se svaly, jsou hypermotorické, ale na „pokraji smrti“. LIF-R - / Myši hynou před a těsně po narození, zejména v důsledku chyb v neurogenezi, hematopoéze, celkovém metabolismu (hypoxie v důsledku špatně vyvinuté placenty) a nedostatečně vyvinuté kostry. IL-6R -/- ??? Mnohem zásadnější význam má absence / nefunkční mutace jejich receptorů. IL-11Ra -/Normální hematopoéza, ale změny v tvorbě kostní tkáně, neplodné samice v důsledku chyb ve vývoji placenty. Některé imbrední kmeny myší mají navíc IL-11-Ra2 OSM-R - / Výrazné snížení krvetvorby, jak na úrovni progenitorů, tak v počtu periferních elementů CNTF-R - / Poškozené motoneurony => myši hynou hlady pro neschopnost sát CLF -/Poškozené motoneurony => myši hynou hlady pro neschopnost sát Gp130 - / Myši hynou během embryonálního vývoje v (8-12 den ~ organogeneze, 20-22 ds celkový), v důsledku poruch v hematopoéze, neurogenezi, kardiogeneze, hepatogenezi,… Tyto poruchy se objevují i v dospělosti, jak dokazují experimenty s tzv. kondiciovanými mutanty Fasnacht & Muller 2008 Význam transdukce signálu gp130 ve vývoji kostí (Sims 2008) Transdukce signálu gp130 cytokinů Ernst 2004 Komplex ligand / vysoce afinitní receptor / gp130 spouští několik paralelních drah transdukce signálu, hlavní / fyziologicky nejvýznamnější se zdá dráha JAK -> STAT. Heinrich 2003 JAK – Janusova kináza (tyrosin kináza) STAT – transduktor signálu a aktivátor transkripce (signal transducer and activator of transcription) Rovnováha mezi JAK/STAT a Ras/Erk signalizací při aktivaci gp130 receptoru Ernst 2004 APR – acute phase response Biologická odpověd pro různě aktivní gp130 receptor Ernst 2004 Heinrich 2003Regulace signální kaskády gp130 cytokinů je také regulovány specifickými protein tyrosin fosfatázami. V signalizaci gp130 cytokinů hraje klíčovou roli tyrosin fosfatáza SHP2. Zde (gp130 a LIFR) spouští signalizaci kaskádou Ras/Erk (MAPK) – kompetice s JAK/STAT. V případě zapojení OSMR, je nahrazena adaptérovým proteinem Shc. Komplex OSM / OSMR / gp130 aktivuje Erk (MAPK) dráhu přes Shc a ne přes SHP2 jako LIF-R a gp130. V některých případech je preferenčně aktivována dráha Erk a STAT5. Heinrich 2003 Jak a STAT proteiny se účastní i signalizace dalších cytokinů Liu, 1998 Boiani & Scholer 2005 Fenotyp u myši v důsledku deplece LIF/gp130 -> STAT3 signalizace (souhrn) aktivace (JAKs) regulace STAT1 Tyr701 Ser727 STAT2 Tyr690 (Ser287) STAT3 Tyr705 Ser727 STAT4 Tyr693 Ser721 STAT5a/b Tyr694 Ser725/S730 STAT6 Tyr641 Ser756 STATs jsou fosforylovány na serinech kinázami PKCd, Erk, JNK, p38. Význam této fosforylace a ani její přesný mechanismus není objasněn. Zdá se, že tato fofsforylace může zvyšovat transkripční aktivitu a stabilitu proteinů STAT. Další významné signální dráhy aktivované gp130 cytokiny aktivací JAK jsou: a) Tyrosin-kinázy Src rodiny: Hck (IL-6, LIF), cYes (LIF) b) PI3-K (fosfoinositol-3 kináza, PI3K -> Akt (PKB)) Obě tyto dráhy jsou zodpovědné zejména za pro-proliferační a anti-apoptické účinky gp130 aktivace. Aktivovaný receptor gp130 také asociuje s PKCd, jež fosforyluje jeho Thr890 a zvyšuje tak afinitu tohoto receptoru k STAT3. ALTERNATIVNÍ DRÁHY AKTIVACE STAT3 Aktivace prostřednictvím proteinů Hes (transkripční cíle signální dráhy Notch - protein Hes je schopen asociace s JAK2, jeho aktivace vedoucí k aktivaci STAT3 = fosforylace Y705 a dimerizace - sebeobnova neurálních kmenových buněk - propgrese nádorů Notch Hes STAT3 JAK2 STAT3 Hes ATP P Regulace / zpětná vazba v transdukci signálu gp130 cytokinů Negativní zpětná vazba aktivace gp130 signální dráhy je zprostředkována indukcí exprese proteinu SOCS (I.), inhibice pak interakcí PIAS se STAT (II.) a defosforylací STAT fosfatásou Tc-PTP (III.). Absence SOCS má v mnoha ohledech podobný účinek jako absence některého z komponet kaskády LIF->gp130->STAT3. Wormald 2003 Inhibice funkcí fosforylovaných gp130 receptorů a JAK proteiny SOCS Piessevaux 2008 SOCS (supresor signálu cytokinů / suppressor of cytokine signaling) – jejich exprese je indukována aktivací gp130 a dráhy JAK->STAT. Asociují s JAK, inhibují tak její aktivitu a tím je zastavena fosforylace / aktivace STAT (zpětná vazba). Jednotlivé SOCS proteiny vykazují jistou specifitu pro jednotlivé gp130 signální komplexy. SOCS proteiny = CIS (cytokine-inducible SH2 protein) a SOCS1-SOCS7. IL-6 (CIS, SOCS1,2,3), LIF (CIS, SOCS1,2,3), IL-11 (SOCS3), OSM (CIS, SOCS1,3) Piessevaux 2008 Základní struktura jednotlivých SOCS proteinů Piessevaux 2008 Li 2007 SOCS hrají také významnou úlohu v signalizaci ostatních STATs aktivujících cytokinů zejména IFNs. Poruchy regulace exprese SOCS proteinů je často spojena s negativní prognózou u nádorových onemocnění nebo s auto-imunitními poruchami. PIAS (protein inhibující aktivovaný STAT) – asociují s fosforylovanými STAT proteiny (pravděpodobně až v buněčném jádře) a brání přímo jejich vazbě s DNA nebo jako ko-represory blokují jimi zprostředkovanou transkripci. Inhibice je často spojena s degradací případně translokací STAT proteinů drahou podobnou ubiquitinaci. PIAS fungují jako SUMO (small ubiquitin-related modifier) ligáza. - PIAS1 (STAT1) - PIAS3 (STAT3) - PIASxa - PIASxb - PIASy (STAT1) Rakesh, 2005 Shuai & Liu 2005 a) schematická struktura jednotlivých proteinů PIAS Shuai & Liu 2005 The SAP domain (scaffold-attachment factor A (SAFA) and SAFB, apoptotic chromatin-condensation inducer in the nucleus (ACINUS) and PIAS domain), which contains a conserved LXXLL amino-acid motif (where X denotes any amino acid); the PINIT amino-acid motif, which is present in all PIAS proteins except PIASyE6–; the RLD (RING-finger-like zinc-binding domain); the AD (highly acidic domain), which contains a SUMO1 (small ubiquitin-like modifier 1)-interaction motif (red) that is found in all PIAS proteins except PIASy and PIASyE6–; and the S/T region (serine- and threonine-rich region), which is also not present in PIASy and PIASyE6– b) některé ze signálních drah interagujících s proteiny PIAS Shuai & Liu 2005 Sumarizace regulace transdukce signálů gp130 cytokinů Ernst 2004 Terapie s využitím znalostí signální transdukce gp130 cytokinů a) Modulace reakcí imunitního systému, zejména útlum průběhu zánětu - antagonisté receptorů, inhibitory JAK a STAT aktivity b) Potlačení nádorových onemocnění - aplikace cytokinů a agonistů receptorů (leukémie), inhibitory JAK a STAT aktivity c) Potlačení neurodegenerativních onemocnění - aplikace zejména CNTF a jeho derivátů (ligand-receptor) d) Podpora hematopoézy - aplikace cytokinů e) Potenciálně zvýšení úspěšnosti IVF Vysoká promiskuita mezi receptory a cytokiny (zejména při vyšších dávkách), která často vede k nežádoucím vedlejším účinkům (kachexie, zánět, vyšší citlivost k infekcím) je řešena vytvářením solubilních komplexů ligand-receptor. Literatura ke studiu: 1. Akira, S. 1999. Functional Roles of STAT Family Proteins: Lessons from Knockout Mice. Stem Cells 17:138-146. 2. Auernhammer, C. J., and S. Melmed. 2000. Leukemia-Inhibitory Factor-Neuroimmune Modulator of Endocrine Function. Endocrine Reviews 21:313-345. 3. Ernst, M., and Jenkins, B.J. 2004. Acquiring signalling specificity from the cytokine receptor gp130. TRENDS in Genetics. 20: 23-32. 4. Heinrich, P. C., I. Behrmann, S. Haan, H. M. Hermanns, G. Muller-Newen, and F. Schaper. 2003. Principles of interleukin (IL)-6-type cytokine signalling and its regulation. Biochem. J. 374:1-20. 5. Igaz, P., S. Toth, and A. Falus. 2001. Biological and clinical significance of the JAK-STAT pathway; lessons from knockout mice. Inflamm. res. 50:435-441. 6. Liu, K. D., S. L. Gaffen, and M. A. Goldsmith. 1998. JAK/STAT signaling by cytokine receptors. Current Opinion in Immunology 10:271-278. 7. Metcalf, D. 2003. The Unsolved Enigmas of Leukemia Inhibitory Factor. Stem Cells 21:5- 14. 8. Murphy, M., R. Dutton, S. Koblar, S. Cheema, and P. Bartlett. 1997. Cytokines which signal through the LIF receptor and their actions in the nervous system. Progress in Neurobiology 52:355-378. 9. Rose-John, S. 2002. GP130 stimulation and the maintenance of stem cells. TRENDS in Biotechnology 20:417-419. 10. Taga, T. 1997. The signal transducer gp130 is shared by interleukin-6 family of haematopoietic and neurotrophic cytokines. Ann Med 29:63-72.