MIKROSKOPICKÉ HOUBY – CVIČENÍ II. 1. Izolace kvasinek – stanovení počtu živých buněk v 1 g vzorku - kapkovou metodou Materiál: pekařské droždí (čerstvé nebo sušené) Pomůcky: sterilní fyziologický roztok, špičky, automatické pipety, kultivační médium (GYPA – Glukose-Pepton Yeast Extract) Pracovní postup: 1. Připravíme výchozí suspenzi pekařského droždí ve fyziologického roztoku (desetinásobné ředění). Homogenizujeme na magnetickém míchadle 3 minuty. Poté se necháme roztok 30 minut stát a opět promícháme 2 minuty na míchadle. 2. Pomocí pipety z výchozí suspenze (10^-1) přeneseme 1 ml do 9 ml fyziologického roztoku. Dobře promícháme! Tento postup opakujeme až k dosažení ředění 10^-8 (obr. 1). 3. Z ředění 10^-3 až 10^-8 vykápneme pomocí pipety 20 µl na povrch média (obr. 1). 4. Kultivujeme při teplotě 30 ºC po dobu 2 dnů. 5. Spočítání kolonií na Petriho misce. 6. Výpočet hodnoty CFU (Colony forming unit) v 1 g vzorku. 2. Izolace kvasinek – stanovení počtu živých buněk v 1 g vzorku - metodou roztěrem Pracovní postup: 1. viz. kapková metoda 2. viz. kapková metoda 3. Z ředění 10^-6,^ 10^-7 a 10^-8 vykápneme pomocí pipety 100 µl na povrch pevného média (obr. 2) a L-kličkou rozetřeme rovnoměrně po celém povrchu pevného média. 4. - 6. viz. kapková metoda 2. Izolace kvasinek stěrem z dutiny ústní Materiál: stěr z dutiny ústní Pomůcky: sterilní vatový tampon, tekuté médium (GPYA - Glucose Peptone Yeast Extract Agar), termostat na 30 °C Pracovní postup: 1. Sterilním vatovým tamponem provedeme krouživým pohybem stěry z dutiny ústní. 2. Malíkem pravé ruky otevřeme zkumavku, vsuneme dovnitř vatový tampón a vymyjeme v tekutém médiu (v případě šikmého agaru tampón vymyjeme v kondenzované vodě na dně zkumavky a tampónem "kreslíme" hádka odspodu nahoru na plochu média). 3. Kultivujeme ve tmě, při teplotě 30 °C po dobu 24 - 48 hodin. 4. V případě zákalu v tekutém médiu zhotovíme preparát barvený podle Grama (úloha č.3). 3. Izolace mikroskopických hub stěrem z prostředí Materiál: stěr z prostředí (např. okenní rám, žaluzie, odpadkový koš, klávesnice počítače, aj.) Pomůcky: sterilní vatový tampon, Petriho miska s MEA (agar s kvasničním extraktem) + chloramfenikol, termostat na 25 °C Pracovní postup: 1. Sterilní vatový tampón zvlhčíme přetřením povrchu agaru. 2. Sterilním vatovým tampónem přetřeme odběrové místo. 3. Sterilním vatovým tampónem přetřeme celou plochu Petriho misky s MEA. 4. Kultivujeme 7 dnů při teplotě 25 °C. 4. Příprava čisté kultury Materiál: Petriho misky z izolací Pomůcky: preparační jehla, Petriho miska s MEA, termostat na 25 °C Pracovní postup: 7. Preparační jehlou přeneseme část mycelia do středu nové Petriho misky s MEA. 8. Kultivujeme 7 dnů při teplotě 25 °C. Obr. 1 Stanovení počtu živých buněk v 1 g vzorku - METODA KAPKOVÁ 1 g 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 0^-1 1 0^-2 1 0^-3 1 0^-4 1 0^-5 1 0^-6 1 0^-7 1 0^-8 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 20µl 20µl 20µl 20µl 20µl 20µl Obr. 2 Stanovení počtu živých buněk v 1 g vzorku - METODA ROZTĚREM 1 g 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 0^-1 1 0^-2 1 0^-3 1 0^-4 1 0^-5 1 0^-6 1 0^-7 1 0^-8 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 100 µl 100 µl 100 µl