MIKROSKOPICKÉ HOUBY – CVIČENÍ III. 1. Preparát barvený podle Grama V mykologii umožňuje podrobné pozorování mykotických organizmů při velkých zvětšeních a odlišení bakteriální kontaminace. Materiál: kultura kvasinky Pomůcky: podložní skla, kahan, sterilní dest. voda, barvící roztoky, očkovací klička Pracovní postup: 1. Na podložní sklo naneseme kapku sterilní destilované vody. 2. Sterilní kličkou nabereme kulturu a rozmícháme v kapce vody. 3. Preparát usušíme na vzduchu a fixujeme teplem, opakovaným protažením plamenem kahanu. 4. Fixovaný preparát přelijeme krystalovou violetí a necháme působit 30s. 5. Opláchneme vodou (zbytek vody důkladně setřepat). 6. Převrstvíme Lugolovým roztokem na 30s. 7. Opláchneme vodou (zbytek vody důkladně setřepat). 8. Odbarvujeme 95% etanolem, dokud odchází modrá barva (cca 20 – 30s). 9. Opláchneme vodou (zbytek vody důkladně setřepat). 10. Dobarvíme zředěným roztokem safraninu nebo karbolfuchsinu 60s. 11. Opláchneme vodou (zbytek vody důkladně setřepat) a necháme preparát uschnout. 12. Preparát prohlížíme imerzním objektivem při zvětšení 1000x a více. 2. Nativní preparát: Princip: mikroskopické morfologické znaky vláknitých hub sledujeme v nativním preparátu. Protože se však jejich vlákna špatně smáčejí a v preparátu často bývají vzduchové bubliny, je lépe použít místo vody 10 až 20% vodný roztok glycerolu, který nevysychá tak rychle. Místo glycerolu lze použít i roztok laktofenolu nebo kyselinu mléčnou. Materiál: kultury vláknitých hub Pomůcky: podložní a krycí sklo, preparační jehla, kyselina mléčná Pracovní postup: 1. Na podložní sklo naneseme kapku kyseliny mléčné. 2. Sterilní preparační jehlou přeneseme z kolonie mikromycety malé množství mycelia s fruktifikačními orgány do kapky kyseliny mléčné (nejlépe dvěma preparačními jehlami). U kultur silně sporulujících odebíráme mycelium na rozhraní mezi zbarvenou částí kolonie a bílým okrajem, aby v preparátu nebylo příliš mnoho konidií. Mycelium neroztíráme, abychom nepoškodili fruktifikační orgány – pouze jehlami uvolníme jednotlivá vlákna do kapaliny. 3. Opatrně přikryjeme krycím sklem (nepřitiskujeme!) a přebytečnou kapalinu odsajeme ze strany filtračním papírem. 4. Preparát bez další úpravy prohlížíme suchým objektivem, nejprve slabým zvětšením (objektiv 10x), postupně pak silnějším zvětšením (objektiv 40x a 100x) Sledujeme: · charakter mycelia (šířku vláken, barvu a strukturu mycelia, přepážky (septa) – přítomnost a rozložení, způsob větvení) · charakter, způsob tvoření (konidiogeneze) a uspořádání fruktifikačních orgánů (např. sporangiofory, konidiofory, sporangia, kolumela, fialidy, konidie, zygospory, askospory aj.) · přítomnost a charakter jiných útvarů (chlamydospory). 3. Identifikace vláknitých hub řádu Mucorales Hodnocení: I. znaky makroskopické, které určíme z charakteru růstu II. znaky mikroskopické, které zjistíme pomocí nativního preparátů Výsledky : popíšeme veškeré mikroskopické znaky mikromycety. Současně popíšeme i makroskopické morfologické znaky (zápis provedeme do přiloženého identifikačního protokolu) Závěr: provedeme identifikaci do rodu Charakteristické znaky řádu Mucorales Zástupci tohoto řádu vytváří řídce vatovité nebo plstnaté vzdušné mycelium velmi rychle rostoucí. Stélku těchto hub tvoří převážně mnohojaderné mycelium bez přehrádek a proto je zvláště u mladého mycelia dobře pozorovatelné proudění plazmy. Přepážky se vyskytují pravidelně pod rozmnožovacími orgány a ve stáří nepravidelně v průběhu mycelia. Pro rozlišení rodů a druhů řádu Mucorales se používají především znaky nepohlavního rozmnožování, které se uskutečňuje sporangiosporami vznikajícími ve sporangiích vyrůstajících na zvláštních vláknech – sporangioforech. Mucor - sporangiofory jsou ukončeny sporangii bez apofýzy, s kolumelou kulovitou, oválnou nebo hruškovitou. Rhizopus – sporangiofory se tvoří obvykle ve svazcích a nebývají větvené. Vznikají na výhoncích (stolonech), které tvoří velmi často na pevném podkladu rozvětvené, tmavě hnědé rhizoidy. Kolumela má vyvinutou apofýzu. Po prasknutí sporangiální stěny se kolumela s apofýzou kloboukovitě obrací. Rhizomucor - sporangiofory bývají větvené. Přítomny stolony a hnědé rhizoidy. Absidia – sporangiofory vyrůstají ve svazcích na výhoncích s rhizoidy. Kolumela kuželovitá, často má na vrcholu papilu nebo ostřejší výčnělek. Sporangiofor přechází do sporangia širokou apofýzou. Rhizopus oryzae CCM 8284 Fungi, Zygomycota, Mucoromycotina, Mucorales, Mucoraceae, Rhizopus Record #3583 a. nevětvené sporangiofory s rhizoidy b. kolumela s apofýzou c. sporangiospory d. chlamydospory e. rhizoidy Zygorhynchus moelleri CCM 8022 - zygospory Fungi, Zygomycota, Mucoromycotina, Mucorales, Mucoraceae, Zygorhynchus Record #8807 Absidia coerulea CCM 8230 Fungi, Zygomycota, Mucoromycotina, Mucorales, Mucoraceae, Absidia Record #3546 a. větvené sporangiofory s rhizoidy b. kolumela s apofýzou c. sporangiospory Mucor plumbeus CCM F-443 Fungi, Zygomycota, Mucoromycotina, Mucorales, Mucoraceae, Mucor a. větvené sporangiofory b. kolumely hruškovité, obvejčité s uťatou bazí nebo válcovitě elipsovité, s patrným límečkem na bazi, často s několika výběžky na vrcholu c. sporangiospory Record #6465 Rhizomucor miehei CCM F-703 Fungi, Zygomycota, Mucoromycotina, Mucorales, Mucoraceae, Rhizomucor a. sympodiálně větvené sporangiofory b. sporangiospory c. zygospora Record #3572