Mikroskopické houby – cvičení (Bi6620c) Identifikace – rod Aspergillus MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮ http://www.sci.muni.cz/ccm http://www.pfdb.net/photo/mirhendi_h/box020909/standard/a_fumigatus_s.jpg Aspergillus • * zástupci rodu Aspergillus - popsáno přes 200 druhů, kolem 40 druhů popsáno jako původci mykotických infekcí u člověka * ubikvitní saprofyté celosvětově rozšířeni, jsou přítomny v půdě, ve vzduchu, v rostlinných i živočišných zbytcích * častý kontaminant potravin a krmiv * Aspergilózy - postižení respiračního systému má 3 základní formy: alergickou plicní aspergilózu, plicní aspergilom, invazivní aspergilózu (IA) * původci povrchových infekcích – onychomykózy, otomykózy * producenti mykotoxinů (aflatoxin) poškozujících ledviny a játra, zdrojem jsou zejména arašídy, oříšky kešu, pistácie a sušené plody * Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Aspergillus nidulans • • ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮ http://www.sci.muni.cz/ccm Aspergillus • •Identifikace druhů rodu Aspergillus •polyfázická taxonomie: * morfologie * sledování produkce sekundárních metabolitů * molekulární genetika •Identifikace do rodu a druhu – části genu pro rRNA (18S, 5,8S a 28S) nebo sekvence mezerníků (ITS) •Vnitrodruhová typizace aspergilů * PCR-RFLP s následnou sekvenční analýzou genu pro ß-tublin či genu rodlet A - pro rozlišení druhů fenotypicky podobných A. fumigatus * Multilokusová sekvenční typizace (MLST) – sekvenování fragmentů „referenčních“ genů • * * ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮ http://www.sci.muni.cz/ccm http://www.prolekare.cz/pdf?ida=vl_07_13_01.pdf#page=25&zoom=auto,-265,41 • • • ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮ http://www.sci.muni.cz/ccm Aspergillus - morfologie Makroskopické znaky * rychle rostoucí, plně vybarvené kolonie do pěti dnů * kolonie bohatě pigmentované (v odstínech žluté, žlutozelené, zelené, zelenomodré, hnědé a černošedé) * pigmentace je výrazná na Czapek-Doxově agaru (CZ) * kolonie se hodnotí na standardních živných médiích: Czapkův agar s kvasničným extraktem (CYA), agar se sladovým extraktem (MEA), CZ při standardní kultivační teplotě: 25°C, 37°C Makroskopické znaky: * rychlost růstu * zbarvení kolonií, spodní strany kolonií * povrchová struktura kolonií * velikost kolonií po 7, 10, 14 dnech * vzhled konidiální hlavice pod binokulární lupou http://samatoros.blogspot.cz/2008/03/plsn-aneb-co-mi-to-proboha-vyrostlo-na.html http://1.bp.blogspot.com/_NJTONQLQR7A/R-bK6Nbg68I/AAAAAAAAAC4/pOhJEVQUUpw/s320/Aspergillus+niger+CC F+1610+CYA+5-25.jpg • • • • • ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮ http://www.sci.muni.cz/ccm Makroskopické znaky https://botany.natur.cuni.cz/sites/default/files/atlas-mikroskop-saprofytnich-hub/3.03_eurotiales-a spergillus.pdf Aspergillus • • • ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮ http://www.sci.muni.cz/ccm Mikroskopické znaky Nepohlavní stádium * konidiofor vyrůstá přímo ze substrátu nebo ze vzdušných hyf * měchýřek (kolumelu) * fialidy (konidiogenní buňky) v jedné nebo ve dvou řadách nad sebou (uniseriátní a biseriátní) * konidiální hlavice - měchýřek s fialidami a řetězci konidií * tlustostěnné buňky zvané „Hülle cells“ se vytvářejí na konci vláken nebo interkalárně Aspergillus • • • ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮ http://www.sci.muni.cz/ccm Mikroskopické znaky Aspergillus • • • ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮ http://www.sci.muni.cz/ccm Mikroskopické znaky Aspergillus Aspergillus - konidiogeneze •ENTEROBLASTICKÁ PHIALIDICKÁ KONIDIOGENEZE * konidiogenní buňka - fialida • ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮ http://www.sci.muni.cz/ccm phial.GIF (28061 bytes) • • • ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮ http://www.sci.muni.cz/ccm Mikroskopické znaky Pohlavní stádium * tvorba drobných plodnic (menších než 1 mm) typu kleistothecium * tyto druhy se řadí do rodu Eurotium, Emericella, Neosartorya * wpe96C.jpg (80960 bytes) wpe96D.jpg (51945 bytes) http://www.uoguelph.ca/~gbarron/Misc2009/eurotial.htm Aspergillus •Plodnice (askokarpy, askomata) – askohymeniální typ * nejdříve dojde k pohlavnímu procesu (gametangiogamie, deuterogamie nebo somatogamie) a spolu s růstem askogenních hyf se vytvářejí i stěny plodnice * tímto způsobem vznikají plodnice typu kleistothecium, apothecium a perithecium •Kleistothecium * uzavřená plodnice s vytvořenou stěnou, otvírá se rozpadem; vřecka nejsou nijak uspořádána • ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮ http://www.sci.muni.cz/ccm vřecka http://ziva.avcr.cz/2012-5/houby-v-nasich-domacnostech-aneb-o-cem-doma-vite-i-nevite.html http://ziva.avcr.cz/img/ziva/art2/lrg/houby-v-nasich-domacnostech-aneb-o-cem-doma-vite-i-5.jpg Aspergillus • • • ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮ http://www.sci.muni.cz/ccm Aspergillus fumigatus * kontaminant potravin, oportunní patogen člověka a jiných živočichů * častý ve vlhkém teplém prostředí (kompost, ale i zvlhčovací systémy, obytné prostory) * zodpovědný za 90% všech případů IA * termotolerantní - roste i při 55°C * adaptace na nedostatek kyslíku je podmínkou pro jeho přežití v zánětlivé tkáni a umožňuje šíření do jiných orgánů * produkuje mykotoxiny gliotoxin, verruculogen, fumitremorginy aj. * dvě podskupiny – ve vzduchu a ve vodě * druhy fenotypicky podobné: A. lentulus, A. viridinutans, Neosartorya fischeri, N. pseudofischeri, N. undagawae * diagnostcký znak: A. fumigatus roste při teplotě 50°C a neroste při 10°C, kdy ostatní zaměnitelné druhy rostou (výjimkou je A. viridinutans) * * * Aspergillus • • • ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮ http://www.sci.muni.cz/ccm Aspergillus fumigatus * kolonie rychle rostoucí při 25 i 37°C, zelené, sametové https://botany.natur.cuni.cz/sites/default/files/atlas-mikroskop-saprofytnich-hub/3.03_eurotiales-a spergillus.pdf Foto.: A. Kubátová Aspergillus • • • ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮ http://www.sci.muni.cz/ccm Aspergillus fumigatus * konidiofory uniseriátní s široce kyjovitým měchýřkem * konidiální hlavice typicky sloupcovité * konidie kulovité nebo téměř kulovité, zelené, bradavčité, 2,5-3 μm v průměru https://botany.natur.cuni.cz/sites/default/files/atlas-mikroskop-saprofytnich-hub/3.03_eurotiales-a spergillus.pdf Foto.: A. Kubátová Record #3660 http://www.mycobank.org/BioloMICS.aspx?Link=T&TargetKey=14682616000002126&Rec=3660 Aspergillus • • • ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮ http://www.sci.muni.cz/ccm Aspergillus flavus * kolonie rychle rostoucí, žlutozelené, roste i při teplotě až 48 °C * výskyt v půdě, na potravinách (arašídy, koření, obiloviny apod.) * produkuje mykotoxin aflatoxin B1, 3-nitropropionovou kyselinu, kojovou, aspergilovou a cyklopiazonovou kyselinu * z 10% původce bronchopulmonárních infekcí https://botany.natur.cuni.cz/sites/default/files/atlas-mikroskop-saprofytnich-hub/3.04_eurotiales-a sp_sekce_flavi.pdf Foto.: A. Kubátová Aspergillus • • • ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮ http://www.sci.muni.cz/ccm Aspergillus flavus * konidiofory biseriátní i uniseriátní, bradavičnaté s kulovitým nebo téměř kulovitým měchýřkem * konidiální hlavice paprsčité * konidie kulovité nebo téměř kulovité, bradavčité http://ziva.avcr.cz/2012-5/houby-v-nasich-domacnostech-aneb-o-cem-doma-vite-i-nevite.html Při kultivaci kropidláku Aspergillus flavus na agarových živných půdách vznikají charakteristické kolonie s množstvím nepohlavních spor (konidií) tvořených na konidioforech. Foto A. Kubátová Foto.: A. Kubátová Record #3658 http://www.mycobank.org/BioloMICS.aspx?Table=Mycobank&Rec=58206&Fields=All Foto.: J. Machač Aspergillus • • • ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮ http://www.sci.muni.cz/ccm Aspergillus niger * často nacházen v černém čaji (podílí se na jeho fermentaci), kontaminant potravin rostlinného tak i živočišného původu * produkuje naphtho-4-pyrony, malforminy a u několika kmenů byla zaznamenána produkce ochratoxinu A * z 5% původcem IA, otomykózy * optimální klíčivost konidií v acidofilním prostředí * teplotní optimu je 30°C * specifickým diagnostický znakem infekcí způsobených A. niger je přítomnost kalcium oxalátum ve formě krystalů v patologickém vzorku Aspergillus • • • ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮ http://www.sci.muni.cz/ccm Aspergillus niger * kolonie rychle rostoucí, černé, zrnité, často produkuje žlutý pigment do agaru https://botany.natur.cuni.cz/sites/default/files/atlas-mikroskop-saprofytnich-hub/3.03_eurotiales-a spergillus.pdf Foto.: A. Kubátová Aspergillus • • • ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮ http://www.sci.muni.cz/ccm Aspergillus niger * konidiofory biseriátní, hladké s kulovitým měchýřkem * konidiální hlavice paprsčité * konidie kulovité nebo téměř kulovité, černé, nepravidelně bradavčité, 3,5-5 μm v průměru https://botany.natur.cuni.cz/sites/default/files/atlas-mikroskop-saprofytnich-hub/3.03_eurotiales-a spergillus.pdf Foto.: A. Kubátová Record #3672 http://www.mycobank.org/BioloMICS.aspx?Table=Mycobank&Rec=2506&Fields=All Aspergillus • • • ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮ http://www.sci.muni.cz/ccm Aspergillus terreus * kolonie rychle rostoucí, okrové, sametové, roste i při 37 °C * výskyt na potravinách a v prostředí budov, bývá izolován i z půdy * původce IA se sklonem k diseminaci, sekundární kožní infekce https://botany.natur.cuni.cz/sites/default/files/atlas-mikroskop-saprofytnich-hub/3.03_eurotiales-a spergillus.pdf Foto.: A. Kubátová Aspergillus • • • ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮ http://www.sci.muni.cz/ccm Aspergillus terreus * konidiofory biseriátní, hladké s téměř kulovitým měchýřkem * konidiální hlavice sloupcovité * konidie kulovité až elipsoidní, hladké, malé, 1,5 - 2,5 μm v průměru * na substrátovém myceliu se tvoří kulovité buňky https://botany.natur.cuni.cz/sites/default/files/atlas-mikroskop-saprofytnich-hub/3.03_eurotiales-a spergillus.pdf Foto.: J. Machač Aspergillus • • • ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮ http://www.sci.muni.cz/ccm Aspergillus nidulans * kolonie rychle rostoucí při 25 i 37 °C, sametové, zelené * tvorba plodnic - Emericella nidulans * kontaminant potravin * produkuje mykotoxin sterigmatocystin aj. * vyskytuje se vzácně, virulentnější než A. fumigatus, vyšší rezistence k některým antimykotikům https://botany.natur.cuni.cz/sites/default/files/atlas-mikroskop-saprofytnich-hub/3.01_eurotiales-t eleomorfy.pdf Foto.: A. Kubátová Aspergillus • • • ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮ http://www.sci.muni.cz/ccm Aspergillus nidulans * plodnice kulovité, 100-300 μm v průměru, obalené vrstvou světle žlutých až béžových „hülle cells“ * vřecka kulovitá, s 8 askosporami, askospory červené, čočkovitě zploštělé, hladké, se 2 obvodovými hřebínky https://botany.natur.cuni.cz/sites/default/files/atlas-mikroskop-saprofytnich-hub/3.01_eurotiales-t eleomorfy.pdf Foto.: A. Kubátová Aspergillus • • • ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮ http://www.sci.muni.cz/ccm Aspergillus nidulans * konidiofory biseriátní, hladké, nahnědlé s kulovitým měchýřkem * konidie v řetízcích, kulovité, bradavčité https://botany.natur.cuni.cz/sites/default/files/atlas-mikroskop-saprofytnich-hub/3.01_eurotiales-t eleomorfy.pdf Foto.: A. Kubátová Aspergillus